文摘
背景。小细胞肺癌(SCLC)预后不良,容易产生耐药性。有必要寻找可能的影响因素SCLC化疗不敏感。因此,我们提出了一个信使rna网络跟踪SCLC的化疗不敏感。方法。6个样品的SCLC患者招募RNA序列。TopHat2和袖扣是用来进行差异分析。应用泛函分析。最后,多维验证申请验证我们得到的实验结果。结果。本研究是一个审判的一线化疗后6 SCLC患者的耐药性。排名前十的表达下调的基因差异表达chemo-insensitive组SERPING1, DRD5, PARVG, PRAME, NKX1-1, MCTP2, PID1, PLEKHA4 SPP1, SLN。信息由Wnt信号( )是最明显的富集在生物过程,而系统性红斑狼疮( ),酒精中毒( ),在癌症和转录misregulation ( )是前三的KEGG通路。在多个公共数据库,我们还强调了和验证糖酵解和糖质新生途径的重要作用和相应的基因在SCLC chemo-insensitivity。结论。我们的研究证实了一些SCLC化疗insensitivity-related基因,生物过程,和途径,从而构建chemotherapy-insensitive SCLC网络。
1。介绍
小细胞肺癌(SCLC)是一种神经内分泌肿瘤,仍是最致命的癌症之一(1]。手术SCLC仅限于早期阶段(2]。化疗是治疗小细胞肺癌的一线和二线标准(3]。依托泊苷/顺铂(EP) [4)和依托泊苷/卡铂(EC) (5)是临床上用于有限的疾病(LD) SCLC (ED) SCLC和广泛的疾病。顺铂/伊立替康是申请LD-SCLC (JCOG0202) [6]。Topotecan [7),伊立替康(8),吉西他滨(9,很多人往往选择复发或难治性小细胞肺癌。SCLC患者,有一些临床试验研究更有效的联合治疗方案。例如,TORG 0604路说明了卡铂的临床疗效和安全性结合伊立替康和序贯胸放射治疗患者(泰爱泰党)LD-SCLC [10]。ED-SCLC患者,2511年ECOG-ACRIN研究旨在评估EP结合veliparib或安慰剂的疗效[11]。尽管如此,仍有一些SCLC患者对化疗不敏感,影响临床预后严重12,13]。在转换,循环肿瘤细胞被用于疗效评价和预后预测(14]。然而,在SCLC化疗耐药性的机制是复杂的(13,15]。因此,有必要寻找更多可能的影响因素SCLC化疗不敏感。
信使核糖核酸(mRNA)从DNA转录并携带相应的遗传信息为未来提供必要的信息翻译成蛋白质(16]。以往进行的调查显示,强大的耐药性与mrna和基于RNA序列(RNA-Seq)。例如,种代号为ABCB1的紫杉醇耐药与mRNA表达(17]。等mrna FBXW7记录是耐吉非替尼和促进了肿瘤的发展18]。因此,我们建议mrna在SCLC化疗不敏感。
本研究着手构建mRNA网络SCLC的化疗不敏感。我们认为药物不敏感的原因从四个方面:基因,生物过程,KEGG通路,突变的药物靶点。基于RNA-Seq和微分分析、调节和表达下调基因被确定。之后,基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)分析。我们也做了多维验证研究假说的实验。
据我们所知,本研究提出了一个新的方向SCLC的耐化学性。一些基因和通路,以前从未透露它们的功能是显示在我们的研究中。因此为今后治疗提供了新策略。重要的是,多个公共数据库完全用于进一步验证我们得到的实验结果。
2。方法
2.1。数据采集
招募病人肺活检对诊断后从2018年10月到2019年2月在上海肺科医院,6男SCLC患者仍然是最后。他们签署了知情同意。实验协议收购上海肺科医院伦理委员会许可(19]。
2.2。RNA-Seq分析
测序图书馆之前,需要提取总RNA后部分被诊断为SCLC病理学家。是提取新鲜冷冻SCLC组织RNeasy 96普世组织工具包(美国马里兰州盖瑟斯堡试剂盒,,)。RNA隔离后,提取效果是通过琼脂糖凝胶电泳检测(热科学、生物分析仪2100;美国安捷伦科技)。Nano-Drop分光光度计(Nano-Drop 1000光谱仪)是下一个用于确定的质量和浓度的总RNA (1.7 < OD260 / OD280 < 2.0)。
这个过程的下一步是测序图书馆的建设。合成了双链cDNA逆转录反应,增加了“A”的3′末端(美国Illumina公司,圣地亚哥,CA)。在这个过程中,Illumina公司TruSeq RNA建成。
利用电泳后提取双链cDNA片段,合适的片段被孤立。然后,DNA集群放大是由定量聚合酶链反应。DNA扩增子被线性化到一个链。最后,进行高通量RNA-Seq使用Illumina公司HiSeqTM 2000平台19]。
2.3。微分的效用分析
TopHat2 [20.和袖扣21)被用来分析RNA-Seq数据。RNA-Seq读取被TopHat2映射到参考基因组。后来,多重序列比对和转录丰度是由袖扣。因此,差异表达基因(度)可以被识别。
基于袖扣包(袖扣,Cuffmerge、Cuffcompare Cuffdiff),成绩单是组装。然后,记录组件比较注释和合并。最后,度被发现。我们选择意味着褶皱变化(FC)基因表达的相对丰度。在完成分析袖扣包,搭配t显著性差异分析以及执行在不同的组。
2.4。功能和通路富集分析
功能富集分析像去22- - - - - -24)和KEGG浓缩等通路富集分析分析(25,26]了。R版本2.15.1 (http://www.r-project.org)是利用微分基因可视化。 没有统计学意义。
2.5。多维验证
在支持我们的实验结果,多维验证用于减少偏见。AmiGo2软件被选为进一步去分析(http://amigo.geneontology.org/amigo/landing)。KEGG数据库路径(27)是用于验证大大丰富通路在这项研究。通路卡(28]当时申请主要KEGG通路中的基因。讨论了这些主要基因的影响在一些公共数据库从组织(Genotype-Tissue表达式(GTEx) [29日],PROGgeneV2 [30.],cBioportal [31日),和人类的蛋白质图谱32]),细胞(肿瘤细胞系百科全书(CCLE) [33]和Oncomine [34(Metascape[]),分子35和字符串36)(图1)。
所有的流程如图2。
3所示。结果
3.1。SCLC患者的临床特征
本研究是一个审判的一线化疗后6 SCLC患者的耐药性。的平均年龄为64.2岁。这些病人都是男性和吸烟者。两人LD-SCLC,其余在ED阶段。其中,4名患者肿瘤转移而两个没有。只有其中一个得到与EP治疗计划。其他采用EC。其中的一半是部分响应(PR),而另一半是进步的疾病(PD)或稳定的疾病(SD) [19]。
3.2。RNA-Seq结果的特性
我们选择总吞吐量,读取计算,处理,加工,和总映射特性RNA-Seq关键点的分析。所有这些数据没有明显不同公关组和SD + PD组。表1概述了RNA-Seq功能两组。
3.3。差异表达mrna
基于R软件,我们分析数据和选择度。我们还确定了FC > 2和的绝对值值的配对t以及小于0.05的标准差异表达mrna。排名前十的表达下调基因差异表达chemo-insensitive (SD或PD)组织相比在chemo-sensitive (PR)组织SERPING1, DRD5, PARVG, PRAME, NKX1-1, MCTP2, PID1, PLEKHA4, SPP1和SLN(表2),而AC008763.3、DBX2 ZIC1, CHRM3, ZNF541, AGBL1, TNNI2, MTUS2, CCDC36, STAG3前十名调节度(表3)。
3.4。类别和KEGG通路
三个类别去申请公关和SD + PD组在这个研究:细胞组件(CC),生物过程(BP)和分子功能(MF)。给出的条形图的计数和描述三个功能(图3)。在CC是轴突部分(:0033267, )。列高度暗示基因在每一项的数量。去浓缩后分析,结果前10名的术语表4。信息由Wnt信号(去:0198738)是最重要的丰富GO-BP函数由于最低p值( )。其他丰富GO-BP函数确定Wnt信号通路(:0016055, ),Ras蛋白信号转导(去:0007265, ),和其他条件。
dmg被分配到KEGG通路。基因的数量在每个描述可以清楚地看到在图4。前三丰富KEGG通路是系统性红斑狼疮(hsa05322, ),酒精中毒(hsa05034 ),和转录misregulation癌症(hsa05202p= 0.00227988)(表5)。
3.5。多维验证
我们选择AmiGo2软件找到之间的关联意义的上述条款。去除了两届(去:0000982,:0033267),广泛的相互作用被发现在去其他条款和条件。在整个数据库中,排名前十的位置去条款中提到的表4是说明(图S1)。
考虑新陈代谢在癌症发展的至关重要的作用,发展,和转移,KEGG结果的基础上,我们提出了一个假设,糖酵解和糖质新生途径可能在SCLC发挥不可忽视的作用。来验证我们的假设,首先,KEGG数据库路径(37)申请糖酵解/糖质新生途径(图S2)。然后,糖酵解和糖质新生pathway-related基因是从途径证明卡(38]。磷酸甘油酸酯变位酶2 (PGAM2),磷酸甘油酸酯激酶1 (PGK1) glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) triosephosphate异构酶1 (TPI1)和丙酮酸激酶M1/2(11)是糖酵解的代表性基因/糖质新生途径。随后,一些数据库被用于验证的作用通路从三个层次:组织,细胞,分子,例如,GTEx(组织)(图S3(图),PROGgeneV2(组织)S4),cBioportal(组织)(数据S5- - - - - -S11),人类的蛋白质图谱(组织),CCLE(细胞)(图S12(图),Oncomine(细胞)向(图),Metascape(分子)S14系列(图)和字符串(分子)S15)。所有的细节可以在表中找到S1和S2。PGAM2的表情,PGK1、GAPDH TPI1, PKM被发现在肿瘤组织或细胞系(数字S3- - - - - -S15)。在图S4短,高GAPDH表达式与总生存期(OS)在肺癌( )。cBioportal数据集,生存分析建议PKM突变表示预后不良 ,图S5)。然而,PKM突变组的样本容量太小,充分反映突变PKM的状态和预后之间的关系。重要的是,PGK1、GAPDH和TPI1没有突变的肿瘤组织从cBioportal数据集(图S5)。此外,在cBioportal队列81临床SCLC患者拥有RNA-Seq数据,我们探索的主要基因的表达水平之间的关系在糖酵解/糖质新生途径和操作系统。如图S6、高PKM表达与更好的预后( )。然后,基因表达水平和临床病理特征之间的关系,包括年龄、性别、吸烟史、转移、TNM分期,估计(数字S7- - - - - -S11)。GAPDH的过度表达,PGAM2、PGK1 PKM被发现年龄在65岁以上的患者。男性与女性患者相比,SCLC患者显示更高的PGAM2和PGK1表达式。GAPDH、PGAM2 PGK1, PKM也从吸烟者SCLC组织中高度表达。然而,没有明显的结果被发现(包括基因表达与临床病理的特性 )。糖酵解的重要基因之间的广泛联系/糖质新生通路被发现(图S14系列和S15)。总的来说,这些多维验证支持认为糖酵解异常/糖质新生途径可能与SCLC的化疗不敏感。
简而言之,度的网络公关和SD + PD组了。调节和表达下调度公关组中被发现。DEGs-related去条款和KEGG信号通路也说明。最后,科学假说产生如下:KEGG SCLC的化疗不敏感相关信号通路,条款,如系统性红斑狼疮、糖酵解/糖质新生途径,和Wnt信号。
4所示。讨论
尽管各种治疗,全身化疗仍然是主要治疗SCLC (39]。有几个临床试验。例如,ipilimumab或安慰剂加依托泊苷和铂用于ED-SCLC患者的疗效和安全性(40]。TORG 0604年旨在评估卡铂的作用结合伊立替康和泰爱泰党在LD-SCLC [10]。在我们的研究中,分别EP和EC是提供给这些病人。他们发表在《JCOG 9702的功能试验。它揭示了老人的疗效。EP是传统治疗和EC,另一种是因为类似的姑息分数(41]。近年来,多注意节拍器的化疗。每周紫杉醇作为二线治疗复发性是可行的SCLC (42]。然而,SCLC的耐药性是不可避免的,尽管它最初对化疗敏感12,13,43]。高复发率,SCLC化疗不敏感的探索因素是至关重要的。
我们提出基因发挥作用的化疗不敏感。先前的研究已经提到像MRP基因,凋亡[44],EZH2 [45),和许多其他人。在本文中,我们确定了度通过RNA-Seq公关和SD + PD组之间。可以排序、分类和比较基因表达(46]。通过检测信使rna的转录,SPP1的差别我们的研究证明了对这些基因与SCLC化疗耐药性有关,这是与以往的研究一致47]。最近,通过体内和体外实验中,唐等人发现SPP1诱导非小细胞肺癌(NSCLC)发展与顺铂耐药性48]。RNA-Seq和差异分析,我们还发现像DRD5表达下调的基因之间的相关性,PRAME, SERPING1和化疗不敏感。DRD5,细胞表面受体相关信号转导相关的(49),可以抑制肿瘤的生长,促进自噬细胞死亡(50]。已经有大量的调查PRAME。PRAME的表达与肿瘤组织学和吸烟状态(51]。它入侵中发挥了重要作用52)和转移(53的肺癌。对于癌症患者来说,过度的PRAME是经常与不良预后相关(54,55]。此外,SERPING1代表的低表达在前列腺癌预后不良56]。所有这些结果暗示他们经常表达下调肿瘤导致差别和对这些肿瘤的发展和转移。然而,报告他们的角色在有限目前耐药性。这是我们未来需要进一步研究。STAG3和CHRM3调节我们的研究可以看作是化疗resistance-associated肿瘤基因。突变STAG3通常与卵巢功能早衰(57]。表达下调的表达STAG3 BRAF-mutant黑色素瘤细胞的敏感性降低BRAF抑制剂(58]。CHRM3似乎在胃癌患者调节响应ramucirumab [59]。尽管他们扮演某些癌症的耐药性,仍然没有明确的证据证明他们在SCLC目前相关功能。因此,更多的研究是必要的澄清STAG3和CHRM3是否导致SCLC化疗不敏感。
功能和通路富集分析也用于我们的研究。基于去KEGG分析公关和SD + PD组,生物学特性的基因和基因调控网络和基因功能之间的关系被发现(60]。后去分析,我们知道在细胞中不同的活动。在这种情况下,SCLC化疗不敏感主要是与信息由Wnt信号,Wnt信号通路,在细胞水平和Ras蛋白信号转导。后来,AmiGo2软件申请相关的基因去上面提到的条款和条件在整个数据库的位置。系统性红斑狼疮、KEGG通路被证明是公关组中表达下调。近年来,mrna一直被认为是自身免疫性疾病密切相关(61年]。证据显示分层系统性红斑狼疮和协会的各种类型的癌症,包括肺癌(62年- - - - - -65年]。它是受基因区域6 p21-22与肺癌密切相关。然而,这是与肺鳞状细胞癌(66年]。酗酒是另一个显著下调公关组的途径。系统性红斑狼疮和酒精中毒也起到一定的作用在米托蒽醌在NSCLC的不敏感67年]。SCLC的相关研究是不够的。我们的团队已经确认上面的两条途径分析之前长非编码rna和小分子核糖核酸(后19]。信使rna的相同的结果证明这一次。
此外,我们发现的异常糖酵解/糖质新生KEGG通路在SCLC化疗抵抗。与一个值小于0.05,它是我们研究的一个重要途径。它属于葡萄糖代谢通路网络,SuperPath [68年,69年]。就像任何其他类型的癌症,SCLC细胞使用有氧糖酵解的主要来源三磷酸腺苷(70年]。值得注意的是,高总损伤糖酵解(TLG)与预后差的SCLC (71年]。A-disintegrin-and-metalloproteinase 12秒(Adam12S),蛋白质与组织成长和发展,促进了SCLC细胞增殖,迁移和入侵通过上调病原在糖酵解酶己糖激酶1 (72年]。降低糖酵解可促进肿瘤入侵SCLC的细胞群(73年]。Monocarboxylate转运体1 (MCT1)抑制剂称为AZD3965杀死那些glycolysis-dependent肿瘤细胞乳酸通过运输监管,尤其是在SCLC患者肿瘤的表达MCT1和缺乏MCT4 [74年]。目前,癌细胞在能源生产的依赖糖酵解已经得到充分的研究。也有一些研究糖酵解和糖质新生化疗不敏感的功能。耐药肿瘤细胞表现出较高的糖酵解。新兴证据表明葡萄糖代谢异常导致抵抗癌症治疗(75年,76年]。,针对糖酵解途径被认为是一个新的策略来克服耐药(77年,78年]。糖酵解改变可能与干细胞的肿瘤(72年]。癌症干细胞是一种单色的细胞群中存在肿瘤细胞组和高耐化疗药物(75年]。在胰腺癌,l型氨基酸转运蛋白2 (LAT2)促进糖酵解和吉西他滨的敏感度降低了调节glutamine-dependent mTOR [79年]。过度的FGFR4可以增加葡萄糖代谢,导致乳腺癌耐化学性80年]。在肺癌中,另一个重要发现是发现。肝细胞生长因子(HGF)调节分泌乳酸是导致连续自适应抗抗酪氨酸激酶抑制剂(81年]。虽然已经有大量的研究机制的癌症化疗不敏感,很少有关于糖质新生。SCLC的机制还有待证实。进一步验证的结果异常糖酵解/糖质新生途径在SCLC耐化学性KEGG分析,多维执行验证。我们选择的五大基因通路卡糖酵解/糖质新生途径。然后,我们把它们放进一些公共数据库来验证通路的功能。结果是一样的,在KEGG分析。
尽管这些研究显示重要的发现,他们也有局限性。研究结果需要进行体内和体外实验。这是我们下一步将做什么。此外,我们必须提到小样本大小可能对结果有一定影响。大量的SCLC患者需要未来的研究。
5。结论
我们的研究证实,基因,如SERPING1 DRD5, PARVG参与SCLC化疗反应复杂的生物学过程。途径,如系统性红斑狼疮、酗酒和糖酵解/糖质新生也参与其中。
缩写
| SCLC: | 小细胞肺癌 |
| 信使rna: | 信使核糖核酸 |
| 走: | 基因本体论 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| GTEx: | Genotype-Tissue表达式 |
| CCLE: | 癌症细胞系百科全书 |
| LD: | 有限的疾病 |
| 艾德: | 广泛的疾病 |
| EP: | 依托泊苷+顺铂 |
| 电子商务: | 依托泊苷+卡铂 |
| 公关: | 部分响应 |
| 帕金森病: | 进步的疾病 |
| SD: | 稳定的疾病 |
| 舰队指挥官: | 褶皱变化 |
| 答: | 蜂窝组件 |
| 英国石油公司: | 生物过程 |
| MF: | 分子功能 |
| PGAM2: | 磷酸甘油酸酯变位酶2 |
| PGK1: | 磷酸甘油酸酯激酶1 |
| GAPDH: | Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 |
| TPI1: | Triosephosphate异构酶1 |
| 11: | 丙酮酸激酶M1/2 |
| TLG: | 总损伤糖酵解 |
| Adam12S: | A-disintegrin-and-metalloproteinase 12岁 |
| LAT2: | l型氨基酸转运蛋白2 |
| 操作系统: | 总体生存率。 |
数据可用性
共享排序数据可以获得相应的作者要求通过电子邮件((电子邮件保护))临床和现实原因。
信息披露
培新陈、吴落幕和嘉裕是第一作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究的部分资金支持中国国家自然科学基金(81802255)、上海肺科医院的临床研究项目(FKLY20010),年轻人才在上海(2019 QNBJ),“梦想导师”优秀青年人才项目(fkyq1901),上海肺科医院的临床研究项目(FKLY20001),呼吸医学,一个关键的临床专业建设项目在上海,多学科协作系统的推广和应用肺非传染病、上海肺科医院的临床研究项目(fk18005), 2019年重点学科(肿瘤),上海市科学技术委员会项目(市科委的项目),上海肺科医院科研项目(fkcx1903),上海市卫生和计划生育委员会(2017 yq050),我校的同济大学创新训练项目,重点项目领导人才(19411950300),和青年项目上海医院协会医院管理研究基金会(Q1902037)。
补充材料
表S1:多维外部验证结果基于多个数据库。表S2:总结多维外部验证结果基于多个数据库。图S1:前十的协会和位置在AmiGo2软件。图S2:糖酵解/糖质新生途径chemo-insensitive组。图S3:主要由GTEx KEGG通路中的基因,这些基因之间表达的比较。图S4:主要由PROGgeneV2 KEGG通路中的基因:(一)PGAM2 PGK1 (B)和(C) GAPDH。图S5:突变状态主要由cBioportal KEGG通路中的基因;PGAM2相关性突变状态(A)、(B) PGK1, (C) GAPDH, (D) TPI1, (E) PKM生存和基因表达。图S6:之间的关系主要KEGG通路中的基因表达水平和生存在cBioportal:(一)GAPDH, (B) PGAM2 PGK1 (C)和(D) 11。图S7:之间的关系主要KEGG通路中的基因表达水平和年龄cBioportal:(一)GAPDH PGAM2 (B), (C) PGK1和(D) 11。 Figure S8: relationship between expression levels of main genes in the KEGG pathway and gender in cBioportal: (A) GAPDH, (B) PGAM2, (C) PGK1, and (D) PKM. Figure S9: relationship between expression levels of main genes in the KEGG pathway and TNM staging in cBioportal: (A) GAPDH, (B) PGAM2, (C) PGK1, and (D) PKM. Figure S10: relationship between expression levels of main genes in the KEGG pathway and smoking history in cBioportal: (A) GAPDH, (B) PGAM2, (C) PGK1, and (D) PKM. Figure S11: relationship between expression levels of main genes in the KEGG pathway and metastasis (M) in cBioportal: (A) GAPDH, (B) PGAM2, (C) PGK1, and (D) PKM. Figure S12: main genes in the KEGG pathway by CCLE; the expression level of (A) PGAM2, (B) PGK1, (C) GAPDH, (D) TPI1, and (E) PKM in the CCLE database. Figure S13: main genes in the KEGG pathway by Oncomine; the different expressions of (A) PGAM2, (B) PGK1, (C) GAPDH, (D) TPI1, and (E) PKM in lung cancer in Oncomine database. Figure S14: network of enriched terms and protein-protein interaction network by Metascape: (A) colored by cluster ID, nodes that share the same cluster ID are typically close to each other; (B) colored byp值,包含更多基因往往更重要p价值;(C)基因中识别的蛋白质相互作用网络和MCODE组件列表。图S15: coexpression基因和蛋白质相互作用网络的字符串:(A)基因coexpression地图;(B)对PGAM2蛋白质交互网络,PGK1, GAPDH TPI1, 11。(补充材料)