基因表达变化在人类长期体外血脑屏障模型及其依赖Transwell支架材料

文摘

破坏血脑屏障(BBB)的标志是许多神经与血管的紊乱,使它成为至关重要的焦点治疗选项。然而,测试的影响药物或病理代理困难是由于潜在的破坏性的后果,这种改变正常的大脑微环境。最近,体外coculture组织模型已经开发作为替代动物实验。尽管成本低,这些平台使用合成支架防止正常屏障结构,细胞相声和组织重构。我们创建了一个可生物降解的实际上电纺明胶垫“biopaper”(BP)作为内皮/星形胶质细胞的支架材料coculture模型允许信息联络和相声。比较英国石油(BP)和传统模型,我们研究了27个基因的表达参与BBB通透性、细胞功能和内皮连接在不同的时间点。基因表达水平证明记录参与内皮连接形成的高表达,包括TJP2和CDH5, BP模型。传统的模型有更高的表达与细胞外矩阵相关的基因蛋白质,包括SPARC和COL4A1。总的来说,结果表明,BP coculture模型更具代表性健康BBB的状态,尽管这两种模型的优势可能是有用的在疾病建模。

1。介绍

血脑屏障(BBB)的独特特点提出一个相当大的挑战为研究中枢神经系统(CNS)治疗和疾病建模。脂溶性分子,气体容易分散在BBB虽然大,亲水性分子由于内皮细胞紧密连接(1]。穿越BBB的内在困难需要广泛使用相关的候选新药测试体外和体内模型。体内生物模型,如老鼠,在药物筛选分析提供有价值的信息,特别是关于中枢神经系统在自然环境复杂的影响。然而,他们是昂贵和费时,面对伦理问题,需要一个相当大的物理空间,通常没有人类结果(翻译不好2,3]。克服体内系统的缺点的一个方法是通过体外模型能够准确地模仿人类系统。体外模型系统由细胞组成的数组是一个有价值的工具屏幕前分子BBB通透性动物测试。

最常见的体外BBB平台测试包含多个transwell插入上培养的细胞类型,允许独立的文化隔间在相同的(1]。transwell插入包含半多孔的聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜。内皮细胞生长膜的一侧,而星形胶质细胞生长,创建一个简单的类似于自然BBB环境的障碍。这个基本模型的设置提供了一个近似的原生BBB微环境但体内模型相比有几个显著的缺点。膜材料,信息接触,和流体剪切应力的因素差标准transwell模型来解决。两个问题,膜材料,和联系,同时可以解决通过改变transwell插入膜材料。

Transwell插入膜屏障文化的必要构件模型、基质细胞播种是至关重要的,附件,和单层的形成。合成障碍,如聚碳酸酯或宠物,不易退化或重新通过内皮细胞或星形胶质细胞,使它成为一个“正常”的不屈的障碍BBB结构。还没有退化,膜上强加一个硬限制的程度endothelial-to-astrocyte信息联系。它一再表明,适当的基因表达和调控的BBB蛋白质需要内皮细胞和星形胶质细胞之间的直接接触4,5]。此外,单一的聚合物细胞类型之间的屏障阻止正常细胞外基质(ECM)沉积和基底膜形成,一个因素会影响BBB通透性(6,7]。综上所述,这些结论指出需要一个可生物降解膜的体外模型能够支持细胞生长和重构。

先前的研究取代了transwell PET膜实际上电纺明胶支架,标榜“biopaper,”一个内皮/星形胶质细胞coculture体外模型(8]。这21天的研究表明,biopaper coculture模型最初比标准的宠物模型渗透,至少直到第14天。在以后时间点,biopaper模型比宠物不透水,证明两个transendothelial电阻(te)测量和右旋糖酐扩散障碍。值得注意的是,细胞形态相似的两种模型,表明一个更深层次的的基因表达谱差异可能是必要的,以确定转录表达基本BBB蛋白质之间的两个模型。

到目前为止,在体外的细胞基因表达分析BBB模型是有限的只有少数基因屏障通透性有关。最近coculture模型通常只测定5 - 10基因,主要专注于内皮细胞连接蛋白,研究持续好几天(9- - - - - -11]。此外,最近的一些研究了永生化细胞系或非人类动物细胞系。虽然这个数据是重要的改善BBB模型,基因表达谱主要来自人类细胞coculture模型将是无价的。此外,一个广泛的BBB模型之间的基因表达的比较将进一步阐明每个模型系统的优点和缺点。

为了进一步描述biopaper和宠物模型之间的相似点和不同点,我们试图确定BBB-related蛋白质的基因表达的差异在不同的时间点。我们假设和信息联系和改造的能力组织脚手架将导致功能相关基因差异表达蛋白质的BBB接口,包括与整体屏障完整性和细胞功能相关的蛋白质。在这里,我们描述27-gene面板的分析,包括相关基因屏障完整性和内皮细胞或星形胶质细胞功能。基因表达前面板中,多个基因作为参考基因的适用性检查,以确保准确模型之间的比较。

2。实验的程序

2.1。细胞培养

主要人类星形胶质细胞(HA)和文化媒体获得ScienCell研究实验室(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和维护根据制造商的指示。主人脑微血管内皮细胞(HBMEC)和文化媒体从电池系统(美国佤邦·柯克兰)和维护根据制造商的指示。媒体对于细胞含有10%的边后卫。细胞用于实验都在播种时通道1。

2.2。Biopaper插入制造

细胞培养插入实际上电纺明胶15% biopaper膜是捏造如前所述[8]。短暂,10毫升gelatin-genipin解决方案是由溶解1.8克的B型明胶从牛的皮肤(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)到70%(卷%)乙酸(Sigma-Aldrich)蒸馏水。凝胶的解决方案是磁搅拌前60分钟组成的解决方案0.05克的genipin (Wako化学品,里士满,弗吉尼亚州,美国)溶解在0.5毫升乙醇和1毫升1 x磷酸盐(PBS)被添加到解决方案。同质的解决方案然后转移到20毫升塑料注射器(热费希尔科学、Rockwood TN,美国),22码不锈钢blunt-ended针(詹森全球、圣芭芭拉分校,美国)。旋转存储解决方案是24至72小时直到电纺。

明胶纳米纤维biopapers实际上电纺使用Matsusada精密ac100 - 240 v高压电源(志贺Kusatsu市、日本)和一个新时代泵ne - 300注射泵(美国纽约法明岱尔)。供电电极连接到不锈钢blunt-ended针,定位15厘米的圆形不锈钢板接地(10厘米直径)不粘锅的铝箔覆盖着。注射器泵设置为5的流量μL / min, 15千伏的电压应用于电极共30分钟每个实际上电纺垫生产,指定“biopapers。“实际上电纺biopapers被置于Sanplatec门将干燥器干燥(Kita-ku,大阪,日本)至少24小时。

Biopapers大小和放置在开放的悬细胞培养插入(美国Billerica的微孔,MA)工厂的PET膜被移除。的边缘biopaper高温密封细胞培养插入。多余的边缘biopaper被移除。交联biopapers,插入被放置在24-well盘子,淹没在0.5毫升溶液组成的5% (w/v)genipin溶解在乙醇和培养7天在37°C。插入与无菌水冲洗四次并存储在4°C到需要水,但不超过7天。在以前的工作证明(8),该协议产生biopapers整体厚度为4.5±1.5μm。使用前,插入被放置在紫外线消毒至少20分钟。

2.3。体外BBB模型

体外双层人类血脑屏障(BBB)模型准备和标准的宠物细胞培养插入(1μ孔隙大小)和实际上电纺biopaper膜。首先,插入的封面是倒并放入24-well板。50毫升25000公顷中包含已经被添加到每个插入底部的一面。板是用于覆盖插入被放置在一个孵化器在37°C 2小时允许细胞附着。2小时后,盘子被纠正过来,并且1毫升的HA中添加到每个油井的底部。第二天,500人μL HBMEC介质包含25000 HBMECs添加到细胞培养的顶端插入。只有第一段的细胞被用来减少实验的不同表型变化。培养基配方用于实验相同,播种前用于细胞培养。每2 - 3天中被改变。

插入是收获分析转录差异通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)比较模型细胞种植在宠物或biopaper之间。使用钳,每个膜从挂塑料插入和完全淹没在Allprotect组织试剂(试剂盒,日耳曼敦,MD) 1.5毫升管。插入后3、7、14、21、28天6插入收集宠物和biopaper膜在每个时间点。每个biopaper和宠物插入被播种准备不同的细胞,导致 生物复制。样品在Allprotect一直冻结在−RT-qPCR 20°C到加工。

2.4。荧光免疫组织化学

21天,三个样本biopaper模型和宠物模型用于荧光免疫组织化学分析。染色之前,所有样本从transwell插入和删除放在载玻片。样品固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟,其次是三个五分钟洗磷酸盐(PBS)。固定后,所有样本permeabilized Triton x - 100 0.25% PBS溶液在室温下10分钟。样本清洗三次PBS和孵化屏蔽解决1%牛血清白蛋白(BSA)和22毫克/毫升甘氨酸在PBS含有0.1%渐变在室温下20 30分钟。阻塞后,样品被孵化与主要抗体血小板粘附细胞粘附分子1 (PECAM-1、鼠标、热费希尔37 - 0700)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP、鸡肉、热费希尔pa1 - 10004)在PBS含有0.1%渐变20 1小时在室温下。稀释的抗体主要是1:50。主要抗体孵育后,样本用PBS三次,五分钟,孵化与二次抗体解决方案1小时在黑暗中在室温下。二级抗体溶液由山羊anti-mouse (SAB 4600082,σ)和山羊anti-chicken (SAB 4600465,σ)PBS包含1% BSA和0.1%渐变20。三最后洗PBS进行样品,之后Vectashield不变色安装试剂应用(h - 1400,向量实验室,伯林盖姆,CA)和盖玻片被安装。 Samples were imaged the next day on a Nikon Eclipse Ti confocal microscope using NIS-Elements software (NIS AR 4.10).

2.5。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

RNA提取之前,样品在3200转离心5分钟和0.5毫升1 x PBS洗两次。膜被从原来的1.5毫升集合管与无菌钳和转移到无菌2毫升管包含350毫升缓冲RLT(试剂盒,日耳曼敦,MD)。5毫米不锈钢珠(试剂盒,日耳曼敦,MD)添加到管随后消散在Tissuelyser LT(试剂盒,日耳曼敦,MD) 50 Hz 2分钟。样本在15000转3分钟,旋转和上层清液被转移到一个新的2毫升管。总RNA与RNeasy净化+迷你包(试剂盒,日耳曼敦,MD)使用QIAcube(试剂盒,日耳曼敦,MD),一个自动化的样品处理技术,根据制造商的指示。DNase消化延伸至1小时。总RNA浓度和纯度量化使用Nanodrop 2000分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。总RNA转化为互补DNA使用RT(互补)²第一个链工具包(试剂盒,日耳曼敦,MD)协议与45总RNA ng /反应。每个基因组DNA消除混合包含45 ng总RNA和2μL缓冲通用电气和被带到最后的10μL RNase-free水。反应是孵化为5分钟42°C,于是他们被放置在冰和逆转录反应添加的组件根据制造商的指示,总量的10μ在42°C l .反应是孵化15分钟,其次是5分钟在95°C。总共有91μL RNase-free水被添加到每个20μL cDNA反应和存储−20°C到进一步使用。应该注意的是,从每个样本中提取RNA从内皮细胞和星形胶质细胞继续贡献。由于实验装置,是不可能单独的内皮细胞RNA和星形胶质细胞RNA。

2.6。管家基因阵列

人类的管家分析器RT²PCR数组是用来评估的一套基因作为潜在的参考基因。这个数组包含在96 - 12看家基因的格式(多环芳烃- 000 z,试剂盒,日耳曼敦,MD)。基因的稳定性评估样本28日代表biopaper和所有细胞类型的单一栽培。每个基因与两个不同的最终评估模板(互补)含量:1.6 ng和0.1 ng。由于总RNA单一栽培的产量很低,参考基因化验没有执行这些样品。RT²SYBR绿色主人混合(试剂盒,日耳曼敦,MD)是用于所有参考基因化验。所有化验,每个反应由12.5μL 2 x RT²SYBR绿色Mastermix, 2μL cDNA、和10.5μL nuclease-free水。以下协议是用于所有化验:最初的10分钟的孵化在95°C随后40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。一个为每个基因在每个样本反应进行。反应是使用记录和分析应用生物系统公司ViiA™7系统软件。每个基因的PCR效率评估通过LinRegPCR [12]。所有候选人参考基因的稳定表达所有样品评估使用BestKeeper诉1软件程序。(13]

2.7。自定义RT²PCR数组RT-qPCR

一个定制的分析器RT²拥有27 RT PCR C数组格式设计²底漆化验2看家基因(禁忌和RPLP0),和3控制(人类基因组DNA污染、逆转录和积极的PCR控制)(SABiosciences)。32个基因中安排一式三份96 - PCR数组。数组是使用出版协议准备的。简单地说,一个样本分析32目标,450年μL 2 x RT²SYBR绿色Mastermix添加到34μ和416 L互补脱氧核糖核酸的合成反应μL RNase-free水和混合。25毫升的PCR组件混合添加到自定义数组的每个好,板是用微安光学胶膜。经过短暂的旋转,数组将被放置在一个快96 - 7块一个ViiA实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。自行车在95°C条件最初的10分钟的孵化紧随其后40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。应用生物系统公司ViiA 7软件被用来记录和分析所有的反应。荧光阈值手动调整为每个基因分析是基于荧光的目视检查日志阶段。

2.8。数据分析

每一个基因的表达水平在一个给定的时间点比较biopaper和宠物之间使用ΔC coculture模型_T方法(14]。禁忌作为参考使用的所有样本的基因,已经验证的最佳管家基因的测试。简单来讲,ΔC_T每个基因的价值是通过减去C_T价值的参考基因(禁忌)从目标基因。这个值是通过log2转换(即线性化的。,2^−ΔCT)。在每个时间点,最后2^−ΔCT表达式的值biopaper和宠物使用双尾学生的模型进行了比较t以及,结果被认为是重要的 。这个过程被重复基因在所有时间点。值得注意的是,两个biopaper复制和两个宠物复制从第七天时间点被移除所有的数据分析,以及一个宠物复制从第三天。这些样本被移除或者完全缺乏GFAP的表达和AQP4 C(已知astrocyte-specific标记)或显著增加_T值(表S1)[15,16]。我们相信这些样本的星形胶质细胞死亡,这样他们不代表的星形胶质细胞/内皮模型实验。

3所示。结果

3.1。管家基因的验证

所有测试参考基因PCR效率(表拥有相似1)。在低浓度(0.1 ng) cDNA,禁忌是最稳定的基因(标准差(SD) = 1.39)所有样本类型,尽管所有基因的稳定性高于推荐截止值为1.0(表1)。(1.6 ng)互补脱氧核糖核酸浓度高时,所有基因的SD下降,表明更大的稳定性。与模板浓度低,PP1H (SD = 0.77),禁忌(SD = 0.84),和GUSB (SD = 0.84)是最稳定的基因测试,其次是RPLP0和HSP90AB1与SD (= 1.02)。禁忌被选为定制的管家基因RT²qPCR数组,由于有高稳定性高和低浓度。

3.2。荧光免疫组织化学

在21天,荧光染色法显示的存在BMEC标记PECAM-1 GFAP和星形胶质细胞标志(图1)。鹅卵石模式典型的内皮单层也可以随时观察,以及一个细长的星形胶质细胞形态。形态学BMEC和星形胶质细胞生长biopaper或宠物非常相似,表明膜材料可能没有对细胞形态有明显的影响。

3.3。基因阵列数据

几乎没有观察到任何时间点表达biopaper或宠物coculture系统基因缝隙连接β4 (GJB4),缝隙连接β6 (GJB6)紧密连接蛋白3 (TJP3), claudin 3 (CLDN3)(表2)。因为这些基因没有表达值,统计分析不能被执行。

在第三天,观察coculture系统之间基因表达的显著差异(表6基因2)。三个六个基因高表达biopaper cocultures,包括gamma-glutamyltransferase 5 (GGT5, ),紧密连接蛋白2 (TJP2 )和cadherin-5 (CDH5, )。相反,细胞生长在宠物有显著较高的层粘连蛋白亚基的表达α1 (LAMA1, ),血小板源生长因子受体β(PDGFRB )和白血病抑制因子(生活, 在这个时间点)。

显著差异基因表达的观察九个基因在第七天。Cocultures种植在biopaper层粘连蛋白亚基的表达显著升高α4 (LAMA4, ),血小板源生长因子β(PDGFB ),GGT5 ( ),CDH5 ( ),TJP2 ( )和血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1, )。观察宠物cocultures相比,显著降低表达分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸(SPARC, 第四),胶原蛋白α1 (COL4A1, )和PDGFRB ( )。

与之前的时间点,大部分的11个基因与微分表达式在第14天有更高的表达式在宠物cocultures相比biopaper cocultures。具体来说,宠物文化被观察到明显高于SPARC的表达式( )、层粘连蛋白亚基α2 (LAMA2, )、生活( ),纤维母细胞生长因子2 (FGF2 ),claudin 12 (CLDN12 ),紧密连接蛋白1 (TJP1, ),缝隙连接α1蛋白(GJA1, ),血管细胞粘附分子1 (VCAM1, )。只有PDGFB ( ),TJP2 ( )和CDH5 ( )有更高的表情biopaper在这个时间点。

21天有三个基因显著表达差异两个coculture系统。细胞生长PDGFB biopaper明显有较高表达( )和claudin 1 (CLDN1, ),但明显低于VCAM1表达式( 在这个时间点)。

最后的时间点,28天,有6个基因与微分表达式。高表达LAMA4 ( ),PDGFB ( ),PDGFRB ( ),CDH5 ( ),TJP2 ( )和PECAM1 ( )观察biopaper cocultures宠物cocultures相比。值得注意的是,所有的化验基因高表达的宠物文化在这个时间点。

四个基因,CDH5 TJP2、PDGFB VCAM1,重要的角色在BBB维护和渗透率模型之间的显著差异表达多个时间点(图2)。CDH5和TJP2 biopaper中高度表达模型在所有时间点除了第14天(数字2(一个)和2 (b)、职责)。PDGFB表达明显高于所有时间点后第三天(图2 (c)),VCAM1高表达在宠物coculture模型仅14天、21天(图2 (d))。

4所示。讨论

为了准确模拟BBB体外,细胞基因表达必须仅限于在BBB体内基因通常表达。为了证实这个biopaper和宠物模型,GJB4和GJB6包含数组作为消极的控制。GJB4和GJB6代码缝隙连接蛋白联接蛋白30.3和联接蛋白30日分别。联接蛋白30.3表达式已经证明non-BBB内皮组织,但目前还没有记录或星形胶质细胞表达的脑微血管内皮细胞。因此,没有表情的GJB4研究与文献结果一致,确认没有蛋白质不出席BBB模型表达障碍。与联接蛋白30.3,联接蛋白30是一个至关重要的组件之间的缝隙连接星形胶质细胞和突触活动起着重要的作用17]。然而,星形表达式是由神经元(严格控制18),没有出现在biopaper或宠物的模型。因此,缺乏GJB6表达式是容易解释缺乏细胞信号和预期的神经元内的文化。综上所述,这些研究结果表明,两种coculture模型不显示相关基因表达不是BBB,由于本构缺乏表达或额外的细胞信号(即的要求。神经元的存在)。

只表达内皮,不是上皮紧密连接,基因被证实尽管TJP3和CLDN3使用消极的控制。TJP3,代码紧密连接蛋白带状occludens-3 (ZO-3),主要是表达在上皮紧密连接(19]。到目前为止,没有证据表明是BBB表示,符合发现宠物和biopaper模型。同样,CLDN3表达在脑组织,而是处于非常低的水平明显高于表达在上皮屏障20.]。这些负面的结果控制证明无论是biopaper还是宠物模型系统表达与上皮细胞相关的蛋白质,不是内皮,障碍。

表达水平的内皮细胞紧密连接跨膜蛋白化验biopaper之间都是平等和宠物coculture模型在所有时间点,除了CLDN12 CLDN1。有趣的是,occludin的表达(OCLN)和claudin-5 (CLDN5),主要的蛋白质组成紧密连接(21模型系统之间),没有明显不同。occludin的低表达是BBB疾病打乱了几个州的标志(22],claudin-5发挥了至关重要的作用紧密连接size-selective渗透率(23]。这一发现表明,膜材料,无论是宠物或明胶biopaper,没有剧烈影响的表达丰富的紧密连接蛋白。还首次表明,内皮细胞生长在一个实际上电纺biopaper模型没有这些紧密连接蛋白的表达低于那些生长在传统模型。这适用于所有化验内皮细胞跨膜蛋白除了claudin-12 (CLDN12)和claudin-1 (CLDN1)。CLDN12 CLDN5一样,位于紧密连接,尽管它主要是与上皮细胞有关。到目前为止,几乎没有记录CLDN12 BBB-derived内皮细胞中表达。最近的证据表明CLDN12是表达的神经干细胞在分化,减少(24]。可量化的存在CLDN12表达式在宠物和biopaper模型系统可以解释一些神经干细胞主要出现在最初的细胞群。这个发现指出本研究的局限性;商业的主要细胞纯化但可能还有些剩余细胞扩张和模型变更的能力。这种限制也支持的商业实体本身,由于内皮细胞保证> 95%的纯,不一定是100%。Claudin-1 (CLDN1)形式紧密连接障碍与CLDN3 CLDN5, OCLN biopaper模型中的高表达在一个时间点。尽管有证据表明,增加表达CLDN1减少血源性分子(BBB通透性25),可能观察到的表达水平没有可量化影响屏障完整性模型之间的差异。的差异表达,虽然意义重大,是轻微的( ),没有持续超过一个时间点。此外,一个宠物样本比其他人要低得多,可能导致观察到的统计差异。未来的研究应该包含更多的样本,以获得较低的数据集样本之间的标准差。总的来说,这些发现表明,细胞外的内皮细胞粘附和信息和物理分子阻抗在两者之间的紧密连接最有可能类似coculture模型。

高表达在多个时间点CDH5表示可能导致粘合连接处并且biopaper模型中的渗透率下降。由CDH5编码,VE-cadherin内皮的主要整合膜蛋白(粘合连接处并且26]。它adherens结内的多功能作用,协助在内皮细胞生存,稳定血管组装,和改变血管通透性26]。低水平的CDH5表达式表明屏障通透性增加,方法利用一些病毒(27]。较高的表达水平CDH5 biopaper模型中观察到的可能意味着更多或更严格的比粘合连接处并且观察宠物的模型,表明更高的屏障的完整性或监管。

尽管表达水平的相似性紧密连接biopaper和宠物cocultures之间的跨膜蛋白,带状occludens附属蛋白家族有不同的表达谱。TJP1,编码蛋白质带状occludens-1 (ZO-1),也有类似的表达biopaper和宠物模型在所有时间点除了14天,观察到的表达明显高于在宠物模型。形成紧密的和需要适当的定位和装配的粘合连接处并且ZO-1脚手架之前招聘的跨膜蛋白,如occludin或claudins [28]。类似的表达式表明,内皮细胞种植在biopaper或者宠物最有可能组装时间紧,在粘合连接处并且相似。有趣的是,蛋白质带状occludens-2(从TJP2 ZO-2表示)是更高度表达biopaper模型在所有时间点除了21天。不像ZO-1, ZO-2发现只在紧密连接,在连接装配中起着重要作用[29日]。虽然没有完全阐明,但似乎也与BBB的完整性直接相关;多个研究表明减少ZO-2表达前提高(BBB通透性30.- - - - - -32]。因此,biopaper coculture模型将不透水分子扩散在所有时间点,一个先前的研究发现不支持的8]。未来的研究应该澄清mRNA水平和扩散数据之间的差异,分析亚细胞定位和ZO-2丰富。

由内皮细胞(分泌33),PDGFB BBB形成和维护起着至关重要的作用,作为一个化学引诱物的周(34),改变基因的表达。的表达水平PDGFB biopaper模型随着时间的增加,与宠物模型中保持相对稳定的水平。这种模式反映在两个模型之间的表达水平在每个时间点;没有观察到显著差异在第三天的时间点,但PDGFB biopaper模型中的高表达后时间点。内皮细胞未能招聘周结果机械不稳定,最终导致微动脉瘤(35和胚胎杀伤力36]。虽然周不在宠物或biopaper模型,高PDGFB biopaper模型中的表达可能创建一个更好的梯度为假定的周皮细胞chemoattraction。此外,表达水平升高PDGFB biopaper模型随着时间的推移,表明长期BBB的最好模式,继续表达PDGFB是需要维护屏障的完整性(37]。的宠物和周围的周biopaper模型可能会进一步阐明功能差异模型由于PDGFB表达式。

四个基因表达水平明显高于在多个时间点的宠物模型。这些基因之一,血管细胞粘附分子1 (VCAM1),与BBB通透性增加。VCAM1发挥了至关重要的作用在中性粒细胞迁移到中枢神经系统通过打开毛孔BBB,允许细胞穿过障碍(38]。正常内皮细胞表达VCAM1在低水平但大幅上调表达炎性反应条件(39]。附带的表达增加,内皮细胞形态学变化是利用几个病毒家庭BBB渗透,作为证明体外与登革病毒(40)和体内与委内瑞拉马脑炎病毒(41]。VCAM1的结果明显高于在宠物模型相比biopaper模型14天、21天相关从疾病病理学的角度来看,作为炎症可能是有用的建模,进一步支持建议PET膜的更多是指示性的炎症模型。像VCAM1生活表达在中枢神经系统炎症水平显著升高(42]。尽管大多数研究仍对中枢神经系统的影响一直专注于脊髓,多项研究表明,它是一个有效的促炎细胞因子(43,44]。更高水平的宠物模型表明,模型可能更象征“发炎”状态,潜在的有用的测试治疗炎症的影响。另一方面,biopaper模型可能更相关的调查炎症和疾病的发展从一个“健康”的基线。

特别有趣的是以前的三通测试并不相关的基因表达在当前的研究结果。之前的分析表明,内皮细胞、星形胶质细胞培育的影响biopaper平均12 t值Ω厘米²在第四天,18Ωcm²在9天,明显低于平均14Ωcm t值²27Ωcm²在同一时间点记录宠物影响(8]。等障碍的基因表达数据,尤其是TJP2 CDH5,这似乎意味着biopaper模型应该有一个三通价值高于宠物模型在这些早期的时间点。但是,可能有多个原因差异基因表达数据和功能的结果。一种解释是,如前所述,BBB通透性是一个复杂的过程,需要许多蛋白质工作在音乐会。可能需要更高的其他附属蛋白基因表达以达到三通水平较高。另一种解释是,可能会有延迟之间的基因表达和积累足够的蛋白质功能变化的影响。可能是一个“门槛”TJP2水平或CDH5需要移植其他细胞变化导致更严格的障碍,是观察其他基因(45]。进一步的研究需要阐明时间轴和相关性BBB通透性基因表达和功能障碍。

5。结论

体外coculture BBB的模型由内皮细胞和星形胶质细胞的反应不同,transwell膜实际上电纺明胶biopapers或宠物。27个基因分析,4没有表情,5基因表达水平没有显著差异biopaper和宠物之间的插入、10表达明显高于至少在一个时间点的宠物模型,和7表达明显高于biopaper至少在一个时间点模型。事实上,不到三分之一的基因测试插入材料之间有相似的表达方式这两个模型有显著区别。虽然两者都是有效的模型,我们的研究基于实验验证使用不同的膜进行测试。积分的模型系统也有类似的表达膜蛋白在紧密连接的存在,但ZO-2等辅助蛋白的表达。区别在VCAM1等几个关键炎症基因的表达和生活表明宠物模型就可以选择学习各种疗法的影响在BBB发炎状态。相反,biopaper模型具有较高的表达与“紧缩”BBB文化相关的基因至少28天,因此验证使用biopaper模型的长期研究。未来实验应该关注这些测试的子集基因与蛋白质的丰度和关联mRNA水平。此外,宠物的应用模型研究发炎BBB应该进一步调查。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。所有工作由乔尔·d·加斯顿,劳伦·l·Bischel和凯萨琳·d·Cusick做在合同下与美国海军研究实验室。

确认

这项工作得到了化学生物技术委员会项目没有。从美国国防部CB10011化学和生物防御计划通过国防威胁降低局(DTRA),美国工程教育协会(ASEE),和国家研究委员会(NRC)。作者要感谢吧侍者Jaimee康普顿。

补充材料

没有基因表达在4 AQP4和GFAP的样品。高亮显示的样品被分析(补充文件)。

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