文摘

三维(3 d)印刷代表了快速成型的关键技术,允许简单,快速,低成本制造。在这项工作,3 d打印申请定制组件的内部生产的机械拉伸生物反应器与潜在应用心脏组织工程与力学生物学研究。住房和汽车文化室住房开发功能永久性部分,旨在解决文化室位置和保证电机防水,分别。创新样本架原型机专门设计,3 d打印,薄而柔软的生物样品循环拉伸文化。制造组件测试内部和在细胞生物学实验室。此外,拉伸测试和有限元分析进行调查的样本架原型机的性能。所有组件显示合适的演出的设计、易用性和功能。基于3 d打印技术,生物反应器优化完全执行内部,从设计到制造、启用自定义自由,严格design-to-prototype时机,最终有效测试成本和时间,提高生物反应器开发过程。

1。介绍

组织工程的目标是生成在体外功能仿生替代品生物组织和器官修复或替换受损(1]。的三个主要组件在体外组织发展如下:(1)细胞,负责新组织合成;(2)支架,提供物理和结构支持细胞和生化信号;(3)仿生在体外文化环境,对于复制在活的有机体内环境和信号(2]。许多力学生物学研究表明,除了细胞、生物材料、化学信号,物理刺激发展中发挥基础作用生成的原生组织和组织工程的替代品(3- - - - - -7]。在这个角度来看,生物反应器是创新和技术设备提供适切地改造在活的有机体内例如培养条件,应对传统二维的局限性,静态的,和手动细胞/组织文化。特别是,生物反应器的设计文化细胞/组织在三维(3 d)环境中,在监测和控制条件(例如,pH值,O₂、葡萄糖、乳酸)和用户定义的物理刺激(如拉伸、压缩、电脉冲和流体剪切应力)。可以使用它们作为文化模型系统,进行调查在体外细胞/组织发展和组织成熟chemicophysical刺激的影响,或作为生产系统,最后指导干细胞命运和工程组织的形成在体外(8- - - - - -14]。此外,当配备技术解决方案实时闭环监控和控制文化条件下,生物反应器可以允许自动化的文化进程,导致高质量、可再生的、标准化的细胞/组织文化根据工业和临床应用。

由于这是一个相对年轻的和多方面的研究领域,生物反应器通常是高成本的设计和内部开发定制的设备,但通常原型和/或永久部分是外包生产的外部公司。事实上,他们必须满足严格的设计、质量、功能要求的良好实验室规范(GLP)采用细胞生物学/组织工程实验室(15]。特别是,在这样的实验室细胞/组织文化是由使用无菌设备,层流罩下不育的维护工作,并使用孵化器为温度(37°C),湿度(85 - 95%)和二氧化碳(5%)维护。因此,生物反应器应保证生物相容性,sterilizability高压釜(优先),易于组装和使用,长期的文化进程的水密性和可靠性孵化器(16]。在这种情况下,三维(3 d)印刷,基于计算机控制的逐层沉积的材料,代表了一个关键技术为快速成型制造的组件进行测试和永久性的功能部分。事实上,与传统(即减去加工流程。,milling, turning, and drilling), 3D printing allows easy, rapid, and low-cost manufacturing of complex geometries by single-step processes. This entails clear advantages for the definition of the final bioreactor design and during the fabrication phase, in terms of design customization and flexibility, in-house manufacturing, and reduced times and costs for production and testing, leading to an overall improvement of the bioreactor development process. Recently, a small but growing number of groups are adopting 3D printing for the development of customized culture systems. Raveling and colleagues used fused deposition modelling (FDM) to manufacture a low-cost, highly customizable mechanical bioreactor for investigating soft tissue mechanics [17]。Schneidereit等。3 d打印室文化包括电极的电刺激和并行微观评价(18]。史密斯和他的同事开发了一个3 d打印的生物反应器平台为3 d-bioprinted组织构造设计文化,灌注,观察和分析19]。

在这项工作中,我们应用FDM-oriented为最近开发的优化设计和制造机械拉伸生物反应器与潜在应用心脏组织工程与力学生物学研究,旨在提供循环单轴拉伸生物样品(20.]。特别是,3 d打印技术被用于内部制造生物反应器文化室住房和汽车住房、设计功能部分的修复文化室位置和保证电机防水,分别。此外,创新样本架原型机专门设计,3 d打印举行薄和软生物样品和实验和计算测试在易用性和扣人心弦的性能,在最终产品生物相容性和autoclavable材料。组装、可用性和功能测试确认所有3 d打印组件的出色的表现,这强烈导致了生物反应器的开发过程。

2。材料和方法

2.1。生物反应器的设置

生物反应器,已经设计成孵化和优化对前一版本(20.),是由三个模块子系统:文化单元,电机单元和控制单元(图1)。文化单位致力于为无菌样品的机械刺激下的文化。的运动单位被修改和缩小,房子汽车,通过轴连接到文化单位提供单轴机械刺激。控制单元的发展超出了本研究的目的,使机械刺激的设置参数和电机控制,必须位于外的孵化器。在此设置中,四个生物反应器组件(文化室住房、汽车住房,和两个示例持有者)设计具体要求和制造了FDM要么是永久使用功能部分(文化室住房和汽车住房)孵化器内或工作原型(样品持有人)生产前测试功能和易用性可以使和autoclavable材料的生物相容性的最后一个组件。

2.2。FDM-Oriented设计和制造

2.2.1。设计要求

生物反应器设计过程需要满足特定的设计要求指导下GLP-compliance而言,使用性能和FDM制造业(表1)。特别是,整个生物反应器系统应该满足GLP原则,规则和标准的质量体系组织和研究实验室的工作条件,以确保一致性、可靠性、再现性和非门诊医疗质量研究(15]。因此,生物反应器应该易于组装、使用、清洁与标准设备(层流罩、高压釜、孵化器、手套和镊子)和过程的细胞生物学/组织工程实验室。对空间的需求,生物反应器必须放在孵化器货架(max 40厘米×50厘米×30厘米),此外,新的FDM-printed组件(即必须与先前存在的几个部分。、文化室、电机轴、连接)。由于孵化器内的高湿度,水密性是强制性的,以防电气和电子部件保证运行可靠,特别是对于长期的文化过程。模块化的需求来自于需要担保的可访问性和易用性在装配/拆卸和清洁程序,和一起定制,它允许提供适应性强、可互换的,可伸缩的解决方案不同的细胞/组织应用程序使用相同的生物反应器系统。特别是,在这种情况下,一个特定的扣人心弦的系统设计要求来自需要持有和文化下循环拉伸薄和软基板/组织心脏组织工程与力学生物学研究。最后,至于现有文化室,组件是在直接接触培养基和/或细胞/组织,表中列出的具体设计要求1以前完成(20.]。

并行,因为需要产生内部定制组件的快速、灵活、低成本的过程,FDM工艺选择制造业。Stratasys公司开发的FDM工艺,Inc .(伊甸草原,明尼苏达州,美国),是基于一个灯丝的热塑性材料,和最常见的ABS (21),加热对其熔点,挤压通过一个喷嘴,最终沉积形成结构组成的固化层(22]。特定的生产设计要求由FDM技术,为限制存在的最小可制造的大小和特性,如孔和雕刻的细节23]。在细节,支持和不支持的墙壁的厚度应该至少0.66毫米。至于过剩的倾向,对印刷适性的原因,最大值是45°;然而,在这项工作,倾向于表面和顺向的阶梯状效应避免为了便于清洗的需要。垂直孔的最小直径是2毫米,而反弹连接部件之间设置等于0.1毫米。最后,螺纹孔可能避免由于磨损造成的重复装配过程。

2.2.2。设计和制造

前面描述的设计要求,考虑到文化室住房、汽车住房,和样品持有人原型使用商业设计的计算机辅助设计(CAD)软件Solidworks 2017(达索系统公司股价、Velizy-Villacoublay、法国)。详细,文化室住房是为了解决可移动文化室的位置,维护一个精确的校准和文化之间的距离定义单元和运动单位,以适应整个系统内的孵化器架子上。电动机的住房被设计为一个水密从孵化器湿度箱保护电动机和电气连接。样品架原型,文化内安装室,专门设计来测试一个创新的功能夹系统旨在薄和软生物样品(24,25]。

FDM制造执行上传设计STL文件使用3 d打印机的打印机软件CatalystEX和Stratasys公司uPrint SE + (Stratasys公司,伊甸草原,明尼苏达州,美国)。ABS plus-P430热塑性印刷材料(Stratasys公司,伊甸草原,明尼苏达州,美国),耐用足以表现几乎一样的生产部分(由制造商宣布,物理性质列于表2(26]),结合使用SR30可溶性物质支持。所有组件都打印设置的最低层厚度(0.254毫米)来减少表面粗糙度和优化精度,实施反击(0.1毫米),以避免干扰在安装过程和设置固体填充选项和智能支持的策略。对于每一个组件,印刷方向定义平衡循环特性和决议的支持材料/时间消费,导致不同的印刷时间(打印机可以构建速度比它可以沿着在XY平面Z轴)[27]。支持材料然后手动删除,避免清洁剂的使用浴。图2显示了采用设计到制造工作流。然后打印组件连接螺母和螺栓。

2.3。测试

3 d打印组件进行组装、耦合,和整个生物反应器的功能设置。初步进行内部测试。特别是文化之间的耦合腔室的住房是检查,后者是螺纹的刚性平面基础。汽车房屋组装和固定在刚性平面基础。样品架原型机在文化室组装和安装。文化室移动轴连接到运动单位。最后,控制单元电连接到电机单元,和一个解释循环机械刺激(位移= 1毫米和频率= 1 Hz)运行。在此阶段,以下特性检查:耦合与先前存在的组件,孔对齐,文化单位和运动单位对齐。先后,训练实验室运营商测试整个生物反应器系统在细胞生物学实验室。在细节中,生物反应器文化室组件是热压处理过的,和整个系统的装配过程进行层流罩下。 To test the bioreactor functionality (including sterility maintenance), the culture chamber was filled with the culture medium, the assembled system was placed in an incubator, and the mechanical stimulation was switched on and run for 5 days. During the stimulation process, possible interferences between moving and fixed components were checked. At the end of the test, the watertightness of the motor unit, potential deformations of the 3D-printed components, and possible contamination were assessed.

最后,扣人心弦的样品架原型机的性能评估进行单轴拉伸测试和有限元分析(FEA)并与商业钛的性能掌握适切地用于软组织特征(TA仪器公司,新的城堡,德,美国)。对于实验测试,样品架原型机是安装在材料试验机QTest10 (MTS系统公司,伊甸草原,明尼苏达州,美国)一起商业钛侧控制。为了评估的适用性原型薄而柔软的生物样品,两个样品的人类脱细胞皮肤(= 5毫米,长度= 10毫米,宽度和厚度= 0.6毫米)(28试样夹夹紧)和钛夹,然后单向地拉伸应变征收税率为3.2%⁻¹(计量长度= 5毫米)(29日]。作为比较,两个额外的样本测试施加相同的条件但使用两个钛。载荷和位移记录监控曲线趋势(30.因为减少在斜坡或突然的步骤是扣人心弦的失败和下滑的指标。

此外,调查样本的接触压力分布对持有人或钛夹样品控制配置,使用非线性有限元分析软件HyperMesh / HyperView 2017 (Altair工程,特洛伊,密歇根州)和有限元分析2017(达索系统公司股价、Velizy-Villacoublay、法国)。样品架和控制钛被模拟为刚体,并且只与样品接触的表面是离散的R3D4元素。样品被建模为一个矩形平行六面体(宽度= 5毫米厚度= 0.6毫米),网状C3D8元素,视为线弹性材料。比较接触压力的结果,同样的样品接触表面(= 5毫米宽度和长度= 3.2毫米)既为配置。无摩擦接触样品持有人/表面和样本的控制。1 N的力是应用于移动样品持有人/控制的一部分,而各自的固定部分被完全约束。

3所示。结果与讨论

3.1。FDM-Oriented设计和制造

文化室住房是一个l型底盘(宽度= 118毫米,长度和高度= = 147毫米78毫米)组成的一个平面基础文化室,两个侧边缘,和一个垂直墙设计保持距离定义的一致性和文化单位和运动单位(图3)。文化之间的耦合腔及其文化室住房是由滑动到住房和固定螺丝(图3)。

电动机的住房是一个防水盒(长度= 130毫米,宽度= 95毫米,和身高= 65.5毫米)设计用于保护电动机和电气连接从孵化器湿度和由两个主要部分组成:一个容器和盖子(图4)。修复容器盖子,四个螺丝和螺母采用集。保证水密性,(我)一个硅垫片放置在容器和盖子之间,(ii)的防水插座(包括垫片)与控制单元连接电缆固定在容器侧壁,扩孔和(iii)橡胶波纹管通过轴与电机突出的容器壁前的文化单位。

引导扣人心弦的薄而软的设计要求样品和灵感来自商业解决方案测试细电线,样品架原型机的创新设计(最大宽度= 54毫米,最大高度= 39.5毫米)是基于一个引导移动圆柱杆,当推由中央螺旋连接到一个平面的向导,沿着两个幻灯片横向引导与控制基础(图5(a))。扣人心弦,移动杆推动样品结束对圆柱周围的基地造成样品包装的控制杆。以确保稳定的扣人心弦的样本,掌握适当的运动之间的耦合杆和基础保证了appositely-sized hemicylindrical槽控制基础(数据5(一),5(c))。样品持有人允许最大宽度的样本的扣人心弦的20毫米。6.2毫米的最大打开位置的定位允许通过使用镊子(图示例5(b))。修复外侧指导控制基础上,专门的蛀牙是为了适应螺纹螺母(图5(b))。

图6显示了组装生物反应器系统(除了控制单元)组成的文化单位和刚性平面上的运动单位固定基地(长度和宽度= = 342毫米128毫米)。文化室安装在其住房和通过轴连接到电机放置在电机住房。文化内的扣人心弦的系统室由一个移动试样夹,螺纹运动特性,和固定样本架固定在对面的文化室壁(图6 (b))。

FDM的制造过程需要不同的持续时间取决于印刷组件。例如,尽管它们相似的卷,移动杆的印刷过程导致了超过四倍以上的过程制造平面指南,主要是由于印刷方向。事实上,以保证最高的分辨率杆表面,该组件是印有其长轴平行Z打印机轴。在表3列出印刷,印刷材料卷,卷用于每个组件和支持材料。

3.2。测试

3 d打印的内部装配组件及其耦合与既存的生物反应器部分没有任何问题。详细,孔的位置允许性交容易文化室住房和汽车住房刚性平面上的基础。同样,汽车住房盖子很容易耦合到电机的容器。室陷入其住房、文化和正确的符合运动单位验证。样品架原型机在文化室组装和安装。对所有组件,一个合适的耦合与先前存在的部分确认。

整个生物反应器系统的易用性和性能测试在实验室细胞培养实验室由训练有素的操作符。层流罩下的生物反应器组件的装配很容易和快速(图7(一))。性能测试是将生物反应器在孵化器和运行5天(图的机械刺激7 (b))。在工作环境中,系统并没有显示出任何故障,没有注意到,移动和固定组件之间的干扰以及住房确认电动机的水密性。在测试结束时,既不变形,也不观察培养基污染。

测试扣人心弦的小说样品架原型机的性能,生物样品进行单轴拉伸测试使用的测试机QTest10和两个不同的扣人心弦的配置:(i)示例(图holder-titanium控制8(一个));(2)钛grip-titanium(图的控制8 (b))。在第一个配置中,每个样本很容易放置在样品持有人使用镊子,坚决夹作用在中央螺旋缠绕在移动杆与样品结束。在测试中,没有观察到样本下滑,在破裂,每个样本在中央截面,确定适当的载荷分布在扣人心弦的地区。第二个配置也获得了类似的结果。图8 (c)显示了四个荷载位移曲线,重新在0.5 N负载,获得抗拉测试执行与配置。除了机械行为的可观测intravariability典型的软组织,每个曲线增加顺利破裂,没有突然的斜率减小,对配置。拉伸测试确认样品持有人原型与商业钛控制扣人心弦的性能而言,它适用于FDM-based制造业。

此外,有限元分析研究样品表面的接触压力的分布示例持有人或钛夹紧控制配置。有限元结果表明,试样夹配置保证一个更统一样本表面的接触压力分布(数字9(一)和9(c);最大接触压力= 0.097 MPa)相比,钛夹,导致压力集中在外部边缘(数据的控制9(b)和9(d);最大接触压力= 0.222 MPa)。薄而软的样本,接触压力绝对浓度应该避免,因为他们可能会引发样本。有限元分析结果提供了进一步的证据,证明样品持有人设计的适用性。

关于可能的局限性,组件所使用的FDM技术可以表现为各向异性行为,表面粗糙度高、几何精度差,和内部缺陷的存在31日]。然而,在这部作品中,制成部件和执行测试并没有受到这样的限制。

4所示。结论

在这项工作,3 d打印申请内部设计和生产两个功能部分和两个原型组件机械拉伸生物反应器与潜在应用心脏组织工程与力学生物学研究。在细节中,3 d打印室住房和汽车文化住房满足易用性和功能的设计要求,保证一致性文化单位和运动单位以及运动单位的水密性。创新样本架原型机,专门为薄而柔软的生物样本,证明其性能优良的易用性,引人入胜,从而确认适宜性设计为未来制造的生物相容性和autoclavable材料。这种方法使执行内部整个生物反应器的优化过程,从设计到制造、提供定制的自由,严格design-to-prototype时机,快速和廉价的测试。总之,3 d打印技术允许制造低成本、定制的生物反应器组件,并降低失败的风险在新概念发展的后期,提高设计和制造过程的效率。在未来的未来,越来越多的表演可打印材料的生物相容性,autoclavability,和透明度将进一步推动低成本的生物反应器的发展和定制文化设备。这将导致更多的可再生的、标准化的、高效的基本研究,未来潜力巨大常规生产的临床应用组织工程策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

g . p和m . t .贡献了同样的工作。g . P。,m . T。,D. C., and D. M. conceived the design of the 3D‐printed components and their testing. G. P. and D. C. 3D‐printed the components. F. D. M. and C. C. prepared the biological samples for the uniaxial tensile tests and tested the system in a cell biology laboratory. M. T., G. P., and G. S. performed the experimental testing. D. C. performed the finite element analysis. M. T., G. P., and G. Pi. analyzed the data. D. M. and D. C. reviewed the current state of the art. G. P., M. T., and D. C. prepared the figures. D. M. conceived and coordinated the study. G. P., M. T., and D. M. wrote the manuscript.

确认

这项工作是支持的部分意大利教育部大学和研究(研究NOP和竞争力2007 - 2013,IRMI (CTN01_00177_888744))。