文摘

缺血中风与神经与血管的变化行为,有关调解,在某种程度上,通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)。本研究的目的是探讨人类的影响星形胶质细胞增殖,细胞凋亡,与功能的人类微血管内皮细胞(hBMEC)体外。人类微血管内皮细胞(hBMEC)和人类正常星形胶质细胞(ha - 1800)被用来建立体外cocultured细胞模型。coculture模型被用来模拟缺血中风,这是发现星形胶质细胞可以促进hBMEC增殖,抑制细胞凋亡,减少细胞损伤,增强抗氧化能力通过激活VEGF信号通路。在星形胶质细胞VEGF是淘汰时,星形胶质细胞的保护作用hBMEC部分丢失。总之,我们的研究证实了hBMEC的保护作用和缺血中风研究奠定了基础。

1。介绍

缺血中风是指脑缺血和缺氧损伤引起的血管阻塞,导致局部或全脑功能障碍。它的特点是高发病率、高伤残率、高死亡率和高复发率和严重危及人类健康1]。缺血中风发生在缺乏氧气和营养的血液流动(2]。的身体会接受血管生成恢复血流缺乏血液流动时,血管生成对缺血中风的修复至关重要。尽管医学和血管内显著改善血管再通,治疗缺血中风仍然是有限的(选项3,4]。因此,促进血管生成被认为是一种有效的治疗缺血中风(目标5]。缺血中风后的血管生成的深入了解将有助于促进这种疗法的到来。

Coculture是混合和Coculture两种细胞的形态和功能的一种细胞可以表达稳定和维护了很长一段时间。人们已经发现,神经干细胞的cotransplantation和嗅神经鞘细胞可以减弱鼠神经元的凋亡,促进宿主神经元的生存,促进神经恢复在创伤性脑损伤通过抗炎机制6]。的coculture和移植脐血多能干细胞和淋巴细胞可以改善神经缺陷的症状,减少脑梗死的体积,减轻缺血性脑死亡大鼠的炎症反应7]。Coculture内皮祖细胞和神经祖细胞VEGF表达增加,激活了PI3K / Akt通路,synergically保护大脑内皮细胞缺氧/ reoxygenation-induced损伤[8]。coculture BMECs与星形胶质细胞相互作用的模型是应用最广泛的体外BBB模型。星形胶质细胞被发现支持神经修复和参与并维持血脑屏障BMECs的属性。Coculture hCMEC / D3的星形胶质细胞减少paracellular渗透率提高血脑屏障的能力为神经毒性(屏幕9]。然而,星形胶质细胞的增殖和凋亡的影响hBMEC及其机制尚不清楚。

血管生成是指新血管的形成从现有毛细血管的血管内皮细胞的分化和后毛细管小静脉10]。脑损伤后血管生成能促进神经元和脑功能的恢复,因此,研究脑损伤的血管生成具有重要意义。在这个过程中,星形胶质细胞参与血管内皮细胞生长的调节,调节内皮细胞之间的紧密连接和吞噬细胞的趋化性11]。脑损伤后星形胶质细胞发挥双重作用。一方面,过度激活产生大量炎症介质导致细胞损伤。另一方面,各种神经营养因子分泌激活内源性神经干细胞的增殖和直接影响修复受伤的细胞和神经再生12,13]。此外,星形胶质细胞也分泌促进神经体外生产的因素,如表皮生长因子、碱性成纤维细胞因子、脑源性神经生长因子、胰岛素样生长因子,血管内皮生长因子(14,15]。人们已经发现,在缺氧条件下,诱导VEGF mRNA和蛋白在脑astroglial文化发生(16,17]。然而,之间交互的机制下脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞缺氧仍不清楚。

在这项研究中,我们建立了一个人类星形胶质细胞的体外coculture模型和人脑微血管内皮细胞transwell技术观察星形胶质细胞增殖的影响,细胞凋亡,hypoxia-mediated脑微血管内皮细胞的抗氧化能力。这些结果为进一步研究奠定基础的保护机制对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞提供一个潜在的治疗缺血中风。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

hBMEC和ha - 1800细胞(FuHeng细胞库、中国、上海)在DMEM培养中含有10%的边后卫和1%双抗体和媒介改变了每2天。正常情况下,细胞被维护在一个孵化器充满95%的空气和5%的公司₂在37°C。缺氧治疗,hBMEC在缺氧孵化器孵化充满94% N₂,5%的公司₂,1%的人啊₂在37°C。

2.2。Coculture hBMEC和ha - 1800

用胰蛋白酶消化hBMEC准备单个细胞悬液细胞密度的2×10⁵24-well板/ L和接种。非接触细胞coculture系统建立了使用transwell细胞。ha - 1800胰蛋白酶消化成单个细胞悬液细胞密度的2×10⁵/ L。暂停接种在transwell细胞的底部涂上胶原蛋白I型,然后,这些细胞被放置在毛孔与hBMEC接种。对于hBMEC单独培养,没有插入到洞室。

2.3。由CCK-8细胞生存能力

细胞生存能力是由CCK-8试验(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。简而言之,从每组细胞消化和删除,hBMEC种植96 -孔板和孵化2小时37°C 100 ul DMEM包含10 ul CCK-8解决方案。在570纳米测量吸光度标(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。所有实验进行三次。

2.4。TUNEL

hBMEC coculture模型和ha - 1800建立了Transwell技术。在常氧(5%股份有限公司₂空气,95%)和低氧(1%啊₂,5%的公司₂,94% N₂)条件下,细胞培养组和VEGF基因敲除组固定在指定的治疗。然后,固定和4%多聚甲醛和0.1% permeabilized triton x - 100, hBMEC孵化与TUNEL反应混合物为1小时37°C在黑暗中与DAPI染色15分钟。共焦激光扫描显微镜(FV300、奥林巴斯、日本)是用于检测细胞的荧光。

2.5。可拆卸的核的VEGF

设计和建造了siRNA专门针对VEGF杰纳西(广州)。使用siRNAs的序列如下:

ha - 1800转染与某些向量使用Lipofectamine 2000(英杰公司)按照制造商的指示,然后被用于进一步的实验。免疫印迹分析证实了特定的VEGF表达的沉默。

2.6。超氧化物歧化酶(SOD)的测定

由不同组的细胞治疗消化,和细胞悬液细胞溶解为15分钟里帕冰,在4°C 12000 rpm,离心10分钟。上层清液收集,内容决定使用草皮工具包(南京建成生物工程研究所)。

2.7。免疫印迹

显示治疗后,hBMEC收集和细胞溶解里帕裂解和提取缓冲(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。蛋白质浓度由BCA评估方法(微BCA蛋白质化验设备,热费希尔科学),和50μg的每个样本被sds - page分离胶12%。然后,被转移到PVDF膜的蛋白质(微孔、马、美国)。阻塞用脱脂牛奶之后,一夜之间,膜被孵化的主要抗体在4°C,水洗,然后用二次孵化的1 h每个抗体室温。抗vegf抗体使用(ab32152), ERK (ab17942) p-ERK (ab50011),一种蛋白激酶(ab8805) p-Akt (ab38449),和山羊anti-rabbit二级抗体(ab150077)。结果量化,使用ImageJ软件和图像处理。GAPDH是用作内部加载控制。

2.8。统计分析

使用SPSS 16.0软件进行统计分析(SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。测量数据表示为均值±SD和受到统计分析使用单向方差分析(方差分析)。重要的相互作用中发现任何方差分析范式时,t测试被用来演示各个组之间的影响。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Coculture星形胶质细胞模型的建立(ha - 1800)和人类微血管内皮细胞(hBMEC)

为了研究hBMEC星形胶质细胞的影响,transwell技术是用于建立间接coculture ha - 1800和hBMEC体外模型。细胞接种ha - 1800被移除在0 h, 6小时、12小时和24小时normoxia检测的影响coculture hBMEC星形胶质细胞在不同的时间。首先,CCK-8试验表明,ha - 1800显著增加hBMEC核扩散活动(图1(a))。接下来,超氧化物歧化酶(SOD)水平,抗氧化剂指数中检测出细胞溶解产物,结果表明,随着时间的推移,SOD水平增加(图1(b))。同时,TUNEL观察到的ha - 1800显著抑制细胞凋亡(数字1(c)和1(d))。

3.2。Coculture ha - 1800和hBMEC提升功能修复大脑微血管内皮细胞缺氧

的结构和细胞的血脑屏障(BBB)脑微血管内皮细胞(BMEC)。内皮细胞之间的紧密连接是BBB的特征结构的基本保证和维护的屏障功能。内皮细胞通常的直接目标细胞病理损伤因素如缺氧,缺氧会带来一系列的细胞生长的内部环境的变化18- - - - - -21]。探讨星形胶质细胞对hBMEC在缺氧条件下,我们cocultured ha - 1800和hBMEC常氧和缺氧条件下24小时。发现hBMEC细胞的增殖活性和SOD水平下显著降低缺氧而normoxia。然而,与星形胶质细胞coculture normoxia和缺氧的增殖活性和SOD水平显著增强hBMEC(数字1(一)和1(b))。接下来,TUNEL发现缺氧促进hBMEC细胞凋亡,而coculture扭转低氧诱导细胞凋亡(数字2(c)和2(d))。总之,我们发现,ha - 1800能显著提高hBMEC normoxia下细胞活性,和ha - 1800和coculture hBMEC可以修复细胞功能损伤由缺氧引起的。

3.3。ha - 1800通过VEGF信号通路影响hBMEC功能

VEGF信号通路中起着重要的作用在血管生成的过程中(22]。我们推测coculture可能促进通过VEGF通路诱导血管生成。此外,ERK和Akt通路是血管生成的关键细胞内信号转导途径激活后VEGF信号通路(23]。因此,我们还研究了影响coculture ERK和Akt通路的调节缺氧。免疫印迹被用来检测蛋白质含量相关的途径,发现VEGF的表达和ERK1/2磷酸化和Akt增加coculture组和缺氧治疗24小时。这种感应是更重要的比在缺氧或缺氧coculture组coculture只(数字3(一)和3(d))。总体而言,我们的数据表明,VEGF信号通路可以激活coculture和缺氧诱导的ha - 1800和hBMEC在缺氧更重要。

3.4。淘汰赛中VEGF的ha - 1800可以消除缺氧对hBMEC细胞的功能完整性的影响

建立因果关系的生产细胞衍生VEGF在ha - 1800和低氧诱导hBMEC功能障碍,我们使用核方法淘汰赛VEGF在ha - 1800。免疫印迹分析证实特定的沉默,显示出减少超过80% ha - 1800 VEGF水平与VEGF蛋白转染核(图4(a))。最重要的是,VEGF基因敲除显著降低cocultured-induced细胞增殖,抑制细胞凋亡,抗氧化能力在缺氧(数字4(b) -4(d))。这些结果表明,ha - 1800可以保护的功能完整性hBMEC通过VEGF在缺氧。

4所示。讨论

急性血脑屏障(BBB)中断发生在最初几个小时的缺血中风和已经收到了越来越多的关注。BBB由脑微血管内皮细胞排列,和外围细胞基底膜和脚过程之外的星形胶质细胞内皮细胞也参与BBB形成(24,25]。它有一定的屏障结构限制物质通过的能力,规范和维护中枢神经系统稳定的微环境(26]。目前,它是最常见的方法来构造coculture缺血性中风的血脑屏障模型的动物主要的内皮细胞和神经胶质细胞27]。已经发现的表达水平γgt在通道的主要细胞酶显著降低,表明细胞可能会逐渐失去一些BBB特征在初代培养(28]。使用通道的细胞系是划算的,快,并且支持广泛的实验段和增殖细胞不需要负责任的细胞分离。因此,在这项研究中,代表人类脑血管内皮细胞系hBMEC和积极的星形胶质细胞ha - 1800 cocultured建立体外BBB, BBB和缺氧的影响评估。

脑损伤后血脑屏障是缺氧和缺血。在这种状态下,大脑微血管内皮细胞影响星形胶质细胞在缺氧和各种血管生成因素。同时,angiogenesis-related由胶质细胞生长因子和细胞因子的分泌受低氧诱导因子,和激活低氧诱导因子诱发神经胶质细胞的耐受缺血缺氧(29日]。血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的一个proangiogenic因素脉络膜血管再生的微环境。大量的研究已经证实,VEGF在病理新血管形成的过程中起着至关重要的作用[30.]。作为特定的内皮细胞有丝分裂原,VEGF可以诱导血管内皮细胞的分裂和增殖,促进内皮细胞的迁移,这有利于形成大量的血管萌芽的新船。脑微血管内皮细胞、周和星形胶质细胞可以产生VEGF。在缺氧的状态,分析脑微血管的血管生成细胞的细胞内环境水平,它可以发现血管内皮细胞是由各种各样的周围细胞(31日),其中一个细胞。VEGF的受缺氧性质使它一个重要的新血管形成因子,能具体地绑定到血管内皮细胞,促进内皮细胞的生长,因此参与低氧诱导脉络膜新生血管形成。人们已经发现,缺氧和星形胶质细胞可以促进VEGF表达(16,17]。我们检测VEGF蛋白表达水平的免疫印迹和获得一致的结果。VEGF的表达在hBMEC增加缺氧或coculture和VEGF表达的增加是更重要的在缺氧和ha - 1800 cocultured在同一时间。与此同时,VEGF在ha - 1800年淘汰时,ha - 1800失去其对缺氧损伤的保护作用的一部分。这些结果表明,ha - 1800可能影响扩散,细胞凋亡,抗氧化能力hBMEC通过调节VEGF的表达。

总之,我们的研究结果证实了星形胶质细胞在介导缺血屏障损伤的重要作用。我们发现,在正常情况下,coculture ha - 1800和hBMEC显著增加细胞增殖活性,抑制细胞凋亡,促进了ROS。在缺氧,hBMEC细胞的增殖活动减少,细胞凋亡增加,和细胞内ROS水平下降,而coculture可以部分逆转缺氧引起的细胞损伤。这个函数可能与ERK和一种蛋白激酶磷酸化和VEGF蛋白表达。我们摧毁了VEGF在星形胶质细胞和显著降低抵抗缺氧损伤的能力。这些结果表明,星形胶质细胞可以防止hBMEC缺氧损伤通过激活VEGF信号通路。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。