文摘

骨关节炎(OA),一种慢性疾病,其特征是关节软骨退化,是全球残疾和疼痛的主要原因。越来越多的证据表明,环状rna (circRNAs)发挥重要作用在不同的疾病,但在OA circRNAs的功能在很大程度上仍是个未知数。在这项研究中,我们发现circ_0001598显著调节软骨细胞il - 1处理β从小鼠和软骨组织切断前交叉韧带手术(ACLT)诱导OA模型。干扰circ_0001598体外恢复il - 1β全身的软骨细胞增殖和细胞凋亡。沉默circ_0001598显著缓解ACLT-induced OA老鼠。从力学上看,击倒circ_0001598影响软骨细胞增殖,细胞凋亡,和矩阵退化通过调节mir - 127 - 3 - p。综上所述,我们的研究结果证明circ_0001598的基础性作用和骨关节炎的预防和治疗提供新思路。

1。介绍

骨关节炎(OA)是一种退行性关节畸形形成的和伤残率高的疾病,主要表现为软骨细胞凋亡和联合矩阵退化(1]。OA的发病主要发生在中年和老年人,和临床发病率随着年龄的增加逐渐增加(2,3]。目前,没有有效的疾病修饰治疗用于办公,因为有限的对其发病机制的理解。因此,关节置换仍然是主要治疗晚期骨关节炎患者(4,5]。大多数人认为骨关节炎的发生和发展与年龄、体重、机械损伤、和生物因素,他们也可能与生物力学相关疾病的病理变化引起的体内关节软骨(6]。OA的发生和发展涉及整个软骨组织(包括软骨、滑膜和底层骨),病理变化是最密切相关的软骨组织,和软骨组织损伤软骨细胞凋亡密切相关(7- - - - - -11]。关节软骨软骨细胞的过度凋亡是有害的。大量软骨细胞的凋亡导致软骨细胞密度的减少,这不仅会导致软骨支架本身的破坏也导致软骨的退化由于细胞外基质的分泌不足(12,13]。细胞外基质,由2型胶原和蛋白聚糖,不仅提供了抗拉强度和弹性对关节软骨,还提供了一个外部环境对软骨细胞生存。因此,降解细胞外基质的改变将导致软骨的力学性能一方面和另一方面,软骨细胞的生存环境,导致软骨细胞的凋亡14]。软骨细胞凋亡的相互作用引起的恶性循环和细胞外基质退化的重要原因之一是不断发展、恶化的OA (15]。尽管越来越多的努力一直致力于解开骨关节炎的病理过程,其分子机制仍不清楚。因此,有一个未满足的医疗需要找到新的药物靶点开发更有效的治疗。

圆形rna (circRNAs)是一类非编码rna由背侧拼接的前体mrna和广泛表达于哺乳动物与高度保守的、稳定的、和组织模式(16]。因为circRNAs高度表达,结构稳定,拥有大量的microrna的结合位点,他们可能是一个“生物海绵”的microrna浓缩(17]。CircRNAs依靠microrna功能和可能发挥重要的监管作用,各种疾病的发病和进展,包括办公自动化(18]。例如,刘等人发现71 circRNAs差异表达在骨关节炎和正常软骨细胞(19]。李等人指出,circ_0136474增加OA软骨组织,抑制软骨细胞增殖和促进细胞凋亡20.]。沈等人发现circSERPINE2抑制OA进展通过瞄准mir - 1271 - 5 - p和ERG ECM代谢调节人类软骨细胞(21]。hsa_circ_0005105调节NAMPT miR-26a通过抑制转录活动,导致细胞外基质(ECM)的加速退化OA (22]。CircRNA。33186directly binds and inhibits miR-127-5p to influence ECM catabolism and protect chondrocytes to reduce OA [23]。

在目前的研究中,我们探讨了circ_0001598在办公自动化的发展。我们发现,il - 1 circ_0001598显著调节β治疗软骨细胞和软骨组织ACLT-induced OA的小鼠模型。后续功能实验表明,circ_0001598显著减毒OA绑定mir - 127 - 3 - p参与软骨细胞增殖,凋亡,矩阵退化。综上所述,我们发现circ_0001598提供潜在的药物的基本作用OA治疗的目标。

2。材料和方法

2.1。动物实验

八周大小鼠腹腔注射它莫西芬(σ,100μg / g体重)连续5天。与异氟烷麻醉是紧随其后的是ACLT右膝的手术建立一个实验OA模型。控制老鼠受到虚假的手术,老鼠在手术后4到8周执行。ACLT手术在治疗实验中,治疗4周后,小鼠注射了IA lentivirus-incorporated si-circRNA应对circ_0001598或消极控制慢病毒(1×10⁹空斑形成单位的总量5毫升每周一次)为3周。老鼠在星期3执行和分析。所有动物实验动物伦理委员会批准,并根据执行委员会的指导方针。

2.2。原发性软骨细胞隔离和文化

首先,新生鼠都沉浸在酒精死后,关节软骨的后肢在无菌条件下分离并放入培养皿中充满了PBS的解决方案。软骨组织切成块,洗了PBS溶液含有双抗体3 * 25厘米²培养瓶。体积的0.25%胰蛋白酶,10 - 15倍软骨,添加1 - 2小时消化之前终止。和0.02%添加了II型胶原酶消化在37°C 12小时前添加DMEM / F12培养基(Gibco)。最后,滤液收集200网过滤和离心5分钟在1500 r / min的文化组成的DMEM / F12 (Gibco), 10%胎牛血清(penicillin-streptomycin Gibco、北美)和1%(美国Gibco) 37°C公司5%₂孵化器。

2.3。核转染

siRNA专门针对circ_0001598和慢病毒表达击倒circ_0001598构造和microrna的抑制剂被设计和建造杰纳西(广州)。使用siRNAs的序列如下:(我)如果高争夺GUGCGAGGGGGUUGUAAUC(2)如果RNA量1,应承担CTGCTTCAGCTCCTGCAGCTT(3)如果高RNA检测2 GCCGTTTCTGCTTCAGCTCCT(iv)si-RNA-3, CCGTTTCTGCTTCAGCTCCTG

软骨细胞转染有特定的向量使用Lipofectamine 2000(英杰公司)按照制造商的指示,然后被用于进一步的实验。

2.4。中存在

试剂盒^®试剂(英杰公司)是用来隔离从软骨细胞总RNA。合成第一链cDNA、PrimeScript RT试剂盒(豆类)使用。circRNA的量化,信使rna,并使用SYBR GAPDH基因进行预混料Taq交货(豆类Bio)实时检测系统(ABI一步+)。引物序列如下:GAPDH F 5′-TACCCCCAATGTGTCCGTC-3′, 5 R′-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3′;circ_0001598 F 5′-TCCAGGGAATGCTGTGAAGAG-3′, 5′-GAGAATCCTGCTGGTCTCCTG-3′;miR127-3p 5′-AACAAGTCGGTTCGAGTCTGC-3′, 5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;COL2A1 F 5′-ACCTTGGACGCCATGAAA-3′, 5′-GTGGACAGTAGACGGAGGAA -′;MMP13 F 5′-GGAAGACCCTCTTCTTCTCT-3′, 5′-TCATAGACAGCATCTA CTTTGTT-3′。内部参考其他基因GAPDH,我们使用了2^-ΔΔCT基因表达分析的方法。

2.5。免疫印迹

总蛋白提取从软骨细胞或软骨组织里帕裂解缓冲(CWBIO,中国),并使用BCA蛋白质浓度测定试验(Beyotime,中国)。然后,蛋白质在SDS-polyacrylamide凝胶电泳和转移到硝化纤维素膜(微孔、Carrigtwohill、爱尔兰)。阻塞用脱脂牛奶之后,一夜之间,膜被孵化的主要抗体在4°C,水洗,然后用二次孵化的1 h每个抗体室温。anti-collagen II(使用的抗体稀释1:5000;英国Abcam)、anti-MMP-13(稀释1:3000;英国Abcam)、GAPDH(稀释1:1000;Abcam、英国),和山羊anti-rabbit二级抗体(稀释1:5000;英国Abcam)。结果量化,使用ImageJ软件和图像处理。GAPDH是用作内部加载控制。

2.6。CCK-8

CCK-8试验进行测量circ_0001598对软骨细胞增殖的影响。CCK-8试验,与核细胞转染48小时,然后接种到96孔板的密度2103细胞。吸光度在450 nm用SpectraMax 250分光光度计测量。每个样品重复三次。

2.7。TUNEL

软骨细胞培养在24-well板1×10⁵在每一个细胞,细胞的被TUNEL分析评估。显示治疗后,软骨细胞用4%多聚甲醛和0.1%固定和permeabilized Triton x - 100。软骨细胞TUNEL反应混合物孵育1小时37°C在黑暗中与DAPI染色15分钟。共焦激光扫描显微镜(FV300、奥林巴斯、日本)是用于检测细胞的荧光。

2.8。统计分析

数据表示为均值±SD和统计分析是由单向方差分析为多个比较或学生的t以及。p< 0.05(双边)被认为是具有统计学意义的统计计算。所有统计分析GraphPad和许可证。

3所示。结果

3.1。Circ_0001598提高OA软骨组织的鼠标和软骨细胞il - 1的刺激β

图1分析circ_0001598之间的相关性和骨关节炎。在OA调查circ_0001598的潜在作用,我们检查了circ_0001598在il - 1的表达β全身的软骨细胞中存在。在il - 1 Circ_0001598被发现显著的调节β治疗软骨细胞剂量依赖性的方式与控制(图1(一))。评估circ_0001598体内的表达,我们使用ACLT手术诱导OA。接下来,circ_0001598的表达,13 (MMP-13)、基质金属蛋白酶和胶原蛋白(COL2A1) OA软骨组织中检测到存在,这是发现与控制相比,circ_0001598表达水平明显高于OA软骨组织中与对照组相比,特别是在严重的OA组(图1 (b))。同时,表达水平的MMP-13软骨退化矩阵在骨关节炎软骨组织增加,虽然COL2A1的表达水平,软骨基质胶原蛋白的主要成分,是表达下调(数字1 (c)和1 (d))。综上所述,这些数据表明,circ_0001598可能参与OA的进步。

3.2。在il - 1 Circ_0001598对增殖和凋亡的影响β治疗软骨细胞

为了测试circ_0001598在软骨细胞的生物学功能,我们设计了小干扰rna击落circ_0001598并验证了击倒3独立siRNAs存在(图的效率2(一个))。我们选择siRNA3为后续实验,因为它是最有效的核。测试是否circ_0001598调节软骨细胞增殖,我们与siRNA3然后转染软骨细胞治疗10 ng / ml 1 l - 1β24 h和检测细胞增殖采用细胞计数Kit-8 (CCK-8)。我们发现软骨细胞增殖后显著降低1 l - 1β治疗,而circ_0001598部分逆转其效果(图2 (b))。接下来,我们使用TUNEL分析是否circ_0001598软骨细胞凋亡的影响。这是观察到,在软骨细胞,il - 1β治疗诱导细胞凋亡,而circ_0001598沉默显著减少软骨细胞凋亡的比例相比,控制数据2 (d)和2 (e))。存在和免疫印迹结果表明MMP-13表达水平的il - 1后显著增加β治疗,虽然COL2A1的表达水平下调。circ_0001598击倒后,的表达MMP-13 mRNA和蛋白水平明显降低,当COL2A1的表达显著增加小干扰rna(相对于数控数据2 (c),2 (f),2 (g)- - - - - -2(我))。这些数据表明,击倒circ_0001598促进软骨细胞的增殖,抑制il - 1β治疗软骨细胞凋亡,对il - 1和保护β全身的OA体外。

3.3。沉默Circ_0001598缓解骨关节炎ACLT-Induced体内

调查的体内作用circ_0001598 OA的发病机理,我们注入circ_0001598和控制siRNA每周4周使用关节腔慢病毒在ACLT-operated老鼠。存在分析来验证的可拆卸的效率circ_0001598慢病毒注射后(图3(一个))。存在和免疫印迹显示MMP-13表达增加,和COL2A1表达降低小鼠骨关节炎的膝盖软骨,由沉默明显缓解circ_0001598(数字3 (b)- - - - - -3 (f))。综上所述,这些数据表明,体内的沉默circ_0001598变弱ACLT-induced小鼠骨关节炎。

3.4。miR127-3p Circ_0001598对软骨细胞生物功能

考虑到circRNAs已经证明作为microrna的海绵,我们预测的潜在目标microrna与circRNA交互母星软件(http://starbase.sysu.edu.cn/)。我们发现circ_0001598拥有多个结合位点的种子区域mir - 127 - 3 - p(图4(一))。我们发现mir - 127 - 3 - p的表达水平明显在il - 1表达下调β治疗剂量依赖性的方式(图中软骨细胞4 (b))。接下来,我们cotransfected si-circ_0001598和mir - 127 - 3 - p抑制剂成软骨细胞,然后把细胞il - 1的10 ng / mlβ24 h。CCK-8和TUNEL显示击倒的circ_0001598促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞凋亡,而circ_0001598被逆转的影响沉默mir - 127 - 3 - p(数字4 (c)- - - - - -4 (e))。存在和免疫印迹分析表明,减少MMP-13表达式和高COL2A1表达式由circ_0001598沉默(恢复数据4 (f)- - - - - -4(我))。总之,这些结果表明,circ_0001598有助于OA的发病机制通过mir - 127 - 3 - p。

4所示。结论

最近,circRNAs已被证明骗取microrna调节基因的表达。汉等人发现circRNA-MTO1 miR-9直接结合,抑制miR-9活动从而调节肝细胞癌进展(24]。郑等人报道,circHIPK3充当mir - 124海绵作为细胞生长调节剂(扮演一个角色18]。黄等人报道,circ_0001598中扮演着重要角色在乳腺癌进展和曲妥珠单抗耐药表型的规定通过mir - 1184 / PD-L1信号(25]。然而,在OA circ_0001598的作用仍然是未知的。在目前的研究中,我们验证了交互的circ_0001598 mir - 127 - 3 - p。circ_0001598调节il - 1β全身的细胞增殖和细胞凋亡的调制mir - 127 - 3 - p。

总之,我们的研究入手,circ_0001598高架在鼠标OA软骨组织和il - 1β刺激软骨细胞。体外击倒circ_0001598促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞凋亡和体内内注入circ_0001598慢病毒显著减弱ACLT-induced OA。从力学上看,circ_0001598 il - 1逆转β介导细胞增殖和细胞凋亡mir - 127 - 3 - p。这可能提供一种新的治疗骨关节炎的策略和方向与重要的意义。

数据可用性

仿真实验数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。