文摘
血小板过度活跃在动脉血栓和动脉粥样硬化中起着重要的作用。本研究旨在探讨影响不同的类黄酮提取蜂胶和组件的血小板聚集。富含血小板血浆制备和体外孵化与不同浓度的黄酮类化合物的提取和组件测试。血小板聚集是由不同的受体激动剂包括二磷酸腺苷(ADP, 10μ米),凝血酶受体激活肽(陷阱,50μ米),胶原蛋白(5μg / mL)。在25 mg / L到300毫克/毫升,水提取蜂胶(WEP)抑制三个agonists-induced血小板剂量依赖性的方式聚合。蜂胶中的黄酮类化合物分离还显示明显抑制胶原引起的血小板聚集,ADP,分别和陷阱。组件包括咖啡酸苯乙基酯(角),galangin,芹黄素、槲皮素、山柰酚、阿魏酸、芦丁、白杨素,pinostrobin,松属素和抑制血小板聚集的能力进行了研究。这是认为蜂胶黄酮类化合物主要是牵涉其中的抗血小板作用。
1。介绍
如今,心血管疾病(CVD)是全球发病率和死亡率的主要原因1- - - - - -3),给世界经济发展带来巨大的负担和人民的生活水平。众所周知,血小板止血和心血管疾病的发病机制中扮演很重要的角色,如急性冠脉综合征(4]。血小板抑制表明改进的短期和长期临床心血管疾病患者的治疗结果。然而,增加出血风险和高复发性缺血性事件不能被忽略的5]。此外,血小板的激活也与循环和血管损伤患者的高血压和糖尿病(6]。抗血小板药物应用于临床,治疗和预防冠状动脉综合征和中风都伴随着各种各样的副作用如血小板减少症、出血、胃溃疡、和治疗抵抗(7,8]。更安全有效的抗血小板药物是基于当前形势的迫切需要。
最近,自然产品和替代医学现在受到重要关注。蜂胶,包含各种化合物的复杂混合物,如类黄酮、萜烯,β-steroids,芳香醛、醇类,是由蜜蜂从植物材料收集植物的物质(9,10]。蜂胶是广泛用于食品和饮料来改善健康由于其独特的药理作用包括抗菌、抗氧化、免疫调节、王亚南,抗肿瘤,心血管效应(11- - - - - -21]。最近,刘和他的同事们提出,白杨素蜂胶执行抗血小板活动通过抑制血小板alphaIIbbeta3-mediated信号通路(22]。此外,数据表明,蜂胶证据涂层钴铬能显著降低血小板的粘附23]。许多研究表明,蜂胶组件是不同的在不同的地理和气候区域24]。因此,本研究的目的是研究蜂胶提取物对人类的影响体外血小板聚集和识别的性质的化合物抗血小板活动负责。
2。材料和方法
2.1。材料
蜂胶样本来自泰山冷杉在秋天。二磷酸腺苷(ADP)从Arkray购买(Aggrepack、日本)。胶原蛋白从奈科明购买(Kollagenreagens霍恩,奥地利)。凝血酶受体激活肽(陷阱)从Bachem购买(德国)。咖啡酸苯乙基酯(角)、galangin acacetin, pinostrobin从σ购买化工有限公司(美国)。
2.2。水提取物的制备蜂胶(WEP)和类黄酮
根据先前的研究25],一定量的干蜂胶样品冻结在−20°C溶解在30毫升蒸馏水60°C 7 h。粗提取液过滤,然后在28000 rpm离心机为30分钟,和上层清液集中在减压下产生WEP。从另一个10.0克干蜂胶黄酮类得到溶解在300毫升70%的乙醇7 h在室温下使用相同的方法(26]。
2.3。成分分析WEP和类黄酮
WEP的组件和类黄酮,zq - 4000高效液相色谱仪器(水域,美国)。色谱分离是通过使用对称C18柱(4.6毫米身份证3.5×150毫米,μ米),柱温箱温度维持在25°C。的流动相由乙腈和2%醋酸。流动相流速为0.2毫升/分钟,在280 nm和紫外吸光度是监控。稀释galangin的标准解决方案,斗篷,芹黄素、槲皮素、山柰酚、阿魏酸、芦丁、白杨素,pinostrobin,和松属素在同一高效液相色谱分析条件,此外,探测器响应的校准。量化的主要生物活性化合物从WEP和类黄酮是基于校准曲线。结果经农业部蜂产品质量监督检验中心(北京)。
2.4。血小板聚集试验
人类血小板悬浮液准备如前所述[27]。在这项研究中,志愿者被给定的知情同意。总之,从人类健康志愿者血液收集已经没有药在前2周和混合3.4% Na-citrate(9: 1卷/期)。血液离心液在1100 rpm 15分钟20°C。然后,富含血小板血浆(PRP)收集吸管和储存在室温下。管包含PRP在3000转离心10分钟20°C到获得platelet-pool等离子(PPP)。血小板计数(Sysmex se - 9000后,科比,日本),一个标准的200×109 / L浓度被稀释了PRP购买力平价。比浊法应用于测定血小板聚集的各种刺激受体激动剂使用一个集合度计(28]。之前的研究提到不同的黄酮类成分出现在蜂胶(acacetin,斗篷,galangin和pinostrobin)能抑制血小板聚集,所以斗篷,galangin, acacetin, pinostrobin测试在我们的研究(29日]。所有聚合测试后2小时内进行隔离和一式三份。每个人都有他/她自己的0% PRP和100% PPP聚合校准。聚合开始之前,标准血小板浓度是孵化在不同浓度的解决方案,包括WEP (300 mg / L, 100 mg / L, 25 mg / L),类黄酮(400 mg / L, 100 mg / L, 25 mg / L),角(352μ米、88μ米,6μgalangin(370米)μ米、185μ46米,μacacetin(352米)μ米、176μ米、44μ和pinostrobin(370米)μ米、92μ米,23μM)在室温下30分钟,然后prewarmed 37°C两分钟。聚合诱导了ADP、胶原蛋白或陷阱,分别。聚合的程度表示在光传输单位。
2.5。统计分析
结果显示为均值±标准差,每个实验进行了一式三份。使用SPSS19.0进行了统计分析,差异被认为是重大的水平 。
3所示。结果与讨论
3.1。蜂胶的化学成分
类黄酮是蜂胶的主要成分和蜂胶的药理活性贡献甚大。通常,蜂胶的质量是基于类黄酮质量(30.]。黄酮类化合物的内容取决于收获地区因为蜂胶的特点受到了当地的植物品种和天气(31日]。报告的WEP和黄酮类成分分析表所示1。角的内容在WEP最高,其次是galangin、阿魏酸、槲皮素、山柰酚、芹黄素。Pinostrobin是最丰富的黄酮类化合物,其次是galangin、白杨素,斗篷,芸香苷、山柰酚、松属素,芹黄素,槲皮素和阿魏酸。
3.2。不同的组件对血小板聚集的抑制效应引起的不同的受体激动剂
血小板聚集试验结果如图1和2。结果表明,原油WEP剂量依赖性地抑制血小板聚集,这可能会刺激不同的受体激动剂包括ADP、胶原蛋白和陷阱。例如,300 mg / L WEP显著降低ADP引起的血小板聚集,胶原蛋白,和陷阱35.00±5.34%,35.00±6.61%和42.33±13.24% ( ; ),分别说明蜂胶含有的化合物有抗血小板聚集活性。这种效应可能是由于极性化合物类黄酮和多酚等。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
类黄酮抑制三agonist-induced血小板聚合方式存在剂量依赖的相关性,以及抑制的百分比是53.11±1.90%,51.12±9.30%,和51.98±22.20%浓度的400 mg / L,分别。这一发现与之前的研究一致显示黄酮类化合物的抗血小板聚集活性体外(32和体内33]。我们也测试四个纯化组件,包括斗篷,galangin acacetin,松属素。所有测试剂添加到角PRP胶原引起的血小板聚集和陷阱显著下降( ),最抗血小板聚集效应发生在collagen-included测试组的抑制血小板聚集在176年58.82±4.51%μm .显著抑制中没有检测到ADP-included血小板聚集测试组当添加6μM角。当46μ米或更多galangin PRP,显著抑制检测collagen-included血小板聚集试验剂量依赖性的方式。Galangin无法抑制ADP-induced血小板聚集,直到370年μM galangin被添加。Acacetin可以显著抑制由ADP诱导血小板聚集,胶原蛋白,和陷阱浓度的44岁,176年和352年μ浓度的方式( )。从蜂胶的抗血小板聚集活性pinostrobin孤立(23μ米、92μ米,370μ米)是评估在ADP、胶原蛋白,和TRAP-induced聚合。如数据所示1 (f)和2 (f)可以抑制血小板聚集,pinostrobin 23 - 370的浓度μ米( )。角似乎比galangin和acacetin更有效的抑制剂。这种效力的差异可以解释为他们的化学结构34]。
孤立的类黄酮明显抑制由ADP诱导血小板聚集,陷阱,和胶原蛋白。介绍的抑制可能是通过抑制纤维蛋白原绑定到其血小板膜受体(糖蛋白(GP) IIb-IIIa),这是最后一个和血小板聚集的共同通路。据报道,类黄酮的根皮素降低ADP和TRAP-stimulated表达的活化形式GPIIb / iii a复杂和降低血小板聚集了ADP (30.]。其他一些研究表明,黄酮类化合物抑制血小板功能通过多种机制包括降低磷脂酶C活动(31日),清除活性氧,如超氧化物阴离子,合成,抑制环核苷酸磷酸二酯酶和血栓素A2 (32]。
4所示。结论
蜂胶的主要组件是galangin,斗篷,芹黄素、槲皮素、山柰酚、阿魏酸、芦丁、白杨素pinostrobin,松属素。WEP和从蜂胶中提取的类黄酮表现出剂量依赖性抑制作用引起的血小板聚集不同的受体激动剂包括ADP、胶原蛋白,分别和陷阱。角,galangin pinostrobin可能主要涉及。进一步的研究需要阐明血小板抑制作用的机制。
的利益冲突
作者指出任何潜在的利益冲突。
确认
作者感谢慷慨的金融支持中国国家自然科学基金(没有。81573717),国家关键技术研发项目的科学技术部(没有。2013 ga740103),山东省的科技开发项目(2015 gsf118168)和潍坊城市的科技部门(20100220)。