文摘

为了分析咽部细菌的分布特征在慢性咽炎患者(CP) 16 srdna-based探测技术,采集咽分泌物样本进行的一项前瞻性研究是来自患者诊断CP的耳鼻喉科学部门承认深圳第三人民医院从2021年5月到2021年9月。其中,11例慢性咽炎简单(CSP), 11例慢性肥厚性咽炎(CHP)和8例健康受试者。所有样品都检测到16 srdna技术和生物信息学分析。55724.64±1772.80,53697.73±2252.19,55177.5±1661.80优化序列是通过16 srdna序列。的α咽微生物群落多样性分析表明,咽微生物群落的丰度指数抽泣是调节CHP患者与正常对照组(NC)相比,但咽部细菌的多样性指数在三组没有明显变化,表明咽部细菌的丰度在共和人民党(CHP)组织增加。的β咽微生物群落多样性分析表明,结构和组成的三组是相似的,而且没有显著的统计学差异。咽部菌群的结构差异分析结合LEfSe差异分析表明,在门级,螺旋体属和Synergistetes共和人民党(CHP)的相对丰度组明显高于在CSP组。在属级,相对丰富的机会致病菌如月形单胞菌属和弯曲杆菌在CSP组显著增加。的相对丰度埃希氏杆菌属、支原体和Porphyromonas在共和人民党(CHP)组显著增加。有益的共生细菌的丰度显著降低CP患者。患者的咽炎CP的特点是增加大量的咽炎,咽炎的结构的变化,减少共生有益的细菌,和增加机会致病菌的内容,这可能是与CP的发生和发展密切相关。

1。介绍

慢性咽炎(CP)是一种常见的疾病耳鼻喉科学的特征是粘膜的慢性炎症,黏膜下层和淋巴细胞。根据咽部症状,慢性咽炎简单(CSP)和慢性肥厚性咽炎(CHP)临床病例可以分为两种类型。据统计,CP咽部疾病占10 - 20%和12 - 14%的耳鼻喉科学疾病,发病率逐年增加(1,2]。随着工业化的快速发展,慢性咽炎发病率远高于高PM2.5地区,在轻度污染区域(3]。CP特点是发病率高、治愈率低,这不仅降低了患者的生活质量,还增加了临床标准药物治疗上的困难,甚至导致滥用抗生素(4]。

CP是一种多因素疾病,包括慢性感染性因素,非感染性因素,物理和化学因素,刺激,职业因素和生活方式(5,6]。目前,微生物作为驱动因素参与慢性粘膜炎性疾病的发病机理已逐渐引起关注(7- - - - - -11]。一些学者确定CP的相对简单的细菌群落组成通过传统的细菌培养鉴定方法,和α许多菌株(溶血性链球菌排名第一12,13]。然而,识别结果很容易受不同的文化影响时间和生长环境需求。与传统文化技术相比,第二代测序(16 srdna探测技术)是一个更敏感的微生物检测方法,它可以显示咽中微生物的分布更全面。目前,otorhinolaryngology-related疾病,一个复杂的细菌谱如鼻窦炎(7,8],中耳炎[9,过敏性鼻炎(10,11第二代测序)已被确定。在这项研究中,咽炎细菌的多样性和差异在CP患者和健康受试者由16 srdna序列的方法,分析和探讨了细菌和CP的分布之间的关系,旨在为CP的临床治疗提供新思路。

2。临床协议

2.1。实验对象和分组

共有22名患者被诊断为CP谁访问了深圳第三人民医院耳鼻喉科学部门收集从2021年5月到2021年9月。其中有11个CSP 11 CHP,和8个健康志愿者。CP患者的主要症状包括咽异物感、咽干、咽痒、喉咙清算频繁,咳嗽、痰、咽痛,和其他咽部不适症状。

2.2。入选标准

入选标准定义如下:(1)它符合诊断标准的CSP和共和人民党在头颈外科的实践(第2版)(2)年龄≥18岁(3)知情同意并签署一份通知,自愿提供临床样本收集(4)没有明显的neoorganisms咽和喉下电子喉镜检查(5)发现没有明显的细菌形成一般在实验室细菌培养

2.3。排除标准

排除标准定义如下:(1)慢性上呼吸道的炎症:鼻炎,鼻窦炎,鼻咽炎;扁桃体炎、腺肥大(剩余)(2)邻近器官疾病和刺激:口腔疾病:龋齿、牙周炎;食管和胃的疾病:反流性食管炎,返流性胃炎;气管和肺部疾病:慢性支气管炎、慢性肺炎(3)过敏性疾病:过敏性鼻炎和过敏性咽炎(4)其他疾病引起的咽部不适症状如下:食道癌,茎突综合症,舌骨综合征,咽综合症,咽肺结核(5)化学或物理治疗,如抗生素、维生素、雾化,微波,激光,用于访问前两周

2.4。样品收集

在无菌更衣室,病人是张着嘴坐在他的头倾斜。取样器固定舌头与舌头溅,无菌植绒拭子反复擦拭后,侧咽壁三次。咽分泌物进行收集和发送到深圳华大基因研究院有限公司,有限公司,进行DNA提取、测序和分析。

3所示。咽微生物区系检测

3.1。16 srdna序列

V3-V4地区16 srdna基因放大的聚合酶链反应(PCR)与样本DNA作为模板。然后Agencourt AMPure XP使用磁珠纯化PCR产品和溶解在洗脱缓冲完成图书馆的建设。安捷伦2100生物分析仪是用于检测片段的浓度范围和图书馆。最后,使用Illumina公司HiSeq合格库测序平台根据插入片段的大小。

3.2。生物信息学分析

原始测序数据筛选获得高质量的清洁数据分析。读取将加入标签重叠阅读之间的关系,和标签的相似度在97%以上将分为操作分类单位与绿色煤电相比(辣子鸡)和数据库进行分类分析,和社区物种注释的门,类,顺序,每组家庭,属、种的样本。

统计分析和可视化的微生物群落组成和结构进行基于OTU和注释结果。Veen图是由R (V3.2.1)软件显示的数量共同和独特OTU在多个样本,可以直观地显示OTU样本之间的重叠。OTU积累曲线是策划反映了抽样个体对物种多样性的影响。画一个稀释曲线来确定适当的数量的样品测序。母亲(V.1.31.2)软件用于α多样性分析,它反映了物种的多样性,社区丰富,生态系统内的均匀度。社区丰富的指标主要包括Chao1指数,ACE指数,抽泣指数。群落多样性指数包括香农指数和辛普森指数。测试水平α= 0.05, 被认为是具有统计学意义。β多样性是用于分析的进化关系和丰富信息三组比较显著差异在微生物群落的组成。QIIME (V1.80)软件用于主坐标分析(PCoA)来显示不同的社区组成的三组样品。横坐标代表一个主成分,纵坐标代表另一个,比例代表样本的主成分的贡献价值的差异。如果样品相互接近,物种组成和结构更相似。样本相似度高的社区组成倾向于聚集在一起,而倾向于单独的样品与伟大的社会差异。R (V3.4.1)软件是用于分析不同β组织,和一盒图的β多样性指数。测试水平α= 0.05, 被认为是具有统计学意义。

R (V3.4.1)软件是用于分析不同的细菌群落结构的三组样本,并在门主要物种的丰度和属水平和分析块不同的细菌群落。知道等级和测试是用来分析多个组之间的差异,和Wilcoxon等级和测试是用来分析两组之间的差异。测试水平α= 0.05, 被认为是具有统计学意义。

LEfSe软件LDA用于计算并绘制图表来反映微生物群落有显著影响的三组样品。当LDA≥2.0,物种之间的显著差异。

使用SPSS 24.0软件处理数据。Shapiro-Wilk测试用于测试连续计数变量的正态分布。正态分布的数据表示为x±年代的多重比较T测试使用,使用卡方检验级数据。 显示统计上显著的差异。

4所示。实验结果

4.1。OTU分析咽部细菌

没有统计学差异数量的优化序列咽共和人民党(CHP)之间的样本,CSP,和正常的控制(NC)组,如表所示1。共有359个辣子鸡得到来自30个样本,其中包括265名辣子鸡。有25个辣子鸡的共和人民党(CHP)和数控组,24辣子鸡CHP和CSP, 8个辣子鸡CSP和NC组。有25个辣子鸡CHP 7 OTU CSP,和4辣子鸡NC组,分别如图1。物种累积曲线往往是平面随着样本容量的增加。咽部菌群的稀释曲线趋于平坦的测序深度的增加。这表明,测量数据的数量是合理的,基本上达到了测序深度,如图2。

4.2。α多样性分析

ACE的比较,曹国伟,抽泣CHP之间的索引,CSP和NC组统计学意义( )。CHP的抽泣指数和NC组统计学意义( )。没有统计学意义在香农和辛普森指数在三组,如图3。ACE (a)的指数,曹国伟(b),哭泣(c, d),香农(e),辛普森(f)咽微生物群落的比较三组在图所示3。 被认为是一个统计上的显著差异。

4.3。主坐标分析和β多样性分析

主坐标分析(PCoA)显示,30个样本的分布相对集中,且没有明显的分离趋势,表明植物的物种组成没有统计学意义,如图4(一)。通过β多样性分析的平均值和标准偏差β计算每组的多样性。箱线图显示,没有统计不同物种组成的三组,这是符合上述PCoA结果,如图4 (b)。

4.4。细菌群落结构差异的分析

在门级,咽部菌群由六门,包括拟杆菌、厚壁菌门,Fusobacteria,放线菌,TM7,变形菌门。其中,拟杆菌门和壁厚菌门显然是占主导地位,占总数的60%以上。比较三组样品之间的物种结构表明,螺旋体属和Synergistetes之间有差异,如图5(一个)。此外,之间没有显著改变门丰富共和人民党(CHP)组和CSP组与NC组相比,如图5 (c)。与共和人民党(CHP)组相比,大量的螺旋体属和Synergistetes CSP组减少,如图5(一个)。在属级,有17个属咽,普氏菌占主导地位的细菌,链球菌韦永氏球菌属,约占28%,17%,和10%,占55%的17个属。14属的相对丰度在三组有统计学意义。与NC组相比,大量的Porphyromonas CSP组减少,而丰富的弯曲杆菌月形单胞菌属是增加。丰富的Porphyromonas、支原体和埃希氏杆菌属增加了共和人民党(CHP)组。与CSP组相比,大量的Porphyromonas,支原体,埃希氏杆菌属增加了共和人民党(CHP)组。与CSP组相比,Desuliste Desulphurobacte,弯曲杆菌,无胆甾原体Olsenella Filifactor、TG5 Porphyromonas,支原体,埃希氏杆菌属,密螺旋体属,嗜血杆菌共和人民党(CHP)组,Johnsonell大量增加。与NC组相比,大量的共生有益的细菌放线菌减少共和人民党(CHP)和CSP组,如图5 (b)和图5 (d)。表2显示的比较咽部菌群的相对丰度在属的水平上。

4.5。LEfSe差异分析

LDA分数绝对值≥2.0被认为是一个显著的区别。当theLDA得分≥2.0的绝对值,有31种三组有显著差异,其中5 CSP组的物种丰富,即月形单胞菌属,Camplobacter, Campylobacteraceae,和Epsilonproteobacteria。26 CHP组物种丰富,也就是说,无胆甾原体,Synergistia, Dethiosulfovibrionaceae, TG5, Synergistales, Desulfobacteriale, Enterobacteriales,枝原体目,支原体,支原体科,肠杆菌科,Tenericutes,柔膜细菌,Acholeplasmataceae, Desulfobulbus, Desulfobulbaceae, Acholeplasmatales,埃希氏杆菌属Spirochaetale Filifactor、螺旋体属、螺旋体科,密螺旋体属,Porphyromonadaceae。没有明显的浓缩NC组中观察到,如图6。

5。数据分析和讨论

近年来,随着分子生物学领域的快速发展,高通量测序技术基于细菌16 srdna基因已成为首选方法识别细菌群落和物种减少成本和迭代的数据库更新。有越来越多的证据表明,疾病不是由病原体,但在复杂的病原体之间的平衡,居民微生物群,和宿主免疫反应。

在这项研究中,患者的咽分泌物样本CHP, CSP,和数控16 dsrdna检测技术,并初步探索了三组之间的差异。55724.64±1772.80优化CHP序列。最优序列在CSP 53697.73±2252.19, 55177.50±1661.80数控组。根据OTU累积曲线和稀释曲线咽微生物群落,随着样本量的增加,曲线逐渐被夷为平地,和样品的OTU微生物群落趋于稳定,表明30例的样本大小是充分的,测量数据的数量是合理的,测序深度基本上是达到了。

通过比较从多个角度咽微生物区系,α多样性分析表明,咽微生物群落的丰度增加共和人民党(CHP)集团和没有显著差异的多样性之间的CSP和NC组。PCoA和β组间差异分析表明,没有显著差异CP患者咽部细菌之间的构成和健康的人。这些结果表明,共和人民党(CHP)组更为多样化咽微生物,而且没有大幅变化咽炎患者不同的表型。

从门和属的比较,大量的月形单胞菌属和Camplobacter CSP组高于数控组和共和人民党(CHP)组。丰富的螺旋体属、Synergistetes Dialister, Desulfobacter,弯曲杆菌,ancholesteric Olsenella Filifactor、TG5 Porphyromonas,支原体,埃希氏杆菌属,密螺旋体属,嗜血杆菌,嗜血杆菌共和人民党(CHP)组,Johnsonella高于数控组和CSP组。结合LEfSe差异分析结果,推测螺旋体属,Synergistetes, Porphyromonas,支原体,埃希氏杆菌属可能是共和人民党(CHP)集团的标志。月形单胞菌属和Camplobacter CSP的标记,表明这些细菌群落的变化与CP。

正常人的呼吸道主要由拟杆菌门殖民,厚壁菌门,Fusobacteria,变形菌门和放线菌。不同的微环境,如鼻腔、口腔、和肺,有不同比例的微生物群落。本研究证实,占主导地位的主要细菌在正常咽部菌群仍拟杆菌门和壁厚菌门,但大量的螺旋体属和Synergistetes共和人民党(CHP)组显著增加。脂多糖、糖脂和膜脂蛋白是lipid-lipid螺旋体属和真核宿主之间的相互作用。脂蛋白是所有螺旋体属中含量最丰富的蛋白质表达。它扮演着一个重要的角色在包装、存储和转移膜核糖体的输出到细胞表面。与其他蛋白相比,它可以促进炎症反应和调节免疫反应,帮助病原体遵守主人的身体,和实现螺旋体属的免疫逃逸,从而导致人体持续感染的症状。因此,螺旋体属的增加可能会导致患者咽部菌群的失调,和抗生素的滥用和误用在临床实践中影响人体的免疫功能,加快疾病过程,导致长时间的共和人民党。Synergistetes广泛存在于自然界,许多种类的细菌隔绝了人体口腔、肠道、皮肤,和阴道,投机取巧的病原体。Synergistetes口腔牙周炎症密切相关,也参与更严重的炎症和组织损伤引起的口腔微生物感染、坏死溃疡性龈炎等。 Studies have shown that Synergistetes have a negative effect on the downregulation of intestinal relative abundance in patients with Celiac disease, induce the production of protective IgM antibodies in the intestinal tract of patients with systemic lupus erythematosus, and play a positive role in protective humoral immune response. In addition, the relative abundance of Synergistetes is positively correlated with the intake of cholesterol, niacin, and selenium and negatively correlated with acetic acid and total short-chain fatty acids, further demonstrating the anti-inflammatory effect of Synergistetes. In this study, the relative abundance of Synergistetes in the CHP group, NC group, and CSP group decreased successively, suggesting that Synergistetes had a dynamic imbalance in the pharyngitis of patients with CP. One or more strains under the same phylum showed anti-inflammatory effects on CHP and CSP.

除了内稳态失衡,CP的另一个特点是机会主义的相对丰度的增加病原体。在这项研究中,比例有益的共生细菌,放线菌Acfinobacteria普氏菌和拟杆菌门CP患者咽的下降。如果添加有益的共生细菌防止粘附和入侵病原体,可以控制细胞完整性和渗透率,然后与人类上皮表面的交互可以减少主人的炎症反应,并可以大大减少疾病的可能性。之前的研究表明,老鼠放线菌管理可以有效地减少龋齿的形成。互利共生细菌有效的乳酸菌和双歧杆菌的治疗有很好的影响porphyromonas感染牙龈上皮细胞。口服益生菌酸奶含有干酪乳杆菌和乳杆菌+维生素可以减少急性上呼吸道感染的发病率和频率。总之,发展益生菌调节CP的咽部菌群提供了一种新的治疗CP的想法。

6。结论

总之,丰度和CP患者咽部细菌的群落结构改变,共生有益的细菌倾向于减少,投机取巧的病原体的内容增加。因此,为了避免过度使用抗生素,适当使用益生菌有望恢复正常咽部菌群的稳定性。目前,16 srdna-based检测技术用于这项研究不能确定是否确定植物是活的抽样时,这可能会导致数据偏差。由于选择的差异片段测序和生物信息学分析和其他技术方面,数据结果最终可能导致错误。然而,未来的宏基因组测序可能填补这些漏洞。在未来,我们将进一步研究咽部菌群之间的关系和CP以及咽部菌群的代谢途径,这将帮助提供新的策略咽部疾病的预防和治疗。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

当前的研究伦理委员会批准深圳第三人民医院(批准文件没有:科学研究的深圳第三人民医院(2021 - 001))。

同意

所有本研究中的患者签署知情同意的微生物组成和分析传染病系的耳鼻咽喉科、头颈外科的深圳第三人民医院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

沈株式会社和刘Chunhan设计研究和贡献同样这项工作。沈上头写的手稿。王表示收集原始数据。沈株式会社和罗娇进行统计和生物信息学分析。Di张监督这项研究。所有作者阅读和批准了最终版本的手稿。

确认

作者感谢深圳华大基因研究院技术支持和研究参与者,技术专家,在深圳第三人民医院和医生的帮助。