miR-34a通过调控SATB1表达影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

摘要

目标．探讨miR-34a对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法．分离培养KFB和正常皮肤成纤维细胞(NFB)，检测miR-34a和整合素的mRNA表达水平βRT-qPCR检测KFB和NFB中SATB1基因的表达，western blot检测SATB1基因的表达。采用蛋白表达水平、MTT法、Transwell法、RT-qPCR、western blot检测过表达miR-34a或抑制SATB1表达对KFB细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-34a与SATB1的靶向关系。结果．与NFB相比，KFB中miR-34a的表达下调，SATB1的mRNA和蛋白表达上调。过表达miR-34a或抑制SATB1表达可抑制KFB的增殖、迁移和侵袭。miR-34a可负向调节SATB1的表达，过表达SATB1逆转过表达miR-34a对KFB增殖、迁移和侵袭的影响。结论．miR-34a通过下调SATB1的表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。

1.背景

瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维化疾病，其特征是成纤维细胞过度增殖和细胞外基质(如胶原蛋白)过度沉淀[1］.瘢痕疙瘩的发病机制尚不清楚，也缺乏令人满意的治疗药物[2］.瘢痕疙瘩的治疗以手术切除为主，但治疗效果较差，易复发[3.］.因此，探讨瘢痕疙瘩的发病机制，寻找有效治疗瘢痕疙瘩的靶点具有重要意义。MicroRNA (miRNA)是一种长度为21-25个核苷酸的小型非编码RNA。它可以结合特定的mRNA或通过调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调节基因表达[4］.

近年来，一些学者对瘢痕疙瘩和正常皮肤中的miRNA表达谱进行了研究，发现了多种差异表达的miRNA。上调的mirna包括miR-1202、miR-1207、miR-21、miR-130和miR-1915，下调的mirna包括miR-451和miR-720。生物信息学进一步分析这些差异表达的mirna与疤痕形成过程中的许多重要因素有关，包括胶原形成、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子等。研究发现，miR-200b在增生性疤痕组织和疤痕皮肤成纤维细胞中明显下调，miR-200b可影响疤痕皮肤成纤维细胞的增殖和凋亡，调节胶原基因I和III的表达。本研究拟研究miR-34a和SATB1介导瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的具体机制。

2.材料和方法

2．1．材料

胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自美国Gibco;MTT购自美国Amresco;Lipofectamine TM 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司;miR-34a mimic (mimic)、mimic阴性对照、miR-34a inhibitor (anti-miR-34a)、阴性对照序列(anti-miRNA-NC)、SATB1小干扰RNA (si-SATB1)、杂乱无义阴性序列(si-NC)购自广州瑞博生物技术公司;Trizol试剂和逆转录试剂盒购自美国Fermentas;PCR试剂盒购自大连宝生物有限公司;引物序列由上海生物工程公司设计合成。

2．2．KFB和正常皮肤成纤维细胞的培养

取新鲜瘢痕瘤及健康人体正常皮肤组织标本，0.5%洗必泰溶液浸泡5分钟，生理盐水冲洗3次，切成块，置于培养皿中，加入20%胎牛血清。将DMEM培养基置于37℃、5% CO的培养箱中₂， 97%的湿度。每2 ~ 3天更换一次培养基，用相差显微镜观察。当细胞游出来时，融合细胞占据了培养皿底部80%的区域，它们就被传代了。随后的实验使用了4到7次细胞传代。

2．3.细胞转染

取对数生长期的KFB，接种于6孔板中。当细胞生长到60%时，参照Lipofectamine TM 2000试剂盒说明书，分别比较miR-34a mimic (miR-34a组)和mimic阴性对照(miRNA-NC组);miR-34a模拟物和pcDNA (miR-34a + pcDNA组);miR-34a mimic和pcDNA-SATB1 (miR-34a + pcDNA-SATB1组)转染KFB。同时设置空白对照组，KFB未进行任何操作，培养正常。转染48 h后收集细胞用于后续实验。

２.４.MTT检测细胞增殖

每组KFB制成单细胞悬液，2.5 × 10接种96孔板⁴细胞/毫升,200μL /孔，培养24、48、72 h，每组设3个重复孔。孵育后加20μ每孔取5 mg/ml MTT溶液，继续孵育4 h。弃上清，加150μl二甲基亚砜，反应10分钟，混匀，用酶标仪在490 nm处测量吸光度(A 490)。这个实验重复了三次。

2．5．Transwell检测细胞迁移能力

每组KFB以1 × 10的剂量接种于Transwell细胞上腔⁵件/毫升,100μl /。每组有3个重复孔。增加500μl含10%胎牛血清的DMEM培养基至下腔室。培养48h后，抽吸培养基，取出上腔，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜观察。随机选择5个视场来计算迁移单元的数量。细胞迁移能力通过通过滤膜进入下腔的细胞数来表示。这个实验重复了三次。

2．6．Transwell检测细胞入侵能力

Transwell室上腔室用基质胶覆盖作为入侵模型，其余操作与细胞迁移试验相同。通过滤膜进入下腔的细胞数代表细胞的侵袭能力。

2.7。RT-qPCR检测miR-34a和SATB1的mRNA表达水平

每组KFB以2.5 × 10的剂量播种于24孔培养皿中⁴细胞/毫升每口井。培养48h后，胰酶消化收集各组细胞。Trizol试剂裂解细胞提取总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，参照PCR试剂盒操作说明书进行扩增。PCR扩增条件为:95℃预变性30 s, 95℃变性5 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s，共45个循环。miR-34a以U6为内控，SATB1以GAPDH为内控，通过2计算miR-34a与SATB1 mRNA的相对表达量^−△△Ct方法。

2.8。蛋白表达的Western Blot检测

检测细胞内相关蛋白的表达。每组KFB以2.5 × 10接种于24孔板中⁴件/每毫升。培养48小时后，胰酶化细胞，收集各组细胞。加入裂解缓冲液，置冰充分裂解。10000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后，将总蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶在室温下封闭2小时。用TBST冲洗膜后，加入一抗，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜，加入二抗，37℃继续孵育1 h。用TBST冲洗后，加入ECL显影，曝光，拍照。Image J1.8.0软件测量内参蛋白GAPDH和待测蛋白条带的灰度值。检测蛋白的表达由检测蛋白的灰度值与内部参考蛋白的比值表示。 Verification of the targeting relationship between miR-34a and SATB1: bioinformatics software predicts that there are binding sites between the 3′UTR of SATB1 and the nucleotide sequence of miR-34a. The 3′UTR sequence of SATB1 containing miR-34a binding site was amplified by PCR to construct SATB1 wild-type (WT-SATB1) and mutant (MUT-IT-GB5) luciferase reporter plasmids. WT-SATB1, MUT-SATB1, and miR-34a mimics or miRNA-NC were transfected into KFB, respectively. After 48 h of transfection, refer to the luciferase detection kit operating instructions and bioluminescence instrument to detect luciferase activity. Simultaneously transfect miR-34a mimics (miR-34a group) and miRNA-NC (miRNA-NC group). After transfection into KFB 48 hours, trypsin digestion, harvest the cells and western blot to detect the expression level of SATB1 protein in the cells.

2.9。统计方法

实验数据采用SPSS22.0软件进行统计分析。测量数据用均数±标准差(mean±SD)表示t两组间比较采用检验，多组间比较采用单因素方差分析。 表明差异具有统计学意义。

3.结果

3．1.miR-34a和SATB1在KFB和NFB中的表达

与NFB相比，KFB中miR-34a的表达水平显著降低( ），SATB1 mRNA和蛋白表达水平显著升高( ），提示KFB中miR-34a表达下调，SATB1表达上调。图中可见KFB和NFB中miR-34a的表达，KFB和NFB中SATB1 mRNA的表达，KFB和NFB中SATB1蛋白的表达1．

3．2.miR-34a过表达对KFB增殖的影响

miR-34a组KFB中miR-34a水平明显高于miRNA-NC组( ），提示miR-34a模拟物成功转染，miR-34a在KFB中过表达。与miRNA-NC组相比，miR-34a组KFB的A 490值在培养48 h和72 h后显著降低( ），cyclinD1蛋白水平降低( ），和p21岁,p27蛋白质水平升高( )．空白对照组与miRNA-NC组检测指标差异无统计学意义( )．参见图2获取详细信息。

3．3.miR-34a过表达对KFB迁移和侵袭的影响

与miRNA-NC组相比，miR-34a组KFB迁移和侵袭的数量减少( ），MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达显著降低( )．空白对照组与miRNA-NC组检测指标差异无统计学意义( ）;参见图3.获取详细信息。

3．4．miR-34a靶向并调节SATB1的表达

与miRNA-NC组相比，携带WT-SATB1报告基因载体的miR-34a组的KFB荧光素酶活性明显降低( ），而携带MUT-SATB1报告基因载体的KFB荧光素酶活性无显著变化( )．miR-34a组SATB1蛋白水平明显低于miRNA-NC组( )．参见图4获取详细信息。

4.讨论

瘢痕疙瘩是一种常见的皮肤纤维组织增生疾病，主要与成纤维细胞异常增殖和胶原合成异常有关[5- - - - - -7］.治疗瘢痕疙瘩的方法很多，但效果不佳。随着基因工程技术的快速发展，通过基因工程方法对成纤维细胞进行靶向诱导。

miRNA主要通过作用于靶基因作为抑癌基因或致癌基因。生物信息学研究发现SATB1的3'UTR包含与miR-34互补的核苷酸序列，提示miR-34可能靶向并调控SATB1的表达。已有研究证明，SATB1可以与某些转录因子和染色质组蛋白修饰酶相互作用，并与特定的DNA序列结合，调节基因表达，参与调控机体的各种生理功能。miR-34a作为一种高度保守的miRNA，也参与调控细胞中的多种生物事件:(1)细胞周期阻滞[8］.(2)促进细胞衰老[9]:在人成纤维细胞中引入miR-34a和miR-34b/c会导致细胞衰老。一项研究将miR-34a转染到HCT116细胞、RKO细胞和p53个突变的SW480细胞，发现细胞大小增加导致衰老，相关半乳糖苷酶(衰老相关半乳糖苷酶)呈阳性，提示miR-34a可诱导细胞衰老。(3)诱导细胞凋亡[10]: miR-34s在癌细胞中重新激活，促进caspase3和PARP的切割，诱导caspase3调控的凋亡通路。(4)防止细胞迁移[11]:在黑色素瘤和肝癌组织中，miR-34的再激活可以抑制c-Met蛋白，防止肿瘤细胞迁移和浸润[11］.

本研究的荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-34a mimic可以降低野生型SATB1的荧光素酶活性，但对突变型SATB1的荧光素酶活性无显著影响，提示miR-34可以与SATB1靶向结合位点的3 ' UTR进行比较。此外，在KFB中上调miR-34表达后，SATB1蛋白表达下调，在下调miR-34表达后，SATB1蛋白表达上调，进一步证实了KFB中miR-34可负调控SATB1的表达。本研究还发现，过表达SATB1逆转了过表达miR-34对KFB增殖、迁移和侵袭的影响，提示过表达miR-34通过靶向SATB1的表达抑制KFB的增殖、迁移和侵袭。一个miRNA通常可以同时调控多个具有相同靶位点的靶基因。

miR-34a组KFB中miR-34a水平明显高于miRNA-NC组( ），提示miR-34a模拟物成功转染，miR-34a在KFB中过表达。与miRNA-NC组相比，miR-34a组KFB的A 490值在培养48 h和72 h后显著降低( ），cyclinD1蛋白水平降低( ），和p21岁,p27蛋白质水平升高( )．空白对照组与miRNA-NC组检测指标差异无统计学意义( )．与miRNA-NC组相比，miR-34a组KFB迁移和侵袭的数量减少( ），MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达显著降低( )．空白对照组与miRNA-NC组检测指标差异无统计学意义( )．与miRNA-NC组相比，携带WT-SATB1报告基因载体的miR-34a组的KFB荧光素酶活性明显降低( ），而携带MUT-SATB1报告基因载体的KFB荧光素酶活性无显著变化( )．miR-34a组SATB1蛋白水平明显低于miRNA-NC组( )．与NFB相比，KFB中miR-34a的表达水平显著降低( ），SATB1 mRNA和蛋白表达水平显著升高( ），提示KFB中miR-34a表达下调，SATB1表达上调。

综上所述，miR-34在KFB中低表达，过表达miR-34可抑制KFB的增殖、迁移和侵袭。SATB1是miR-34的靶基因，miRNA-143-3p可能通过下调SATB1的表达发挥作用。

数据可用性

原始数据可从通讯作者处获得。

的利益冲突

没有报道与本文相关的潜在利益冲突。

作者的贡献

蒋磊和石秀芳对这一研究做出了同样的贡献。

致谢

本研究由山东省医药卫生科技发展计划项目(2019WS278)和山东省自然科学基金项目(ZR2019PH035)资助。

参考文献

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