模型的小鼠心室心脏组织在体外Kinematic-Dynamic研究电磁和β肾上腺素的刺激

文摘

模型的小鼠心室心脏组织在体外,我们研究了电磁刺激的变力的作用(频率、75 Hz),异丙肾上腺素管理局(10μ米),他们的组合。特别是,我们执行一个图像处理分析来评估心脏跳动的运动学和动力学合胞体从视频开始注册的收缩运动。我们发现电磁刺激能够抵消β异丙肾上腺素和肾上腺素的效应引发antihypertrophic反应。

1。介绍

组织工程的核心概念是理解在哺乳动物细胞的结构和功能之间的关系,组织和器官。

这些知识是基本重要的替代品在增长和发展的组织在体外;换句话说,组织工程结构的形态发生需要不仅基于分子的使用(例如,生长因子)也在刺激结构提供的上下文(例如,天然/合成生物材料比表面积/体积性质、生物相容性的特性,和机械性能)和生物物理提供的上下文(例如,集中/分布式,垂直/切向力和压力作用到质膜上,传递到细胞骨架和转导生化反应;变形应用于细胞形状和转移,通过细胞骨架、核膜,因此,DNA大分子形式的异染色质和常染色质;和机械力影响,通过细胞骨架,核信封的孔隙度,因此,贩卖生化信号mrna和小分子核糖核酸的核孔)。

例如,一个流体剪切应力(1- - - - - -3)或超声波(4)或生物材料特性(5)导致骨基质的重建在体外。此外,机械力也可能改变转录时更迅速地传播通过细胞骨架与直接进入细胞核核包裹蛋白(6]。

前面的例子的结构/功能的关系是通过“张拉整体结构”理论理解7- - - - - -10期间:在体外形态发生在生物反应器和生物材料,生物物理力量建立一个平衡,”张拉整体结构,“适合改变转录11,12]。

具体来说,细胞行为的调制是证明心肌细胞受到机械力的感应电磁场的(13,14]。然而,电磁场的影响是有争议的。工作没有主要对心脏功能的影响(15),而另一些建议不利的后果,如心律失常、心动过速(16,17]。此外,一些研究表明,基底心率降低,加上心律失常或增加心动过速的发生(18,19]。

心,β肾上腺素能受体(βARs),与G蛋白,发挥着至关重要的作用在调节心脏功能(20.,21];的刺激β₁农业研究所和β₂ARs增加心率通过营地生产(20.]。

在这项工作中,我们设计了一个在体外模型的小鼠心室心脏组织为了研究电磁和/或下的收缩运动β尤其是肾上腺素的刺激,寻址,变力和营养的影响。

2。材料和方法

2.1。老鼠的心脏跳动合胞体

自发地跳动心脏合胞体获得从1 -的心幼童cd -®老鼠幼崽(意大利查尔斯河实验室、Calco、意大利),如前所述[22- - - - - -24)做了一些调整。短暂,击败小鼠心肌细胞的主要文化准备在体外如下:心中很快被切除,心房被切断,心室与100年被孵化碎和消化μg / ml II型胶原酶(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和900年μg / ml胰液素(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)广告缓冲(0.1 M消息灵通的,0.1米D氯化钾葡萄糖,氯化钠0.5米,0.1米,0.1米不₂阿宝₄•H₂啊,0.1 MgSO₄在37°C) 15分钟。由此产生的细胞悬液是电镀前2 h在37°C减少的贡献nonmyocardial细胞。未婚,cardiomyocyte-enriched细胞收集悬浮,镀上collagen-coated 35毫米培养皿,和由马血清DMEM含10%,5%胎牛血清,1×庆大霉素(罗氏分子生化药剂,印第安纳波利斯)。约3×10⁵心肌细胞培养在每个培养皿37°C和5%的公司₂自发地形成一个跳动的心脏合胞体(即。,a cardiac cell culture made by multilayers of contracting cardiomyocytes as in our previous works [25,26])。

2.2。实验条件

3天的文化,以恒定的温度37°C和5%的公司₂观察,每个合胞体通过电影捕捉系统(普洛古莱C5、总部、德国)在四个不同的条件:未经处理的控制(CTRL);刺激通过β肾上腺素的异丙肾上腺素(ISO, 10μM;Sigma-Aldrich、米兰、意大利);通过电磁场刺激(电动势;有关详细信息,请参阅以下);并通过异丙肾上腺素和电磁场刺激(ISO + EMF)。特别是,对于每一个条件,AVI视频(持续时间、20 s) 20打合胞体收集每3分钟,允许我们专门研究平均收缩模式在时间间隔27-39分钟。

2.3。电磁生物反应器

这里使用的电磁生物反应器先前已被调查过的生物效应(27- - - - - -31日)和数值剂量测定法和物理参数(感生电场、感应电流和感应力)(13]。的设置是基于两个空心螺线管(见图1 (13])串联连接,放置在一个细胞培养箱,由脉冲发生器(从Igea Biostim SPT、腕、意大利)。感应磁场(模块,大约3吨;频率75赫兹)垂直于种子细胞。特别是,在我们的实验装置(我)在螺线管电流的线范围从0到319 mA在1.36毫秒;(2)为了优化空间感应磁场的均匀性,特别是在中部地区细胞被刺激的,这两个螺线管是由相同的电流及其尺寸和距离可比;空间均匀性计算在计算机13)和验证细胞内孵化器通过霍尔效应磁强计(图1);(3)最大的电磁能量密度应用于细胞约3.18焦耳/ m³使用热电偶,我们观察到没有电动势加热;(iv)在同一时间间隔的电磁刺激,控制细胞被放置到另一个,但没有EMF相同的孵化器。

2.4。通过附加的软件登记合胞体运动的标记

的视频位置跟踪器(VST)计划,用于跟踪一个或多个点的运动在一个AVI视频文件(http://cismm.web.unc.edu/software/),在每个视频,我们有系统地选择30点或标记在第一视频帧,根据相同的正交网格(32,33]。通过在威仕特启动视频,逐帧,程序和注册时空坐标x,y,t对于每一个标记,如前所述25]。的坐标x和y是用像素表示,而坐标吗t在年代。

2.5。击败合胞体的运动学和动力学

通过一个算法基于Matlab编程语言(MathWorks Inc .,纳蒂克,MA),逐帧和对于每一个标记,我们学习了运动学和动力学的跳动的心脏合胞体,如前所述[25,26,34)(见附件下面的数学细节)。特别是,在这个工作中,我们评估了合胞体收缩的最大收缩位移(像素),收缩性(最大收缩速度)(像素/秒)和收缩加速度(像素/秒²]。

2.6。免疫荧光分析

分离心肌细胞在单层培养在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C 48 h先前的四个条件。心肌细胞被固定为4%w/v多聚甲醛(Sigma-Aldrich) PBS (EuroClone,佩罗,意大利)10分钟在4°C。这些细胞被洗PBS和permeabilized 0.2%的解决方案v/v特里同x - 100 (Sigma-Aldrich)在PBS 10分钟在4°C和为进一步在室温下30分钟。

细胞被封锁和孵化隔夜小鼠单克隆抗体MHC获得杂种细胞(MF20, 1: 5v/v;杂种细胞发育研究银行,爱荷华大学),它能够识别sarcomeric肌凝蛋白表达的分化心肌细胞。随后,这些细胞被孵化45分钟在室温下与二次抗体(anti-mouse Cy3, 1: 50v/v;杰克逊ImmunoResearch,纽马克特,英国)共轭荧光探针。

这些细胞被然后用Eclipse Ti尼康显微镜观察。免疫荧光的量化是ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。

2.7。统计数据

为了比较结果之间的不同条件下,单向方差分析(方差分析)与事后至少显著差异(LSD)测试应用,选0.05的显著性水平。结果表示为均值±95%置信区间的方法之间的区别。

3所示。结果

在运动学方面(数据2和3),与对照组相比,异丙肾上腺素显示无意义的正性肌力作用( )和电磁刺激造成无意义的负性肌力作用( )。pharmacological-physical刺激显著降低异丙肾上腺素的正性肌力作用( ),提供一个整体相比显著的负性肌力作用与控制( )。

动力学(图4),与对照组相比,异丙肾上腺素表现出显著的正性肌力作用( )和电磁刺激引起显著的负性肌力作用( )。pharmacological-physical刺激显著降低异丙肾上腺素的正性肌力作用( ),提供一个整体相比显著的负性肌力作用与控制( )。

此外,在孤立的文化(图48 h后心肌细胞5和6),与对照组相比,异丙肾上腺素显示显著prosarcomeric效果( )和电磁刺激引起了重大antisarcomeric行动( )。药理和生理刺激的同时使用显著减少的影响异丙肾上腺素( 相比),提供一个整体重大antisarcomeric行动与控制( )。

4所示。讨论

鼠标是中心的研究由于操纵其基因组的高潜力和随之而来的可用性心血管疾病的模型。使用在体外击败主要鼠心室心肌细胞,我们研究了变更后的收缩机械力引起的电磁场和/或一个β肾上腺素能刺激(10μ异丙肾上腺素)(13,14]。

研究电磁场的作用在心脏功能感兴趣的由于心脏疾病的高速率和日常环境电磁接触(35]。然而,流行病学研究一直优柔寡断18,36]。

通过电磁生物反应器,先前描述(27- - - - - -29日,37- - - - - -45),我们之前的研究表明,低频电磁场的影响,减少新生儿小鼠心肌细胞的拍频,频率和振幅的胞内钙瞬变、收缩力,动能,同样的影响β肾上腺素能刺激(14]。

在目前的研究中,我们已经表明,低频电磁刺激能够抵消基底inotropism和β-adrenergically增强inotropism,可能由于内化β₂农业研究所(14)和/或通过AA / LTE4衣架钙通道的抑制信号通路(46]。

此外,反β肾上腺素的反应后短曝光(27-39 min) EMF抢占antisarcomeric / antihypertrophic效应由于长时间的曝光(48小时);换句话说,长期未充分利用sarcomeric装置造成的重构。

5。结论

尽管一些流行病学研究提高低频电磁暴露的担忧(18,36),这项工作提出了一个潜在的应用,生物物理刺激治疗心律失常和肥大。特别是,削弱的β肾上腺素的敏感性可以明显的缺血再灌注损伤,在去极化异常可能出现以外的正常传导组织造成危及生命的心律失常。

附录

被收缩和放松合胞体运动的活跃阶段,我们已经定义E作为击败合胞体的平均动能,在离散的视频: 在哪里的速度标记吗我在框架j,视频帧的总数,标记的总数( ),常数相关组织质量,不断来自单位米和像素之间的线性关系在一个给定的位图的AVI视频放大。在(. 1),对于每个合胞体,为了比较四种不同的实验条件(未经处理的控制(CTRL),刺激通过β肾上腺素的异丙肾上腺素(ISO),通过电磁场刺激(EMF),并通过异丙肾上腺素和电磁场刺激(ISO + EMF)],没有需要知道的质量组织或跳动一个常数,因为质量和常数是相同的在四个不同的条件和现场标记并列在同一网格的位置。此外,没有必要知道视频量度或B常数,因为指标和常数和视频放大条件是相同的。

根据Sonnenblick et al。(47,48),最大收缩速度是收缩性的一项指标。因此,为了研究可能变力作用下运动的角度来看,对于每一个标记在跳动,我们已确定最大收缩速度和最大收缩位移;然后,我们计算平均收缩性(像素/秒)(图3)和平均最大收缩位移(像素)(图2),分别。

为了研究可能变力作用下动态的角度来看,我们已经评估了合胞体收缩的哈密顿力学。所谓的哈密顿函数H动能和势能的总和。假设,在整个视频观察,有充足的可用葡萄糖培养基和随后的ATP生产和分配各向同性,P_{三磷酸腺苷},ATP-related势能的收缩运动,可以在时间和空间应该不变。因此,汉密尔顿合胞体运动微分方程来描述 在哪里和收缩力的正交组件吗和 是击败合胞体的动能函数。

然后,我们定义了标准化意味着收缩力,即意味着收缩加速度(图4)击败合胞体的一个离散的视频:

伦理批准

所有程序老鼠完成按照政策的意大利国立卫生研究所(协议号118/99-A)和动物保健伦理指南的欧洲共同体委员会(指令。86/609 / ECC)。cd -老鼠从查尔斯河实验室获得意大利(意大利Calco)和被安置在12 h光/暗周期,在恒定温度下,食物和水随意。老鼠被颈椎脱位牺牲。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作的研究经费支持等(等2010 -安德里亚兰兹和法比奥Naro),罗马Sapienza大学[Ateneo 2009法比奥Naro),和意大利的大学(FIRB 2010 RBAP109BLT, FIRB 2010 RBFR10URHP安德里亚兰兹和法比奥Naro;普林斯顿2010 kl2y73 - 006法比奥Naro]。

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