埃塞俄比亚东部污水系统分离细菌的抗生素耐药性概况

摘要

世界卫生组织自2015年以来发起了一项关于抗菌素耐药性的全球行动计划。除其他目标外，该计划还旨在通过监测和研究加强对抗菌素耐药性传播的认识。考虑到废水系统的高细菌密度以及它们接受抗生素、金属和其他选择性试剂，废水系统理所当然地成为抗生素耐药性监测的热点。当前的研究报告了2018年2月至2019年10月在埃塞俄比亚东部选定的废水系统中进行的抗生素耐药性监测的结果。我们对埃塞俄比亚东部的三个污水系统进行了18个月的监测，如迪勒达瓦大学的活性污泥系统、哈拉马亚大学的废物稳定池和Hiwot Fana专科大学医院的化粪池。我们从11个采样点采集了66个废水样本，利用选择性培养基和生化试验分离出722个细菌。我们使用标准的Mueller-Hinton琼脂表面Kirby-Bauer纸片扩散法检测了它们的抗生素敏感性，并根据EUCAST指南解释结果。结果显示，医院废水分离株对氨苄西林的耐药率最高，分别为36(94.7%)、33(91.7%)和32 (88.9%)大肠杆菌,大肠都有效,分别。活性污泥废水处理系统分离株对庆大霉素的耐药率较低，分别为10(16.4%)、8(13.3%)、11(18.9%)和12 (20.3%)大肠杆菌，粪大肠杆菌，屎大肠杆菌，和铜绿假单胞菌,分别。医院废水比其他两个废水系统表现出更高的阻力。在废水的过程处理过程中，多重抗生素耐药指数(MARI)显著增加，表明耐药性在废水处理系统中扩散。

1.介绍

微生物对常用抗生素的耐药性增加已成为当前医疗实践中的一个主要挑战。考虑到它对全球公共卫生造成的威胁，世界卫生组织(WHO)宣布，抗生素耐药性是“对公共卫生的主要威胁”[1］.这种抗生素耐药性的增加趋势将使常规感染得不到有效治疗，手术将变得危险，并增加医疗保健实践的支出[2］.

废水系统含有大量共生的人类和动物细菌以及抗生素耐药性决定因素，是抗生素耐药性的热点，在这里抗生素耐药性发展、增殖并排放到环境中[3.- - - - - -5].然而，以前出版物中报告的数据有时不一致且相互矛盾。例如[6，7]研究表明，由于细菌持续暴露于抗生素的亚抑制浓度，废水处理厂提供了一个可能适合抗生素耐药基因（ARG）和抗生素耐药细菌（ARB）增殖的环境。相反,[8显示持续暴露于三氯生敏感物质金黄色葡萄球菌菌株对三氯生亚抑菌浓度没有促进三氯生敏感性或其他靶向抗生素的任何变化。

尽管努力阐明废水处理厂（WWTPs）的作用关于抗生素耐药性，仍然没有明确的证据表明污水处理厂，特别是生物处理工艺，正在促进抗生素耐药性的扩散。一些研究表明，污水处理厂可显著减少ARB的数量[9，10]，而其他研究表明，污水处理厂是ARB和ARG的主要贡献者[11]。这些不确定性可能来自于评估不同处理技术、操作条件、进水水质或废水成分以及检测ARB和ARG的不同方法的研究。因此，需要进行更多的研究和分析，以评估废水处理工艺在抗生素耐药性扩散和缓解方面的作用。因此，本研究旨在评估环境抗性指示生物的抗性模式，并检验废水系统强化指示生物抗生素抗性的优势。

2.方法

2.1.研究设置和采样位置

2018年10月至2019年4月，在埃塞俄比亚东部选定的废水系统（活性污泥系统、废物稳定池和化粪池系统）进行了抗生素耐药性监测。活性污泥系统和废物稳定池分别是从德雷达瓦大学和哈拉马大学的宿舍、自助餐厅、动物养殖场和实验室接收污水的全尺寸工厂（图1）1)第三个监测点是Hiwot Fana专门大学医院（HFSUH）接收医院废水的化粪池系统。德雷达瓦大学废水处理厂是一个活性污泥系统（ASS），由初步废物处理装置（除砂和稳定池）、一个初级沉淀池（多特蒙德池）、一个活性污泥系统（曝气装置和二次沉淀）和废物氧化池组成。Haramaya大学废水处理厂是一个废物稳定池（WSP），由一个筛选装置、两个主要兼性池和一个熟化池组成。在废水处理过程中，在每个单元操作/工艺的进水和出水位置收集废水样本。

2.2. 样本采集

废水样品于2018年10月至2019年4月每季度从废水系统的指定采样地点采集。用70% (v/v)酒精消毒的塑料容器采集样品。取样时，用样品水冲洗样品容器三次，然后装进样品。为了获得具有流动代表性的样本，将在上午8点至11点的30分钟间隔内采集的抓取样本进行积分，获得实际样本。采集后，样本被保护起来，不受阳光直射，并装在一个装有冰袋的冷却器中运送到实验室进行分析。所有样品保存在4^◦C，并在样品采集后24小时内进行分析。

2．3.废水的特点

使用数字pH计对废水样品进行现场pH分析。实验室按照标准方法分析化学需氧量（COD）、生化需氧量（BOD）和总悬浮固体[12]。每次废水取样时，收集废水处理厂的流量、停留时间和除泥率等运行条件数据。

2.4. 细菌计数、分离和鉴定

使用水质和废水检测的标准方法对水样进行目标细菌分析[12］.样品在分析前要彻底混合，使细菌均匀分布。在无菌蒸馏水中制备连续稀释的样品(10-2-10-6)。从每个样品的稀释重复中提取50毫升，用0.45过滤µM，直径47毫米，纤维白色网格过滤器放置在过滤器支架上。首先加入约25毫升蒸馏水来湿润滤纸。根据制造商推荐的程序选择培养基，并在15磅压力(121°C)下进行高压灭菌15分钟。用适当的选择性培养基将膜过滤器无菌转移到45 mm培养皿中。

R2A琼脂用于37°C培养24小时后异养细菌总数的计数。mEndo LES琼脂用于37°C和44.5°C培养24小时后的总大肠菌群计数，mFC琼脂用于粪便大肠菌群计数。m-TEC琼脂用于耐热细菌计数大肠杆菌35–37°C持续2小时，温度为44.5 ± 0.5°C，持续22小时。用于隔离粪肠球菌和肠球菌都有效,采用间肠球菌琼脂。37℃孵育，24、48 h后读取结果。最多五个随机选择的推测肠球菌曼陀罗球菌琼脂菌落在培养基上传代培养肠球菌差异琼脂基(TITG Agar Base)用于鉴别粪肠球菌和屎肠球菌.在35–37°C下用1%的TTC溶液培养18–24小时后，具有深红色中心和窄白色边缘的菌落被鉴定为粪肠球菌，而白色或淡粉色的菌落被认为是屎肠球菌. 采用西曲米特琼脂分离纯化铜绿假单胞菌37°C孵育48小时后我们使用马达思班-V琼脂用于分离细菌气单胞菌属．在恒温培养箱中孵育，孵育条件见表1铭牌上标明废水处理厂、采样位置、日期和样本编号。

2．5．抗菌药物敏感性试验

除医院废水采集3株菌株外，每个样品采集2株菌株进行抗菌药物敏感性试验(AST)。采用标准柯比-鲍尔纸片扩散法测定分离株的抗菌药物敏感性[13].通过将新生长的细菌悬浮在4-5%的溶液中制备细菌接种物 ml生理盐水，浊度调整至0.5 McFarland标准。然后，使用棉签将该悬浮液涂抹在Mueller-Hinton琼脂的整个表面，以产生融合生长。

药敏试验是将浸渍了一定量抗生素的纸片置于琼脂上培养的细菌草坪上，35 + 1°C有氧培养18-24小时。在孵育一段时间后，测量抑制区的直径，即没有细菌生长的圆盘周围的面积。

表型耐药性通常根据临床标准和推荐的断点进行解释。解释环境细菌抗生素耐药性的更可靠的替代方法可能是欧洲抗生素敏感性试验委员会（EUCAST）制定的流行病学临界值（ECOFF），在给定的分类群中，将具有获得性耐药机制（非野生型）的种群与无耐药的野生型种群分开。与临床断点相比，ECOFF值是基于流行病学的，与治疗效率无关，并且在不同的委员会之间没有差异[14］.本研究的抑制带直径根据EUCAST指南进行了解释[15),除了大肠杆菌检测四环素、Enterococci经临床实验室标准研究所评估的测试[16)的指导方针。本研究中使用的每种抗生素的磁盘内容和断点见表2．

2.6。多重抗生素耐药指数

用公式测定每个分离物的MARI值 ，哪里一个表示抗生素的数量，该测试分离出耐药性和b表示已就化验分离物的敏感性进行评估的抗生素总数[17]。MARI值为0.2表示经常使用抗生素的高风险环境[18，19］.

2.7。分析

在R编程环境中使用描述性和推理统计工具进行数据分析。一个值≤0.05为差异有统计学意义。选择箱形图来说明使用平均值的MERI值的分布。为了决定使用哪种统计检验来确定显著性，首先使用夏皮罗-威尔克检验分析数据的正态分布。数据不是正态分布的，使用Kruskal-Wallis检验(经典单因素方差分析(ANOVA)的非参数版本)来确定被研究细菌组之间抗生素耐药性水平的变化(由MERI测量)。结果用于判断三个监测系统之间的抗生素耐药性水平是否存在显著差异，以及抗生素耐药性水平在污水处理过程中是否存在差异。

3.结果和讨论

在指定的监测期间，从2018年2月至2019年10月，每季度进行6次监测，在3个监测点的11个采样点采集66个样本(表)3.)．在监测的废水系统中，共分离出722株抗生素耐药菌株，并对其对常用处方抗生素的敏感性进行分析。

3.1.废水的理化和细菌学特性

表中列出了所分析废水的选定物理化学和生物学特性4．三个系统的废水特性(物理化学和微生物负荷)几乎具有可比性。进入Haramaya大学废弃物稳定池的畜禽养殖场废弃物有机负荷和细菌负荷均最强，平均BOD和COD分别为1108.33和1275.33 mg/L，分别为5.5510⁸, 2.7410⁸和1.1310⁸ cfu/100 mL代表总大肠菌，粪便大肠杆菌，Enterococci。spp。,大肠杆菌,分别。Haramaya大学废弃物稳定池熟化池出水pH值为9.25,Dire Dawa大学活性污泥系统氧化池出水pH值为9.45。污水厂处理效率见表4作为具体的物理、化学和细菌污染物的对数减少。在对数尺度下，WSP对COD的去除率为0.83，活性污泥系统对总大肠癌的去除率为3.21。

BOD / COD比值是衡量废水特性的重要指标，表明废水的可生化性[20]及微生物群落[21，22］.未处理生活废水的BOD/COD比值的典型值为0.3 ~ 0.8 [23]在ASS和WSP中处理的废物的BOD/COD比率分别在原水的0.79到出水的0.61之间和原水的0.87到出水的0.46之间。这使其适合于生物处理，从而使ASS和WSP成为处理此类废物的正确选择。ASS和WSP的微生物去除率均达到95%至99%的高水平。这可能与阳光、藻类生长和pH升高之间的相互作用有关[24］.

３.２．细菌分离株的抗菌药物敏感性谱

这项研究评估了十种常用抗生素对五种细菌的耐药性水平，结果见表5．在三个监测地点和整个废水处理过程中，有151个大肠杆菌分离并测试它们对十种常用抗生素的耐药性模式。抗生素耐药模式大肠杆菌如图所示2．如图所示,大肠杆菌阻力较高β-内酰胺类和头孢菌素类，如氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸，而氨基糖苷类(庆大霉素和阿米卡星)和碳青霉烯类(美罗培南)则较低。

分离物显示出对细菌的敏感性降低β-所有监测点的内酰胺类药物和头孢菌素（氨苄西林、阿莫西林/Clav和头孢他啶）。同样，在所有位点，分离株对氨基糖苷类药物（庆大霉素和阿米卡星）和碳青霉烯类药物（美罗培南）的敏感性都较高。对氨苄西林的耐药率最高，为94.7%大肠杆菌其次为头孢他啶，发生率为86.8%大肠杆菌从医院废水中分离出来除氨苄西林、阿莫西林/克拉夫、头孢他啶外，其余抗菌药物的耐药频率均<50%，如图所示2．

三个监测点共286个肠球菌spp。(144粪大肠杆菌和142年大肠都有效)对5种常用抗生素进行耐药性测试，如氨苄西林、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星和复方三唑。抗生素敏感性试验结果如图所示3.．两个隔离的肠球菌对氨苄西林和复方新诺明表现出较高的耐药性，对庆大霉素表现出较高的敏感性。的电阻粪大肠杆菌在化粪池污水中庆大霉素的含量为13.3%，在医院化粪池污水中氨苄青霉素的含量为91.7%。同样，抗生素的耐药性大肠都有效庆大霉素在化粪池系统废水中的比例为18.9%，氨苄青霉素在化粪池系统废水中的比例为88.9%。

总计143铜绿假单胞菌从ASS(59例)、WSP(48例)和STS(36例)中分离得到。对分离菌株对头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、美罗培南等7种抗生素进行耐药性检测，结果见图4．如图所示,铜绿假单胞菌分离株对头孢他啶和头孢吡肟等头孢菌素表现出较高水平的耐药性，而对庆大霉素和美罗培南表现出较高的敏感性。ASS分离株对美罗培南的耐药率为18%，医院STS分离株对头孢他啶和头孢吡肟的耐药率为77.8%。

从三个地点采集66个样本，142个气单胞菌属对头孢他啶、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星和复方新诺明等5种评价抗生素进行耐药性检测。分离株对复方新诺明、头孢他啶和头孢吡肟表现出较高的耐药性，而对左氧氟沙星表现出较高的敏感性。

根据表所示的药敏试验结果5来自医院废水的分离菌对所有分离菌和经检测的药物均显示出较高的耐药性特征。所有菌株对医院废水中AMP的耐药性百分率最高，分别为36(94.7%)、33(91.7%)和32 (88.9%)大肠杆菌，粪大肠,和屎肠球菌，分别。GEN10对活性污泥废水处理系统的阻垢率分别为10(16.4%)、8(13.3%)、11(18.9%)和12 (20.3%)大肠杆菌、粪大肠杆菌、屎大肠杆菌和铜绿假单胞菌，分别。

因此，来自医院废水的分离株对所有分离株和试验药物均表现出较高的耐药性特征，而阿斯兰的分离株则对所有分离株和试验药物表现出较低的耐药性。所有菌株中对医院废水氨苄青霉素耐药性的百分比最高，分别为36(94.7)、33(91.7)和32 (88.9)大肠杆菌，粪大肠杆菌,屎肠球菌，分别地活性污泥废水处理系统中庆大霉素的耐药率较低，分别为10（16.4）、8（13.3）、11（18.9）和12（20.3）大肠杆菌，粪肠杆菌，粪肠杆菌,铜绿假单胞菌,分别。更高层次的大肠杆菌在医院废水中发现耐药性，美罗培南的耐药率为42.1%，氨苄西林的耐药率为94.7%。

各指标变量中，医院废水中耐药菌的分离率均高于非医院环境;这在统计学上具有显著性( )．[25］.三种废水系统的环境阻力差异可能与不同的源废水类型有关。污水主要是人类粪便，其中既有耐抗生素细菌，也有抗生素残留物。在有利条件下，这种混合物营养含量高，细菌之间密切接触，可促进抗生素耐药性的传播[26]然而，WSP的进水废水主要是畜牧业废水，其中可能含有大量抗生素残留，这反过来有助于提高抗生素耐药菌的分离率[27］.除了在人类医学、畜牧业和农业中滥用抗生素之外，其他因素可能会破坏微生物平衡，有利于耐药细菌。众所周知，医院会排放致病菌，其中大多数可能携带耐药性决定因素进入其废水，尿液、粪便和溢出和过期的药物中的微量抗生素被不当地丢弃到脸盆中，都被输送到废水系统。

３．３．污水处理过程中多药耐药水平的变化

三个监测点之间抗生素耐药性水平的差异及其在废水处理过程中的变化如方框图所示5和6,分别。如图所示的箱线图(图5)，三个监测点的MERI值存在明显差异，医院废水的STS多药耐药率较高。

用MERI平均值测量的多药耐药水平在三个监测点的每个阶段也显示出明显的差异。图中的柱状图6描述了废水处理过程中平均MERI值的变化。对于每个受监测的废水现场，与未经处理的废水相比，废水的MERI水平较高。ASS和WSP在每个阶段都有所增加。

MARI已被用来估计与环境中耐药性传播相关的健康风险。MARI值为0.2(任意)用于区分低健康风险和高健康风险，MARI大于0.2表明细菌菌株来自高污染或使用抗生素的环境[18］.从我们的研究站点获得的ASS、WSP和STS分离株的MARI估计分别为0.287、0.36和0.639。这些指标均大于0.2，表明该菌株来自抗生素使用或污染严重的环境。高毛伊岛这一研究获得的值可能会建议分离抗生素的接触压力,这可能会导致不适当的使用抗生素在研究区人口中,并可能导致进一步的多药耐药性的发展增加加班如果适当措施不到位28］.

研究表明，在污水处理过程中，阻力的强度增大。在废水处理过程中，菌株的多药耐药情况明显增加。这可以被认为是废水系统倾向于加强抗生素耐药性的迹象。目前，没有明确证据显示污水处理厂会否产生抗药性[29］.在废水处理厂中存在的抗生素耐药性决定因素和耐药细菌的优势之间的因果关系尚未被很好地建立。然而，已有证据表明，废水，甚至是经过处理的废水，与其他水生环境中所含的相应比例相比，所含各种耐药细菌的比例更高[10]根据以往的研究，废水处理厂的条件有利于ARB和非耐药细菌的增殖，以获得耐药基因[30］.Goñi-Urriza等[31]监测了废水处理厂和接收河出水中的抗生素耐药菌群，并在抗生素敏感性试验中发现，在所试验的22种抗生素中，有21种菌株对抗生素的耐药性显著增加肠杆菌科和气单胞菌属仕达屋优先计划．收集下游的污水排放点。Iwane等人[32]也报道说，在污水处理厂下游，耐四环素大肠菌群的比例增加了6.8%。

这份报告有很多优点；提到一些，我们试图通过排除导致内在耐药性的细菌/抗生素组合来避免错误的“高耐药性”警报。在交叉阻力是一项规则的情况下，我们显著减少了冗余测试。虽然这项研究解决了重要的环境健康问题，但它并非没有局限性。我们无法确定导致表达抗性的基因。我们也无法确定抗生素耐药性决定因素的水平，如废水系统中的抗生素残留、重金属浓度和抗生素耐药性基因。此外，未确定分离细菌的碳青霉烯酶和超广谱β-内酰胺酶模式。

4.结论

我们的抗生素耐药性监测项目显示了废水系统在废水系统中抗生素耐药性扩散中的作用。该研究发现，废水系统中存在大量的环境抗生素耐药性指标细菌。对抗生素的多重耐药模式在分离株中很常见。在污水处理厂中，随着处理过程的不断进行，抗性的百分比有所增加。医院废水对试验抗生素的耐药性高于其他两个废水系统。各污水处理厂在污水处理工艺的推进过程中，多药耐药指数显著提高。这可能表明在废水处理系统中阻力的扩散。

不应忽视这些废水系统中存在抗抗生素微生物。未来，废水系统的设计应能控制抗生素耐药细菌的传播。处理设计中必须包括进一步消毒或其他高级处理过程。废水排放合规性监测还必须确定分离微生物的抗生素敏感性/耐药性模式，而不是传统的效率措施。应在该地区开展进一步研究，以确定废水系统中的抗生素耐药决定因素，如抗生素残留和耐药基因。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

AT参与提出初始想法、方案制定、样品收集、实验室样品处理、数据分析和解释以及撰写手稿。YA、TA、BS和DM参与审查方案、对方法设计进行评论，并审查分析草案。所有作者并批准了最后的手稿。

致谢

作者要感谢环境健康科学系、健康科学学院和Haramaya大学提供的后勤和物质支持。作者还要感谢实验室协调员Wegene Deriba先生在空间和仪器许可方面的宝贵合作。资金来源这项研究由Haramaya大学负责，授予ID为HURG-02-01。

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