安全的经颅焦电刺激通过三极的同心环电极在大鼠海马CA3区神经元

文摘

癫痫是一种神经紊乱,影响大约百分之一的世界人口。无创性脑电刺激通过三极的同心环电极已被建议作为一个替代/补充治疗癫痫控制。先前的结果显示其有效性衰减急性发作在青霉素,pilocarpine-induced癫痫持续状态,和pentylenetetrazole-induced大鼠癫痫模型及其安全老鼠头皮,皮质完整性和记忆形成。在这项研究中,神经元计数是用来评估可能在大鼠组织损伤( )由于单剂量或五个剂量(每24小时)刺激海马CA3区神经元的24小时,一个星期,一个月后最后刺激剂量。全析因方差分析显示,神经元的数量没有统计上的显著差异之间的控制和stimulation-treated动物(= 0.71)。此外,它没有表现出显著差异,由于存在大量的刺激剂量(= 0.71)和由于延迟后刺激剂量(= 0.96)。结果表明,刺激在当前参数(50 mA, 200μ年代,300 Hz,两相的,charge-balanced脉冲2分钟)不诱导神经元损伤大脑的海马CA3区。

1。介绍

癫痫是一种神经紊乱,影响到大约百分之一的世界人口多达四分之三的癫痫患者生活在发展中国家(1]。最近,脑电刺激减少发作频率但刺激的最佳结构和使用最有效的刺激仍然是未知的(2]。

非侵入式三极的同心环电极(tcr)执行第二个空间导数,拉普拉斯算子,在头皮上的潜力。以前,它已经表明,tEEG拉普拉斯算子的脑电图(EEG)通过TCRE配置,优于常规脑电图与圆盘电极自tEEG明显更好的空间选择性,信噪比和互信息3]。因为这样的独特功能,细胞已经发现许多应用在广泛的领域包括,特别是癫痫衰减使用经颅焦刺激(TFS)通过识别应用4- - - - - -8]。与电刺激通过传统圆盘电极,通常应用在头部,TFS通过TCRE有一个更加统一的电流密度和关注下面的直接刺激电极(9]。此前,TFS可以减弱急性发作(4),减少震动的表达和氨基酸释放在海马体(5]在pilocarpine-induced癫痫持续状态,减少电记录的6,7)和行为(7,8]pentylenetetrazole-induced发作癫痫活动模型,被广泛用于测试癫痫易感性和筛选新的抗癫痫药物(10]。

TFS的长期目标是控制癫痫发作,所以安全被测试在动物模型。以前的工作在安全测试头皮(TFS包括评估的影响11)和皮层组织(12)以及记忆形成(13在老鼠身上)。TFS的影响通过对老鼠头皮细胞定量分析通过计算TCRE下的温度曲线和相应的能量密度与electrical-thermal耦合场分析使用一个三维的多层模型(11]。红外测温术是用来测量皮肤温度在TFS验证计算机模拟。Besio等人进行了组织学分析来研究细胞形态和描述任何导致组织损伤11]。这是得出的结论是,只要指定的能量密度应用通过TCRE一直低于0.92 (A²/厘米⁴年代⁻¹),没有明显损伤鼠头皮下电极。另一个histomorphological分析评估TFS的影响通过TCRE鼠皮质组织(TCRE下面)12]。控制、单剂和five-dose TFS-treated动物被评估在24小时,一个星期,一个月后TFS的上届政府。集成光密度(IOD)与微测量软件。没有统计上的显著差异IOD值被发现TFS-treated控制和两组的老鼠的大脑,和形态分析并没有显示任何神经元固缩的,细胞的损失,或神经胶质过多症可能确认任何大脑皮层神经元损伤(12]。最后,TFS的效果在短期和长期记忆的形成是评估使用对象识别测试(13]。结果天真的控制和单剂TFS-treated老鼠建议TFS没有不利影响记忆形成的13]。

本研究的目的是评估TFS的可能的影响在大鼠海马CA3区神经元。CA3区分析源于它的理性是边缘系统的一个最重要的地区。特别是,研究表明的背侧海马CA3区调和空间信息的采集和编码在短期记忆和持续时间的秒分钟14]。此外,CA3介导的信息编码要求多个试验构造关系表征(14]。神经解剖学的研究调查的影响不同的刺激或操作表明,即使是最小的损伤神经元在这个次区域可能影响合成和生产不同的神经递质如谷氨酸和GABA (15,16]。电刺激已被证明导致树突发芽(17体内),我们的初步研究[18验证了有限元方法建模[19)表明,TFS可能足以导致海马神经元的激活。因此,本研究的目的是评估细胞丧失的意义,或者更一般地,改变CA3区神经元的数量由于TFS。在我们以前的工作IOD测量(12),在这项研究中,我们使用神经元计数,因为它是一个既定的方法来评估神经损失的程度作为衡量健康的神经元密度均匀CA3区(20.),因此是一个更好的适合本研究的目标。

2。材料和方法

2.1。动物

男性成人Sprague-Dawley老鼠(重220 - 320克)被用于这项研究(哈伦实验室Inc .,麦迪逊,WI)。他们保持laboratory-controlled条件下(12 h / 12 h正常光/暗周期25°C)与随意提供食物和水。所有动物的保健设定的标准协会(American Association of实验动物保健,和实验协议是罗得岛大学的批准机构动物保健和使用委员会。

2.2。统计分析

使用设计专家执行统计分析软件(stat容易Inc .,明尼阿波利斯,美国)。全析因设计的方差分析(方差分析)是使用三个分类因素(21]。第一个因素(一)TFS的存在刺激在两个级别对应TFS-treated和控制(虚假的TFS)动物。第二个因素(B)去年TFS应用程序之间的时间延迟和transcardial灌注的动物在三个级别相应的24小时,一个星期,一个月。这些延迟合并观察时间的任何可能伤害CA3区。第三个因素(C)是TFS申请的数量从两个层面提出相应的单一剂量的TFS和五个剂量的TFS管理每24小时连续五天。因子C允许观察TFS当严重或反复应用的效果。响应变量是神经元计数数据(在下面描述)用另一组动物( )的2×2×3 = 12水平的三个因素的组合(的总和 对于所有的12组)。我们研究的全因子设计提出了表1。

2.3。TFS的应用

当天实验中,大鼠的头皮剃和准备NuPrep磨料凝胶(d·o·韦弗,极光,有限公司)。老鼠被一个研究员而另一个被TCRE与导电胶(1毫米Ten20、草技术、西沃里克,RI)在头皮上集中在背后的头顶前的眼睛和耳朵。助教(50 mA, 200μ年代,300 Hz,两相的charge-balanced脉冲)当时申请了2分钟的外环和中央圆盘之间TCRE(中间环浮动)。所有控制动物完全检测像对待动物,但收到一个或五个剂量的虚假的TFS马(0)。

2.4。灌注协议和成像

当天灌注,所有老鼠都称重和深度麻醉与氯胺酮的混合物(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(12毫克/公斤)i.p。他们用150毫升肝素化灌注transcardially生理盐水(9%),其次是4%的多聚甲醛(密苏里州圣路易斯西格玛化工有限公司)的解决方案在磷酸盐(PBS) 0.1 M, pH值7.4通过灌注泵的流量900毫升/小时。30分钟的灌注后,大脑被一夜之间从头骨和沉浸在4%多聚甲醛。然后固定剂被丢弃,大脑沉浸在蔗糖(密苏里州圣路易斯西格玛化工有限公司)30%的解决方案(在PBS 0.1 M, pH值7.4)。大脑在4°C到削减保持冷藏。冠状切片进行了30μ5000 (UltraPro低温恒温器vibratome)。每个第五部分(每5系列)包含背海马CA3区收集(PBS 0.1米)。片被储存在4°C,供以后使用。组织部分包含感兴趣的地区被安装在糊化幻灯片和允许干燥。控制和TFS-treated幻灯片尼氏小染色同一天在同一时间。片与串行醇脱水(70%,80%,96%,100%),清除与Xilens(费舍尔科学、汉普顿,NH)和安装Permount安装媒体(费舍尔科学、汉普顿,NH)。

2.5。神经元计数

大脑切片中每个大脑的三个部分的背侧海马CA3区拍摄用显微镜(卡尔蔡司、从德国)配备了数码相机(数字景象DS-U3 / DS-Fi1,尼康有限公司日本)40 x放大。为了一致性,我们只拍摄大脑切片前囱间隔−−3.8毫米3.3毫米,因为这是最近的地区,TCRE被[22]。然后,我们选择3邻域包含为每个大脑切片CA3区。我们重复4片导致12为每个大脑图像。神经元计数进行使用ImageJ软件(National Institutes of Health);http://imagej.nih.gov/ij)。计算字段包含CA3神经元是220年的一个矩形μ米宽、165.38μ米的长度。计数字段代表TFS-treated控制动物的例子包括1月后TFS的单剂量(组从表5和61、职责)呈现在图1。由于细胞计数是手动执行,为了避免计算相同的神经元不止一次,我们使用一个网格(140同等大小的矩形部分)。神经元细胞计数,我们定义为圆形细胞体具有明显的细胞核透露的尼氏小技巧。最后神经元计数数据表达每个神经元的数量μ米²(神经元/μ米²)。邻域每一块被加在一起导致四每个大脑神经元计算值或12值为每个12组用于统计分析。

3所示。结果

神经元计数这一研究获得的结果展示在表12组1神经元的数量/μ米²(平均值±标准错误),见图2。

的方差分析模型中没有显示任何显著影响的主要因素,B和C,也为他们的交互:一个(d.f。= 1,= 0.14,= 0.71)、B (d.f。= 2,= 0.05,= 0.96),C (d.f。= 1,= 0.14,= 0.71),AB (d.f。= 2,= 0.5,= 0.61),AC (d.f。= 1,= 0.37,= 0.54),公元前(d.f。= 2,= 0.2,= 0.82),ABC (d.f。= 2,= 0.42,= 0.66)。

4所示。讨论

本研究的主要结果是,通过tcr TFS目前刺激参数(50 mA, 200μ年代,300 Hz,两相的,charge-balanced脉冲2分钟)不引起大脑的海马CA3区神经元损伤严重或反复应用。神经细胞计数无显著影响神经元的数量由于TFS的存在等因素(因子),去年TFS应用后的时间延迟(B)因素,和TFS的应用程序的数量(因子C)以及所有因子的交互。观察健康的神经元沾甲酚紫在形状和健壮的苍白,球形或略椭圆形原子核和一个大核仁(图1)。神经元的胞浆也可以清楚的看到,特征观察到所有的动物( ;图1)。

这些结果符合我们之前得到的结果评估的影响通过TCRE TFS头皮,皮层,和记忆形成,进一步表明TFS是安全的和有效的,至少在老鼠(11- - - - - -13,23]。与记忆形成最初的研究(13),评估只单一剂量的TFS的影响,在这项研究中,我们也评估的影响5个剂量的TFS每24小时管理。五每日剂量被选为慢性TFS应用在这项研究中,以及在我们先前的研究在皮质的完整性12和记忆的形成23用于一致性因为相同数量的剂量是常用的在研究抗癫痫24]和proepileptic [25药物的影响。以来的长期目标是在临床实践中使用TFS, TFS通过tcr的应用可能需要不止一次。以前,我们展示了一个非侵入性癫痫自动控制系统的可行性与pentylenetetrazole-induced癫痫大鼠。单剂量两个剂量的TFS通过TCRE TFS在哪里管理由一个实时自动触发tEEG-based电记录的癫痫活动检测器(26]。因此,安全的TFS重复TFS应用程序必须被评估。

当前研究的局限性之一是,我们没有资源来随机的运行秩序!研究设计。随机化可以帮助平衡了讨厌的影响因素(21]。相反,表中的所有组织的处理1同时已经启动。其他假设方差分析包括正常、方差的同质性,和独立的观测验证确保分析的有效性只有一个例外studentized残余(总数的0.7%)下降(−3,3)范围(外21]。

另一个限制是,该研究只评估了一组预定义的TFS的影响参数(50,200μ年代,300 Hz,两相的charge-balanced脉冲2分钟),而不是研究一个大范围的刺激参数。特别是,添加TFS-treated组与一组参数导致组织病理学的影响可以帮助建立安全限制TFS以及验证中使用的安全检测方法的灵敏度探测刺激的负面影响。使用单一组TFS参数背后的原因有三个。首先,同一组参数已被证明有效的衰减急性毛果芸香碱,pentylenetetrazole-induced癫痫(4,6- - - - - -8,26),我们的目的是保持安全测试研究[12,13,23)符合研究评估TFS的抗惊厥的作用。例如,在一项研究[4),一系列TFS频率(200、300、500和750赫兹),两个脉冲持续时间(200年和300年μ年代),和两个电流强度(50和60 mA)进行测试评估的TFS的影响在pilocarpine-induced癫痫持续状态大鼠使用TFS的坡道刺激协议和组合参数取得了更好的结果比在当前的研究中使用的参数集。第二,增加更多的因素如TFS频率、脉冲持续时间、电流强度会进一步扩大我们的全因子设计导致的增加从当前使用的动物数量 。考虑到有限的资源用于这项研究和最近的结果显示抗惊厥的作用这一事实的TFS电流远低于本研究中使用的一个(5 mA和50 mA) (27),当前的方差分析因素集被选为最相关研究的范围。最后,神经元计数作为一个方法的有效性评估的程度CA3区神经元损失源于它建立和广泛应用为海马区域一般(28,29日]和CA3特别是[20.]。以类似的方式,建立一种方法如对象识别测试中使用(13没有验证其敏感性使用一组动物的短期和长期记忆形成TFS已被修改。

因为没有显著变化由于TFS观察使用神经元计数在这一点上,我们没有进行进一步测试等量化神经元死亡和神经传递素的变化。

而很难直接比较安全检测研究进行其他侵入性或无创性脑刺激技术和当前的研究,概述他人的工作在人类或动物模型介绍如下。侵入性脑深部刺激(DBS),没有发现严重的组织损伤八帕金森氏症患者的大脑中处理DBS连续70个月(30.]。所有大脑样品显示保存完好的神经实质和只有轻微的神经胶质过多症由于活性变化的手术放置电极。尽管TFS无损伤,在我们以前的工作,没有任何神经元固缩的形态分析,细胞丢失,或在TFS-treated老鼠大脑和神经胶质过多症没有明显损伤发现在当前的研究中12]。

电休克治疗(ECT),一种无创性脑刺激,产生不良神经认知次生效应的形式记忆功能障碍由于特定大脑区域的破坏31日]。以前,它已经证明了TFS不会产生不利影响的短期和长期记忆形成的老鼠(13,23]。同时,在动物实验中,使用电休克的冲击刺激强度和频率与人类等,没有显示神经元损失定量细胞计数即使长期治疗课程(32]。类似的方法被用来评估TFS在这项研究的安全。

等其他无创性脑刺激技术经颅直流电刺激(tDCS)或经颅磁刺激(TMS)和重复经颅磁刺激(rTMS),指导方针和建议刺激参数范围安全应用程序存在的基础,特别是在histomorphological研究的结果在动物模型(33- - - - - -35]。类似的量化范围的TFS参数允许安全通过tcr TFS的应用是我们未来工作的目标之一。其他目标包括确定具体的作用机制TFS通过识别和调查结果的老鼠可能转化为人类癫痫。

5。结论

在这项研究中,显微图像分析被用来进行安全检测脑刺激协议的可能影响评估颅焦刺激通过三极的同心环电极在大鼠海马CA3区神经元。神经元计数是用来评估的重要性的影响存在的刺激(对待动物与控制),刺激剂量的数量(1和5)和延迟后刺激剂量(24小时,一个星期、一个月)在神经元的数量。方差分析模型中无显著影响暗示刺激目前刺激的安全参数(50,200μ年代,300 Hz,两相的charge-balanced脉冲2分钟)海马CA3区神经元。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

这项研究的部分支持由美国国家科学基金会(NSF)的人力资源开发(HRD)部落的学院和大学计划(TCUP)奖。1622481,Oleksandr Makeyev。作者还要感谢Fogarty国际中心的美国国立卫生研究院(NIH)奖R21TW009384和NSF国际科学与工程办公室奖10494的支持。作者欣然承认博士沃尔特·g·Besio罗德岛大学的金斯顿国际扶轮,支持这项工作和玛莎Leon-Olea博士从西班牙de Psiquiatria雷蒙·德·拉穆尼斯让这项研究被执行在Besio Neurorehabilitation实验室的博士。作者还要感谢Frederick j .检查者和保罗·约翰逊博士来自罗德岛大学的博士分享他们的设备以及路易莎的罗查Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados墨西哥城,墨西哥,和桑德拉博士从Centro Orozco-Suarez医生Nacional Siglo第二十一章,墨西哥城,墨西哥,有建设性的讨论和有用的评论这项研究。

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