文摘

客观的。分析salvianolic酸结合的临床观察三七皂苷结合基本护理干预对脑缺血再灌注损伤大鼠及其影响的表达apoptosis-related蛋白bcl - 2、Bax和caspase-3。方法。总共有72名男性Wistar鼠随机分为骗局,缺血/再灌注(I / R)、药物不良反应(Eda), salvianolic酸(SA)、三七皂苷(pn),和SA + pn组。政府5天之后,神经功能、脑梗死体积,脑指数,观察到的老鼠和脑含水量。酶联免疫试剂盒测定应用于测量il - 1的水平β、il - 6、引发、TNF -α、MDA、SOD、氧化酶和T-AOC活动。免疫印迹分析被用来检测蛋白质含量p-53, NF -κbcl - 2 B,伯灵顿,Caspase-3梗死周围脑组织的损伤。结果。与虚假的集团相比,mns得分,脑指数、脑含水量、梗死体积,MDA活动,和il - 6的水平,引发,TNF -α和il - 1β以及p-53的蛋白质含量,NF -κB,伯灵顿和Caspase-3显著增加,而bcl - 2蛋白的含量,SOD、氧化酶和T-AOC I / R组明显减少。然而,这些水平逆转SA组,pn组和SA + pn组。此外,这些变化在SA + pn组更明显比SA和pn组,差异具有统计学意义。结论。SA pn和他们结合基本护理对脑I / R损伤有保护作用,并结合基本护理效果优于单独使用。机制可能是调节下游凋亡蛋白的表达通过抑制TLR4 / NF -κB信号通路,从而减少大鼠的神经损伤。

1。介绍

脑梗塞,也被称为脑缺血性中风,是一种常见的神经系统疾病,导致大脑血液供应的阻塞或堵塞,导致氧气和养分缺乏,不可逆损害当地的脑组织,导致脑组织缺血和缺氧坏死(1]。脑缺血再灌注(I / R)损伤是指恢复血液供应脑缺血后一段时间。尽管缺血器官和组织可以与氧气供应,恢复缺血组织损伤和功能障碍更严重,表现为血流动力学的变化,扩大脑组织梗死大小、神经细胞自噬和细胞凋亡异常,等等。2]。I / R的特征是高发病率、高伤残率、死亡率高,治愈率低,严重影响患者的健康和生命3]。临床上,及时恢复大脑血液供应和神经细胞死亡的救援的关键是脑梗死的治疗。最近的研究(4)已经证实,许多临床药物对脑I / R损伤有保护作用,主要反映在自由基清除,减少细胞内钙超载,抑制细胞凋亡,减轻或预防炎症反应等。临床研究发现5),与西药相比,中药(TCM)具有显著的疗效和减少不良反应的预防和治疗缺血性脑血管疾病,有广阔的应用前景。中医认为[6],中风和血瘀是常见的脑血管疾病的病理因素。丹参的主要化学成分包括水溶性酚酸,如salvianolic酸B, danshensu rosinic酸,脂溶性二萜、如tanshinone cryptotanshinone。三七的主要活性成分是通过对三七总皂苷,可以改善脑缺血和缺血再灌注造成的损伤,促进神经功能的恢复,减少心肌的耗氧量,改善心肌的血液供应7,8]。临床、丹参和三七药物,常用的是一双香相得益彰,广泛用于治疗心血管和脑血管疾病(9]。研究发现(10]salvianolic酸和三七皂苷能降低脑I / R损伤减少小脑梗塞的体积,减轻氧化应激损伤,减少炎症反应。研究发现(11),细胞凋亡是一种脑I / R损伤的重要机制。细胞凋亡参与了许多疾病的病理过程密切相关脑I / R损伤的病理机制。其中,pro-apoptotic蛋白质伯灵顿和抗凋亡蛋白bcl - 2是动态的在活的有机体内并参与细胞凋亡的规定在一起(12]。半胱天冬酶家族的重要成员,Caspase-3介导细胞凋亡蛋白酶级联,是各种常见的下游效应的一部分细胞凋亡通路(13]。在这项研究中,我们调查的神经保护效应salvianolic酸结合三七皂苷在脑I / R损伤的老鼠和bcl - 2细胞凋亡相关蛋白的影响,巴克斯和caspase-3。

2。材料和方法

2.1。药品和试剂

SA是购自天津助教Zhijiao药业有限公司有限公司(批准文号:国家医学Zhunzi Z20110011);pn从云南购买东风日产天籁药业有限公司有限公司(批准文号:Z53020178);Eda是购自国药控股集团Guorui制药有限公司有限公司(规范20毫升/ 30毫克,批准文号:国家药品标准H20080056);SOD, MDA,氧化酶、T-AOC检测试剂盒购自上海恒远生物技术有限公司有限公司;水合氯醛购买从武汉华翔Kejie生物技术有限公司有限公司;Hydroethanol没有从成都购买化学试剂厂;氯化氮phenyltetrazolium (TTC)购买来自湖北Bojie生物技术有限公司有限公司;肿瘤坏死因子-α、il - 6、引发、il - 1β包购买从武汉华美生物工程有限公司有限公司;bcl - 2、Bax、Caspase-3 NF -κp53和NF - BκB p53主要抗体。辣根过氧化物酶等二次抗体(合)山羊anti-rabbit免疫球蛋白和合山羊anti-mouse免疫球蛋白是从美国热公司购买的。

2.2。实验动物

72 SPF-grade健康雄性Wistar鼠体重(270±20)g,是由北京Weitong利华国际实验动物科技有限公司有限公司(动物许可证号码:SCXK(北京),2020 - 0016年)。在单独的笼子里,他们提出一个繁殖的温度20 - 25°C和50% - -65%的相对湿度。动物实验动物保健和使用委员会批准Yantaishan医院(批准号201906035)。实验大鼠被允许自由吃喝,餐具和垃圾每天都改变了。

2.3。主要仪器

微型板块的读者购买山东锦生物产业有限公司有限公司冰箱从济南Alabao购买仪器设备有限公司,有限公司,恒温水浴是购自浙江海宁医疗设备工厂,高速冷冻离心机从德国购买σ,荧光定量PCR仪器从济南炼金术购买仪器有限公司,有限公司,电子天平是从郑州Pushton购买电子设备有限公司,有限公司,低温离心机(3-5w类型)购买来自江苏华大离心机制造有限公司有限公司,正直的金相显微镜(SG-51类型)购买从上海光学仪器工厂,蛋白质电泳和转移膜仪器从Bio-Rad购买,美国。

2.4。组织和管理

72 Wistar鼠被分成6组随机数的方法,即虚假的集团,I / R组,Eda, SA组,pn组,和SA + pn组,每组12例。他们是由尾静脉注射,Eda, SA组和pn组有6毫克/公斤,21个毫克/公斤和100毫克/公斤连续5天每天一次,分别。虚假的组和I / R组被给予相同体积的生理盐水。所有的老鼠都一致的基本的护理。老鼠一般的术中体温维持在(37±0.5)°C,室温保持在24°C∼26°C。

2.5。制备大鼠的脑缺血/再灌注损伤模型

大脑中动脉阻塞/再灌注模型(MCAO / R)成立的缝合方法。老鼠被吸入异氟烷的麻醉后,脑血流量是由激光多普勒流量计监控,颈总动脉(CCA),颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)直言不讳地分开的中心的脖子。ECA的螺纹塞是插入通过CCA ICA分支阻断大脑中动脉的血液供应。栓塞后1.5小时,螺纹塞拔出,再灌注。虚假的操作组,只暴露颈部血管,缝合插头没有治疗。

2.6。观察指标和评价方法

(1)神经赤字得分:5天再灌注后,老鼠评估神经赤字根据Zea-longa 5分(14]。具体评分规则包括自发活动,前肢运动,攀岩能力,躯体感觉,胡子刺激,平衡梁实验,统计数据。(2)测定脑梗死体积:神经功能评分后,每组大鼠麻醉下斩首删除嗅球,小脑、脑干然后放在冰箱在-20°C 30分钟。大脑切成2毫米厚日冕部分,并将在2% TTC磷酸盐缓冲溶液为30分钟37°C和10%的甲醛溶液在黑暗中2 h。正常脑组织是红色,脑梗塞是白色的。计算机图像分析程序是用来扫描所有大脑切片图像的面积来确定脑梗死面积。梗死体积的比率(15](梗塞面积的总和所有大脑切片×大脑切片的厚度)和脑梗死体积(梗塞体积/全脑体积×100%)计算。(3)测定大脑指数和含水量:5天再灌注后,老鼠麻醉和斩首,大脑被称重。大脑指数=湿重(g) /体重(100克)、脑含水量(%)=(湿脑重量(g)大脑干细胞重量(g)] /湿大脑重量(g)×100%16]。(4)压力测定指标:10%的脑组织被和均质溶解产物在4°C预冷,然后离心3 000 r / min 15分钟。上层的拍摄和MDA含量和t-AOC, SOD和氧化酶活动确定按设备操作规程。(5)测定脑组织炎症因素:10%的脑组织被和均质溶解产物在4°C预冷,然后离心机在3 000 r / min 15分钟。上层的拍摄和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)和interleukin-8(引发)设备检测到的指令。(5)免疫印迹方法检测蛋白表达水平:大脑组织取出,然后用胰蛋白酶消化。总蛋白提取,然后进行电泳。转移到膜后,蛋白质被封锁和孵化主要抗体(bcl - 2、Bax、Caspase-3 NF -κB)一夜之间,其次是二次抗体2 h。吸光度分析计算表达式的每个蛋白质相对于内部参考β肌动蛋白。

2.7。统计分析

SPSS 20.0统计软件(美国纽约IBM)是用于数据的统计分析。测量数据被表示为(x±s)的三个独立的实验,和数据对比组是由t测试。不同之处在于具有统计学意义,p < 0.05。

3所示。结果

3.1。对大鼠的神经功能缺损评分的影响

与虚假的组相比,mns得分的I / R组明显高于神经赤字严重,差异具有统计学意义(^∗p < 0.01)。与I / R组相比,SA的mns分数组、pn组和SA + pn组显著减少(^∗∗p < 0.01), SA的mns得分+ pn组明显低于SA组和pn组,差异具有统计学意义(^#p < 0.01)。没有统计上的显著差异mns分数之间的Eda组和SA + pn组(p > 0.05),如图所示1。

3.2。对脑梗死体积的影响和表达p-53 NF-κB周围脑组织梗死专注的老鼠

与假组相比,脑梗死体积和p-53和NF -的蛋白质含量κB在周围的脑组织梗死明显增加I / R组,差异具有统计学意义(^∗p < 0.01)。与I / R组相比,上述SA组明显减少,pn组和SA + pn组(^∗∗p < 0.01),脑梗死的体积和p-53 NF -κB水平SA + pn组明显低于SA组和pn组,差异具有统计学意义(^#p < 0.01)。没有统计上的显著差异在SA + pn组和Eda组(p > 0.05),如图2和表1。

3.3。对大脑的影响指数和老鼠的大脑含水量

与假组相比,老鼠的大脑指数和含水量I / R组显著增加(^∗p < 0.05)。此外,与I / R组相比,老鼠的大脑指数和含水量SA组,pn组和SA + pn组显著降低(^∗∗p < 0.05),老鼠的大脑指数和含水量SA + pn组显著低于SA组和pn组。差异具有统计学意义(^△p < 0.05),如表所示2。

3.4。影响活动的MDA, SOD,氧化酶,T-AOC老鼠的脑组织

与假组相比,老鼠的脑组织中MDA的含量在I / R组明显增加,SOD的含量,氧化酶和T-AOC明显减少,差异具有统计学意义(^∗p < 0.01)。与I / R组相比,MDA含量显著降低,而SOD、氧化酶和T-AOC内容在SA显著增加,pn和SA + pn组(^∗∗此外,p < 0.05), MDA, SOD,氧化酶和T-AOC内容在SA + pn组更明显比SA和pn组,差异具有统计学意义(^#p < 0.05),如图3。

3.5。影响il - 6的表达,引发,TNF -α,il - 1β在老鼠大脑组织

与假组相比,il - 6的表达,引发,TNF -α和il - 1β脑组织的I / R组显著增加(^∗p < 0.01)。与I / R组相比,il - 6的表达,引发,TNF -α,il - 1β老鼠的脑组织在SA, pn和SA + pn组显著减少(^∗∗p < 0.01),而这些水平SA + pn组下降更重要比SA和pn组(^#p < 0.01),如图4。

3.6。bcl - 2水平的影响,伯灵顿,Caspase-3老鼠

与虚假的集团相比,bcl - 2在I / R组的水平明显下降,而伯灵顿和Caspase-3水平显著增加(^∗p < 0.01)。与I / R组相比,bcl - 2的水平显著增加,而伯灵顿和Caspase-3水平显著降低脑组织的SA pn和SA + pn组(^∗∗p < 0.05)。此外,这些水平SA + pn组变化更重要比SA和pn组(^#p < 0.01),如图5。

4所示。讨论

脑I / R损伤是一种神经系统疾病,提供及时的血液供应支持组织和器官的血液供应是不够的。最后,一系列复杂的结构损伤和功能障碍出现由于多种机制之间的相互作用和多个链接。凋亡坏死是脑缺血再灌注损伤的重要链接(17]。这是一个严重威胁人类健康。大多数缺血性脑血管疾病患者需要护理,因为知识和肢体功能障碍等后遗症。越来越多的这类病人已成为一个非常重要的医学和社会问题。研究认为,(18)及时恢复血液供应减少脑缺血区和神经细胞损伤是治疗的关键脑I / R损伤。中药多组分的的优点,多目标,副作用小,疗效稳定,等等。,它吸引了越来越多的关注在脑缺血的治疗。缺血性脑血管病属于中医“中风病”的范畴。临床表现为混乱,头晕,半身不遂,弯曲的嘴巴和眼睛、口齿不清等症状。这种疾病的特点是肝和肾阴不足,气血不通不足和血瘀阻塞,因此治疗应基于滋养阴,促进血液循环,解决痰和疏浚担保物(19]。SA首次出现的“神农的药物学”,促进血液循环的影响和消除血瘀,而pn的力量促进血液循环,消除血瘀,主音和强大20.,21]。在实验过程中,老鼠密切监测生命体征,和异常变化及时处理。在围手术期处理,保温措施,防止身体伤害身体由于低体温。手术后护理也是非常重要的。有效的抗炎治疗的手术创伤对预防术后感染的积极意义。

脑缺血再灌注后的病人恢复血液供应,脑组织细胞受损,细胞破裂,细胞中的水溢出导致脑水含量增加,和神经功能的影响(22]。这项研究表明,与I / R组相比,神经损伤评分、脑指数在SA和脑含水量,pn和SA + pn组减少,和SA + pn组下降更为明显(p < 0.05),表明SA和pn结合基本护理能有效缓解脑I / R损伤,并能有效降低神经损伤,脑梗死体积,p-53水平,大脑指数和水分在梗塞面积在大鼠缺血灌注后,这意味着两者的结合处方对脑缺血有保护作用。MDA是一个终端产品的氧自由基引起的脂质过氧化反应,从而导致变性和细胞膜的损伤,减少细胞膜的流动性和通透性。MDA的含量间接反映了自由基(组织损伤的程度23]。SOD和氧化酶都在体内的抗氧化酶。SOD能有效清除体内超氧化物阴离子自由基,减少自由基损伤,血脑屏障修复,增加通透性,减少脑水肿(24]。氧化酶可以阻止脂质过氧化,减少氧自由基引起的细胞损伤,降低MDA水平,减少脑组织细胞膜损伤(25]。T-AOC的检测可以反映人体的抗过氧化能力损伤急性脑缺血和再灌注后,也可以用来评估脑组织过氧化损伤的程度(26]。现代药理研究表明,(27pn可以促进神经胶质细胞的修复,神经元和脑I / R后毛细血管通过增加体内SOD和氧化酶的活性,减少MDA的水平。这项研究发现,与I / R组相比,水平的SOD、GPX,和老鼠的T-AOC SA处理+ pn增加,和MDA的含量显著降低。这表明SA + pn能有效地抑制氧化应激。这可能是因为SA和pn含有多酚化合物。这些多酚化合物具有很强的抗氧化特性,有效缓解压力I / R老鼠的脑组织。氧化反应缓解I / R损伤的老鼠。NF -κB是广泛存在于真核细胞,可以调节各种免疫炎症介质的释放,改变肿瘤生长的微环境,调节肿瘤细胞增殖、细胞凋亡等过程(28]。研究显示[29日)的激活NF -κB信号通路还可以调节apoptosis-related蛋白bcl - 2的表达,伯灵顿,Caspase-3,诱导细胞凋亡。这项研究发现,与I / R组相比,NF -的表达κB,伯灵顿,Caspase-3脑组织的SA + pn组下降和bcl - 2蛋白表达增加。这表明SA + pn可以抑制NF -的表达κ抑制TLR4 / NF - BκB信号通路和影响apoptosis-related下游基因的表达,保护大鼠大脑神经细胞缺血后细胞凋亡,和缓解I / R损伤。研究表明,(30.,31日),SA酸和pn可以抑制TLR4 / NF -κB信号通路,这个研究基本上是一致的。有证据表明,(32)炎症反应介导脑I / R后继发性脑损伤。缺血后炎症反应是由许多炎症性因素,如肿瘤坏死因子-α、il - 6、引发和il - 1β,其中TNF -α在脑I / R损伤[尤为重要33- - - - - -35]。结果表明,SA + pn可以有效降低TNF的表达α、il - 6、引发和il - 1β脑I / R损伤后炎性因子,减轻再灌注后的脑组织的炎症反应。

总之,SA的组合加上pn结合基本护理有很大的脑组织的保护作用有脑I / R损伤的老鼠。它可以显著降低大鼠的脑梗死体积与脑I / R损伤,改善脑水肿,增强SOD的抗氧化活性,氧化酶,MDA和T-AOC,减少脂质过氧化损伤和抑制I / R老鼠大脑细胞的凋亡和减轻脑I / R损伤通过抑制TLR4 / NF -κB信号。

数据可用性

数据来支持本研究的发现可以以合理的要求相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。