患病率和表型和基因型耐多药耐药机制铜绿假单胞菌从临床分离菌株、环境和阿善堤的家禽粪便样本地区的加纳

文摘

背景。抗生素耐药性细菌是一个主要的全球卫生挑战。报告耐多药的患病率铜绿假单胞菌,常见的病原细菌与院内感染和家禽的疾病,在加纳是有限的。因此本研究试图确定的流行铜绿假单胞菌从医院、家禽农场,并从加纳的阿散蒂地区环境样品。方法。粪便、尿液和血液样本364例患者,来自两个医院阿散蒂地区的加纳被随机抽样。铜绿假单胞菌是孤立的,使用常规选择媒体和pcr证实oprL基因扩增。Kirby-Bauer磁盘扩散方法采用EUCAST断点值被用来确定耐多药菌株。共同灭活酶和抗生素耐药性的发生编码基因和应变流出的评估能力进行了双圆盘协同测试(DDST) imipenem-EDTA协同测试,phenylboronic严峻考验,d测试、常规PCR,和溴化乙锭agar-cartwheel方法。结果。总共有87 (9.7%,n= 87/900)铜绿假单胞菌隔离被确认的样品。75% (n= 65/87)对超过一组的antipseudomonal代理,而43.6% (n= 38/87)耐多药(MDR)。扩展频谱的流行率很高β-lactamases(84.2%)、金属-β-lactamases(34.1%)和AmpC诱导cephalosporinases耐多药菌株的观察(50%)。大约57.8%的耐多药菌株显示中度到高射流能力。第1类整合子中发现89.4%的MDR隔离β内酰胺酶编码基因(bla_SHV,bla_TEM,bla_CTX-M,bla_VIM,bla_小鬼)没有检测到。结论。的耐抗生素菌株应常规监测在临床兽医实践在加纳进行通知选择抗生素治疗使用。

1。介绍

多重耐药病原菌的出现和传播是一个主要的全球健康问题(1]。细菌和人类的自然resistome影响抗生素使用分摊因素在耐药细菌的进化2]。增加使用抗生素在临床、环境和农业环境已经成为关键的选择和抗药细菌的传播3]。耐药性细菌的进化可能是由于突变事件期间推出的细菌的复制和垂直传播通过一代又一代在一个特定的细菌菌株的遗传变异4]。附件携带抗生素抗性基因元素决定因素(质粒、整合子和转座子)也可能传播细菌导致广泛的横向电阻(5]。在加纳,抗生素容易进行预防性和metaphylactic目的以及增长促进畜牧业(6]。开大剂量广谱抗生素,不依从规定的剂量,和长时间的抗生素治疗在地区和地区医院在全国加强病原菌的耐药菌株的进化(7]。一项研究显示,纽曼et al。8),假单胞菌物种是第二个最常见(14.0%)细菌隔离在全国6个月临床监测研究在加纳。铜绿假单胞菌无处不在的病原体,涉及一些医院感染患者(9]。它也导致pseudomoniasis,机会性感染的家禽像鸡,火鸡,鸭子,鹅,鸵鸟,感染鸡蛋杀死胚胎(10]。铜绿假单胞菌本质上是对许多抗菌药物呈现临床医生在治疗与一个巨大的挑战。几耐多药菌株已确定在许多环境领域从几个国家11]。β内酰胺抗生素、碳青霉烯、氨基糖甙类和喹诺酮类治疗中起到至关重要的作用铜绿假单胞菌感染。然而,多个电阻铜绿假单胞菌这些类的抗生素在飙升。抵抗这些组织的抗生素是受不同的耐药机制。其中主要的是抗生素降解酶的水解和灭活活动等β-lactamases和氨基糖苷类修饰酶(11),加上高效射流名叫孔和外部生物膜矩阵。耐喹诺酮确定地区的突变(QRDR)的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV改变喹诺酮的结构结合位点,从而赋予敏感性降低。对流行多种药物进行了报道铜绿假单胞菌隔离和抗生素抗性因素resistance-selection倾向环境如医院,动物农场,和污水在加纳是有限的。因此研究试图确定的发生铜绿假单胞菌菌株和常见的抗生素灭活酶的流行,移动遗传元素(整合子)和阻力编码基因铜绿假单胞菌从选定的家禽农场、医院和市场环境在库马西,加纳。

2。方法

2.1。伦理批准/批准

伦理研究间隙得到从人类研究出版物和伦理委员会(CHRPE),恩克鲁玛科技大学(KNUST),加纳库马西,。此外,从患者获得书面同意,农场经理和工人和所有参与这项研究。

2.2。研究地点,主题,并取样

这项研究是在阿散蒂加纳中部地区,位于0.15 - -2.251 W(图-7.46和5.50 N1(一))。该地区股票边界与加纳五16的政治区域。该地区包括总土地面积24389公里²(占总土地面积的10.2%加纳。2医院,即Suntreso政府医院,恩克鲁玛科技大学(KNUST)医院,137只家禽农场(图1 (b)),1公开市场(库马西中央市场),和Ayigya镇,位于加纳库马西阿散蒂地区(图1 (c)),被选为研究。选择库马西中央市场,因为市场交易员和高人口大多数农产品的销售点的大部分地区。粪便、尿液和血液样本两家医院的364名患者被随机抽样。276家禽粪便样本收集从137年家禽农场阿珊蒂地区的加纳。所有的样品收集2015年9月至2016年7月作为常规AMR监测的一部分(12]。拭子社区厕所、市场层和表、土壤和污水也进行了铜绿假单胞菌隔离。

2.3。分离和鉴定铜绿假单胞菌

细菌在不同的样本收集在soybean-casein-digest复活汤(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和孤立的溴棕三甲铵琼脂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。初步识别是通过革兰氏染色法检测过氧化氢酶和氧化酶活动,溶血素生产,增长42°C。绿脓菌素的生产,pyomelanin、pyorubin pyoverdine颜料被培养的隔离检查假单胞菌隔离琼脂(巴尔的摩阿尔法生物科学,医学博士,美国)。特有的隔离经放大外膜脂蛋白基因oprL(图2),提供确认所有这个物种的表型(13]。0.6μL 10μM正向引物(oprL-F (5′ATG棉酚ATG CTG AAA TTC GGC-3′)]和反向引物(oprL-R (5′CTT CTT CAG CTC广汽GCG ACG-3′)],聚合酶链反应进行了使用热循环(GeneAmp热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)在最后一卷25μL包含2μ12.5 L的DNA模板,μL GoTaq主混合(WI Promega,麦迪逊,美国),0.75μL(0.5毫米氯化镁,8.55μL nuclease-free水。在94°C DNA模板最初变性5分钟,其次是35周期为30秒94°C的变性,退火30秒的64°C,在72°C和扩展1分钟。最后,产品在72°C扩展了10分钟。PCR产品检查w / v 2%琼脂糖凝胶60 v和可视化使用透照器(美国WI Fotodyne,一起)。

2.4。抗生素敏感性测试

耐多药铜绿假单胞菌隔离是由确定的易感性铜绿假单胞菌隔离选择antipseudomonal抗生素使用Kirby-Bauer磁盘扩散技术。敏感性测试都是一式三份根据药敏测试的欧洲委员会批准的方法(14]。确保文化隔离的一个好的表示,大约5到7布置得井然有序的殖民地被挑选和悬浮在5毫升无菌蒸馏水和高速涡流直到暂停制服。暂停的浊度铜绿假单胞菌隔离决心用浊度计已经校准0.5麦克法兰。悬浮液的浊度适当调整到0.5麦克法兰,通过增加更多的殖民地或无菌蒸馏水。无菌棉签浸泡在培养液和旋转两次试管内一侧的去除多余的液体。拭子是用于连续20毫升的整个表面Mueller-Hinton琼脂(Oxoid、伦敦、英国)板而旋转一个角度的板60°重复裸奔(共三次)。借助一个磁盘自动售货机,十一抗生素磁盘从六个不同的类包括哌拉西林(pip - 100μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司)、羟基噻吩青霉素(tic - 75μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司)、头孢他啶(CAZ-30μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司),头孢吡肟(FEP-30μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司),aztreonam (ATM-30μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司),imipenem (IPM-10μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司),meropenem (MEM-10μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司)、环丙沙星(CIP-5μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司)、庆大霉素(CN-10μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司),左氧氟沙星(LEV-5μ英国贝辛斯托克g, Oxoid有限公司),和羟基噻吩青霉素/克拉维酸(tim - 85μg, Oxoid有限公司,英国贝辛斯托克)和孵化37°C用于24小时平均增长禁忌和标准差计算。至少一个代理有耐药性的菌株从三个或更多的抗生素类被确定为耐多药(15]。铜绿假单胞菌写明ATCC 27853作为参考控制压力。

2.5。双盘协同测试(DDST)扩展频谱β内酰胺酶(ESBL)检测

DDST用于检测beta-lactamases beta-lactamase抑制剂所抑制的如克拉维酸(16]。20毫升Mueller-Hinton琼脂(Oxoid,伦敦,英国)包含200个盘子μ克/毫升的邻氯青霉素被抽汲接种1.5×10⁸cfu /毫升标准化的培养液铜绿假单胞菌表面的琼脂用无菌棉拭子。Amoxicillin-clavulanic酸(20/10)μg盘放置在接种媒体的中心。头孢吡肟(30μg)、头孢他啶(30μg)、头孢噻肟(30μg),头孢曲松(30μimipenem (10 g)μg)和aztreonam (30μg)光盘从中央有20毫米盘。盘子被孵化24小时37°C。“鬼抑制区”的存在或协同抑制作用的抗生素对中央抗生素被记录。

2.6。——金属Imipenem-EDTA协同试验β内酰胺酶(MBL)检测

EDTA、polyaminocarboxylic酸结合金属离子锌-金属,使其失去活性β-lactamases使用锌打破衬底抗生素的酰胺键(17]。Imipenem-EDTA协同测试是根据李描述的方法进行et al。17]。Mueller-Hinton琼脂(20毫升)板注射5×10⁸CFU /毫升的测试生物体。一个imipenem盘(10μg)被20毫米的空白磁盘包含10μL (0.5 EDTA(图3 (b))。增强的抑制区imipenem和EDTA磁盘之间的区域被认为是生产金属-β-内酰胺酶阳性。

2.7。Phenylboronic KPC "的严峻考验

Phenylboronic酸作为水解活性的抑制剂KPC ", A和C类β-lactamases [18]。铜绿假单胞菌悬液稀释到0.5 MacFarland擦洗在20毫升Mueller-Hinton琼脂和两个互相meropenem光盘放置30毫米。20毫升20 g / L phenylboronic酸添加到第二个meropenem阀瓣和孵化20 h(图37°C3(一个))。一个≥5毫米的增加抑制带meropenem和phenylboronic酸盘相比meropenem盘仅表示KPC "酶的生产铜绿假单胞菌应变(19]。

2.8。d测试检测诱导AmpC Beta-Lactamases

AmpC d测试包含一个诱导物的酶和底物抗生素所描述的邓恩和哈丁20.)是用于检测AmpCβ内酰胺酶生产。抗生素盘诱导生产AmpC beta-lactamase酶(imipenem)被放置在两个底物抗生素光盘(头孢他啶和piperacillin-tazobactam)接种20毫升Mueller-Hinton琼脂。板是孵化24 h在37°C。d样式的形成抑菌圈在任何衬底光盘的imipenem-mediated感应AmpC衬底抗生素的生产和随后的失活β内酰胺酶。

2.9。射流泵的评估活动铜绿假单胞菌

溴化乙锭(EtBr)琼脂车轮方法所描述的马丁斯et al。21)是用来确定的射流能力铜绿假单胞菌隔离。溴化乙锭(EtBr)之间插入DNA和紫外线辐射下产生荧光。它还充当一个衬底对大多数细菌射流泵。因此迅速抽出的过表达射流泵导致缺乏荧光细菌的质量(21]。隔离的铜绿假单胞菌在5毫升的营养肉汤培养(Oxoid、伦敦、英国)37°C 24 h。光密度(OD)文化的麦克法兰调整到0.5。Mueller-Hinton琼脂(20毫升)板块含有溴化乙锭的浓度在0到2.5 mg / L分为部门形成一个车轮的模式。OD调整文化被擦洗EtBr琼脂板从中心到边缘的盘子。每个盘子都擦洗铜绿假单胞菌写明ATCC 27853年担任比较控制。16 h琼脂板被孵化的37°C和检查UV-transilluminator下。EtBr (MC的最低浓度_EtBr),细菌产生的荧光质量孵化24 h后用于确定流出的各种隔离(图的能力3 (c))。每个细菌菌株的能力流出EtBr排名相对于参考菌株(铜绿假单胞菌写明ATCC 27853)通过计算射流能力指数(σ):

是最低浓度产生荧光的EtBr MDR吗铜绿假单胞菌。 最低浓度产生荧光的EtBr吗铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。流出活动被评为很高(σ^∗∗∗∗= 7 - 9),高(σ^∗∗∗∗= 4 - 6),中等(σ^∗∗∗∗= 1 - 3)和低(σ^∗∗∗∗= 0)。

2.10。检测β-Lactamases和氨基糖苷类修饰酶编码基因

抗生素抗性基因编码的一些基因变异ESBLS (bla_SHV1,bla_TEM1,bla_CTMX),MBLS (bla_VIM和bla_小鬼)和氨基糖苷类修饰酶(aac(3)第四)寻求MDR隔离。使用正向和反向引物在表1,聚合酶链反应进行了使用热循环在最后一卷25μL包含2μ12.5 L的DNA模板,μL GoTaq主混合,0.75μL(0.5毫米氯化镁,8.55μL nuclease-free水。在94°C DNA模板最初变性5分钟,其次是35周期为30秒94°C的变性和扩展的1分钟72°C。退火温度bla_SHV1,bla_TEM1,bla_CTMX,bla_VIM,bla_小鬼,aac(3)第四56°C 1分钟,1分钟58°C, 60°C,持续30秒,51°C 1分钟,1分钟55°C,分别为1分钟和50°C。最后,产品在72°C扩展了10分钟。PCR产品进行2% w / v琼脂糖凝胶60 v 120分钟使用透照器和可视化。

2.11。整合子的检测铜绿假单胞菌隔离

细菌基因组或质粒DNA可能含有抗生素抗性基因和基因磁带(整合子)编码抗多种抗菌药物。为了确定整合子的患病率在隔离,放大的5′守恒(GGCATCCAAGCGCAAG)和3′守恒(AAGCAGACTTGACCTGA)地区1类整合子和2类整合子(正向和反向引物int2-F和反向int2-R)进行。反应条件是一个初始变性5分钟在94°C,进一步在94°C变性1分钟,退火59.5°C 1分钟(类整合子)为1分钟和60°C扩展72°C(2类整合子)为4分钟。终于在72°C扩展的产品10分钟。5μL的扩增子被加载到一个20-well w / v琼脂糖凝胶1.5% 1 x TAE(1毫米EDTA 40毫米Tris-acetate)并运行在65 v为340分钟。

3所示。结果与讨论

总共有87铜绿假单胞菌隔离被证实从临床、环境和家禽粪便样本。形态,铜绿假单胞菌分离株革兰氏阴性(图4(一))单细胞棒出现黏液状的或nonmucoid殖民地。黏液状的形成主要是由于海藻酸泥的形成,这是假定在殖民和毒性中发挥作用27]。的识别铜绿假单胞菌隔离包括识别生产可溶性色素(图4 (b)),绿脓菌素(蓝)28,29日),荧光素(黄绿色)pyorubin(红色)(30.),或pyomelanin(红褐色)[31日,32),增长42°C,过氧化氢酶生产和测试(图4 (c)),β红血球溶解在血琼脂(图4 (d))。

38铜绿假单胞菌菌株从临床、环境和家禽垃圾来源未能产生特征色素被确定通过超载比L基因扩增。这是符合报告De Vos et al。13)和Douraghi et al。33)的敏感性超载比L外膜基因扩增鉴定铜绿假单胞菌从临床和环境资源。

有低流行率铜绿假单胞菌(9.6%),从各种来源收集的样本。162的900个样本,隔离被确定通过文化和生化特征(数字4(一)- - - - - -4 (d))。铜绿假单胞菌从环境分离株(13.4%,n= 35/260)和临床(12.9%,n= 47/364)样本更普遍比家禽垃圾(1.8%,n= 5/276)样本。临床样本中,铜绿假单胞菌在凳子上非常普遍(39.7%,n=比尿液样本(15.4%,31/78)n= 15/97)的患者 (表2)。这可能是由于,除了居民铜绿假单胞菌殖民的胃肠道,大多数摄入食物,尤其是生食品和熟食,可能污染铜绿假单胞菌和其他致病菌(34,35]。

这可能会增加胃肠道的殖民,因此其高患病率在凳子上。所有患者的血液样本没有包含铜绿假单胞菌。缺席的情况下铜绿假单胞菌血液样本,然而,表明患者参加了这项研究没有引起败血症铜绿假单胞菌。然而,这一发现是主机(相反的报告36),从Komfo Anokye教学医院在库马西,加纳,11.83%的187个样本从患者的血液铜绿假单胞菌殖民。

7%的确认铜绿假单胞菌压力(n= 6)隔离的敏感所有antipseudomonal组进行了研究。1、16和21家禽粪便,临床和环境的隔离铜绿假单胞菌耐多药。从这项研究中,近一半(43.6%)的隔离是对至少三个antipseudomonal组(图5)。阿多比较这些结果的研究(37MDR)报告13.04%在铜绿假单胞菌隔离从伤口的患者同样显示了MDR的数量激增铜绿假单胞菌分离菌株的研究。

酶水解的β内酰胺环抗生素可能是扩展频谱β-lactamases (ESBLS),金属-β内酰胺酶(MBLS),诱导cephalosporinases (AmpC)或" (KPC) [38];β内酰胺酶抑制剂如克拉维酸抑制β-lactamases产生的细菌,从而可能增加的活动β内酰胺酶底物抗生素(39]。他们因此可以用于检测的酶诱导细菌物种使用双圆盘协同测试(DDST)。添加邻氯青霉素抑制AmpC酶的活性(16]。在这项研究中,ESBLs被发现在84.2% (n= 32)(表3MDR的)铜绿假单胞菌隔离。近88%(14/16)的临床和环境MDR 80.9% (17/21)铜绿假单胞菌分离产ESBLs,说明这些酶的临床和环境隔离。MDR的铜绿假单胞菌隔离从家禽生产ESBLs垃圾还发现。大约5%的研究没有产生隔离β内酰胺酶的酶。尽管扩展频谱β内酰胺酶(ESBL)酶普遍在84.2%的MDR隔离,仅ESBLs只有34.2%。这类似于纽曼等人的结果。8)检测到高ESBL生产(90 - 98%)革兰氏阴性隔离来自南部,中部和北部部门的加纳。-金属β内酰胺酶酶(MBLs)和诱导AmpCβ-lactamases被发现在MDR隔离的34.2%和50%,分别。

没有一个铜绿假单胞菌隔离产生KPC类型"酶。协同生产的ESBL MBL AmpC主要在隔离和出现率从21.1到44.7%。ESBL和AmpC协同生产(44.7%)是最普遍的MDR隔离,但碳青霉烯(meropenem和imipenem)对这些酶生产商仍然有效。ESBL生产商也容易受到碳青霉烯Feglo报道和主机40],这证实了他们的作用的产ESBL菌菌株感染的治疗。在一个相关的报告Feglo和主机40]在187铜绿假单胞菌隔离库马西,44.9%是AmpC生产者和21.9%是ESBL生产商。这些发现表明ESBL患病率和MBL患病率的增加。

AmpC的患病率相对较高的比其他研究报告在德里,印度(20.7%)(41],MBL患病率相似的发现来自巴西的报道36.4%±14.1 MBL发生铜绿假单胞菌(42]。这些发现可能表明地理AmpC生产的患病率的变化铜绿假单胞菌可能是由于低使用头孢菌素的诱导酶生产的。

共同ESBL编码抗生素抗性基因的遗传变异(bla_SHV,bla_TEM,bla_CTMX)没有检测到任何的MDR隔离。最常见的MBL编码基因(bla_小鬼和bla_VIM)还没有检测到任何的隔离。尽管一些常见β内酰胺酶耐药基因没有发现,酶产品的隔离检测这些基因表型。这表明,其他β内酰胺酶编码基因等bla_每,bla_VEB,bla_全球经济,bla_PSE,bla_SPM,bla_GIM,bla_目的,bla_的NDM、AmpC和bla_OXA,被发现铜绿假单胞菌从其他地理区域(38),可能是负责监管β内酰胺酶酶生产。阿多的类似研究[37布鲁里溃疡Korle教学医院),和地区医院,知识,加纳,阿克拉也没有发现bla_VIM和bla_小鬼"编码基因铜绿假单胞菌菌株从糖尿病、燃烧和cellulitic伤口的患者,建议低流行率铜绿假单胞菌在加纳。

没有这些ESBL酶类型可以大大提高敏感性铜绿假单胞菌菌株,β内酰胺基板如头孢菌素头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟,monobactams (aztreonam) carboxypenicillins, ureidopenicillins。——金属的缺失β内酰胺酶编码基因("),然而,表明没有影响的碳青霉烯酶变异(meropenem和imipenem)抵抗的铜绿假单胞菌菌株孤立。

循环的酶组TEM、SHV CTX-M,然而,被发现在许多大肠杆菌从病人菌株Komfo Anokye教学医院,加纳库马西(40]。IMP-1、IMP-6 IMP-9、VIM-1 VIM-3和其他金属酶变异也被发现铜绿假单胞菌隔离来自其他国家如日本、中国、新加坡、巴西、意大利、希腊、台湾,和伊朗(43]。铜绿假单胞菌可能获得耐氨基糖甙类通过一系列的耐药机制包括酶改性(44]。氨基糖苷类耐药基因的存在AAC(3)第四(耐庆大霉素、妥布霉素和netilmicin)决心MDR gentamycin-resistant和敏感P。绿脓杆菌。没有AAC(3)第四在任何的MDR基因检测铜绿假单胞菌隔离。这个规则的影响酶变异的菌株耐药研究氨基糖甙类。

总共57.8%的MDR隔离了中度到高射流泵活动(表4)。这可能过于活跃肯定流出的抗生素细菌细胞减少的活动antipseudomonal抗生素。

4所示。结论

有低患病率(9.6%)铜绿假单胞菌在临床、环境和阿善堤的家禽粪便样本地区的加纳。然而,一个明显的MDR的数量激增铜绿假单胞菌株在临床和环境样品。有高患病率ESBLs (84.2%)、MBLs(34.2%),和诱导cephalosporinase (AmpC)酶(50%)铜绿假单胞菌从加纳阿散蒂地区的隔离。移动遗传元素(类整合子)也非常普遍(89.4%)铜绿假单胞菌菌株。抗生素与活动铜绿假单胞菌怀著这些抗生素降解酶和抗整合子应该推荐给相关感染的临床治疗。常规监测的新兴MDR致病菌菌株应进行潜在的高AMR领域的选择。此外,一些研究焦点应该是指向寻找抗标记活动对耐多药病原菌。

缩写

聚合酶链反应:	聚合酶链反应
ESBL:	扩展频谱β内酰胺酶
MBL:	-金属β内酰胺酶
耐多药:	耐多药。

数据可用性

研究的数据是可用的大学机构库KNUST空间通过以下链接:http://dspace.knust.edu.gh/handle/123456789/10233。

伦理批准

伦理研究间隙得到从人类研究出版物和伦理委员会(CHRPE),恩克鲁玛科技大学(KNUST),加纳库马西,。

同意

获得书面同意从农场参与者和病人。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

何进行实验工作,并分析了实验数据。VEB监督实验工作,分析数据,并起草了第一个手稿。YDB分析数据和修改后的第一个手稿。CA构思、设计和监督项目和协调的写作和修改最后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者感谢各个医院的官员和技术人员在阿散蒂加纳地区的合作和援助在这学习。

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