表型和分子的描述Extended-Spectrum Beta-Lactamase生产大肠杆菌从动物粪便样本获得Ado Ekiti,尼日利亚

文摘

生产extended-spectrumβ-lactamases (ESBLs)生产大肠杆菌在Ado Ekiti动物和不同的识别方法,Ekiti状态,尼日利亚,进行调查。收集的三百五十份粪便样本,从看似健康的牛和猪,是培养和鉴定标准程序。ESBL表型检测进行了使用组合盘测试,双盘合作测试和ESBL华晨琼脂筛选。分子检测TEM、SHV CTX-M基因进行了分子方法使用标准。一百一十四年大肠杆菌隔离从350个样本回收处理,其中72(63.2%)隔离ESBLs阳性与多个抵抗抗生素使用。ESBL阳性八十一(71%)隔离盘组合测试中,90(78.9%)呈阳性双盘合作测试,和93年(81.6%)ESBL阳性华晨琼脂。TEM和CTX-M基因被发现在48(42.1%)和51例(44.7%)分离,分别。SHV基因中没有检测到任何隔离而TEM和CTX-M 33(28.9%)被发现在隔离。这项研究显示,高阻的大肠杆菌抗生素,尤其是第三代头孢菌素。定期监测和监管在牲畜应该鼓励使用抗生素。

1。介绍

生产extended-spectrumβ-lactamases (ESBLs)是最常见的抵抗机制在肠杆菌科包括第三代头孢菌素肺炎克雷伯菌和大肠杆菌(1,2]。ESBL决定因素已发现不仅在临床分离株,而且在人类和动物共生的细菌和隔离从食物链的产品和污水,揭示水库分布和显示环境的存在对这些阻力因素(3,4]。

antimicrobial-resistant动物源细菌的增加过程类似于人类的大约20年前(5]。自1990年代末以来,extended-spectrumβ内酰胺酶(ESBL)生产肠杆菌科,特别是大肠杆菌,全球出现了。最初,产ESBL菌只观察到在人类医学实践(6,7),但最近的观察这些细菌,先是在同伴动物,越来越多的牲畜,发起了监测研究主要集中在牲畜(8]。ESBL生产大肠杆菌隔离现在被发现在越来越多的产肉动物导致假设动物甚至可能成为感染源或水库(自然持久的感染源)导致这些细菌的传播(9]。

目前,还缺乏ESBL生产信息E。杆菌从动物和耐这些物种的可能贡献日益增长抗菌素耐药性中观察到人类。本研究的广泛目标是确定产ESBL的发生大肠杆菌在Ado Ekiti牛和猪,西方尼日利亚南部。

2。材料和方法

2.1。样品收集

三百五十年从牛收集粪便样本()和猪()。收集样本看似健康的牛从结肠后立即在屠宰场屠宰动物无菌。新鲜粪便通过看似健康的猪被收集到无菌封顶通用瓶无菌抹刀和立即被运到实验室。

2.2。分离和鉴定

分离培养后从样品恢复亚硒酸改性F和孵化18 - 24小时37°C。隔夜孵化选择性媒体接种在液体山梨糖醇Macconkey琼脂,伊红美蓝琼脂,Macconkey琼脂和孵化18 - 24小时37°C。假定的特点大肠杆菌隔离被确定和证实使用数组的生化测试和API 20 E multitest系统(bioMerieux、法国)。这项研究是在医学实验室的部门进行科学、ABUAD, Ado Ekiti,和医学微生物学和寄生虫学LAUTECH Osogbo之间,2014年2月和11月。

2.3。敏试验

氨苄青霉素抗菌药物敏感性的纯殖民地(10μg),阿莫西林(25μ(30克)、安灭菌(8月)μ(30克)、头孢噻肟(CTX)μ(30克)、头孢他啶(CAZ)μ头孢呋辛(CXM) (30 g)μ(10 g)、环丙沙星(CPX)μ头孢克肟g), (CXM) (5μ(10 g), Cefpodoxime (CP)μg)、氧氟沙星(5μImipenem (10 g)μ四环素(30克)μ(10)、庆大霉素(创)μ(10 g)、链霉素(STR)μ(10 g)、红霉素(非常)μ背影)(g)、氯霉素(25μ邻氯青霉素g) (5μg)、呋喃妥英(NIT)和复方磺胺甲恶唑(STX) (25μg)由阀瓣扩散法确定和解释后,指导临床实验室标准协会(10]。

2.4。检测Extended-Spectrumβ内酰胺酶(ESBL)

2.4.1。Cefpodoxime和Cefpodoxime-Clavulanate(组合阀瓣筛选)

Cefpodoxime和Cefpodoxime-clavulanate(英国贝辛斯托克Oxoid)光盘应用于刚做好的穆勒辛顿琼脂和盘子孵化耗氧在37°C。最后测量区域的抑制是隔夜孵化之后作出的。ESBL生产商被定义为拥有一个微分区直径≥+ 5毫米(Cefpodoxime-clavulanate区−Cefpodoxime区)。

2.5。双阀瓣扩散试验

头孢他啶30μ30 g盘和头孢噻肟μg盘与阿莫西林/克拉维酸20/10μg(英国Oxoid)被放置在中心间距20毫米和孵化37°C(18 - 20小时11]。ESBL生产时推断头孢他啶和头孢噻肟光盘周围的抑制区扩展的存在clavulanate≥5毫米。

2.6。ESBL华晨琼脂

Oxoid ESBL华晨琼脂是接种根据制造商的指示。板注射1μ0.5 L(标准铂环量)的麦克法兰标准暂停E。杆菌。随后他们在35到37°C孵化耗氧18到24小时在倒置的位置和假定的ESBLE。杆菌确定了基于颜色生产。大肠杆菌生产蓝色/粉色颜色后24 - 48小时的潜伏期。参考E。杆菌应变ATCC25922抑制,用作负控制。

2.7。聚合酶链反应检测bla基因

ESBL证实分离株的DNA提取单独使用DNA提取工具包(Biospin质粒提取,Bioflux,日本)。根据先前发表的工作,PCR用于检测,,使用特定基因引物(12]。常规使用PCR反应进行主混合包含3μL deoxynucleoside三磷酸(核苷酸),4μL×10三羟甲基氨基甲烷EDTA缓冲液,0.2μl水生栖热菌(聚合)聚合酶,0.5μL MgCl₂,5μL DNA溶解产物,15.3μL (PCR水,1μ在30 L(正向和反向引物μL最后反应体积。用1%的琼脂糖电泳完成。

2.8。统计分析

确定测试的敏感性和特异性。测试的敏感性和特异性的差异进行了分析和卡方检验和对数线性分析软件使用社会科学统计软件包(SPSS版本21)。

3所示。结果

表1显示的患病率最高克雷伯氏菌种虫害在牛和猪显示125年和70年,分别,而至少细菌隔离普罗透斯21种虫害的患病率和10牛和猪,分别大肠杆菌和假单胞菌种虫害是114年和129年,分别。

表2显示了粪便样本的分布和来源;女牛调查是在73年,当牛男127年10大猪是最不收集。

3.1。抗生素敏感性的模式大肠杆菌隔离

表3显示所有114的结果大肠杆菌隔离,受到抗菌测试和解释为耐药,中间,和敏感的指导方针后临床实验室标准协会(10]。对抗生素的整体电阻隔离表明耐青霉素(笔)(96%)、氨苄青霉素(AMC)(89%),阿莫西林(AMX)(88%)、安灭菌(8月)(96%)、头孢噻肟(CTX)(92%)、头孢呋辛(CPX)(83%)、邻氯青霉素(科学家)(84%)、复方磺胺甲恶唑(STX)(90%)高而耐环丙沙星和氧氟沙星低5%对这些抗生素产生抗药性。隔离也显示相当大的抗氨苄青霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑、头孢菌素,如表所示3。

隔离的数量显示同时十二(12)不同抗生素的耐药性是其中最高42(37.8%)和隔离了多个抗生素耐药性而只有6例(5.6%)显示隔离电阻同时十五20抗生素的检测。所有的114大肠杆菌隔离了至少九抗生素的耐药性。所有隔离对超过两个类被确定为耐多药耐药(MDR)分离和选择可能的ESBL生产筛选(表4)。

3.2。表型测试

图1显示了表型测试使用的结果。八十一人(71%)隔离的114隔离盘组合测试是积极的(Cefpodoxime /克拉维酸)如图。有一个重要的协会()之间Cefpodoxime /克拉维酸和ESBL基因的检测(CTX、SHV和TEM)。测试的灵敏度计算使用分子检测作为黄金标准是89%,特异性是82%。假阳性预测率(1−特异性)为0.18 (18%)。双盘合作测试使用头孢噻肟头孢他啶/ clavulanate衬底是积极的(78.9%)90年分离的114隔离。之间有一个联系这个CTX-M基因的表型测试和检测()和TEM基因()(表5)。测试的敏感性是80%,特异性是70%。假阳性预测率(1−特异性)为30%。ESBL华晨琼脂是积极的在93年(81.57%)隔离。有一个重要的协会()获得的结果Cefpodoxime /克拉维酸和ESBL华晨琼脂。测试的敏感性是79%,特异性是67%,而假阳性预测率为33%。

3.3。检测ESBL基因

耐药基因的分子特征大肠杆菌隔离使用PCR分析。SHV显示没有特定的放大,因此没有检测到任何的样品。共51例(44.7%)隔离显示检测CTX-M基因而TEM基因出现在48例(42%)大肠杆菌隔离。

4所示。讨论和结论

抗生素耐药性继续构成严重的问题不仅在人类医学还在畜牧业,畜牧业管理、和兽医13,14]。

在这项研究中,几种方法检测了如前所报道ESBLs检测的方法。本研究的主要发现是多重耐药共生体的存在大肠杆菌在动物中常用的抗生素如青霉素(96%)、安灭菌(96%)、头孢噻肟(92%)、头孢他啶(58%)、头孢呋辛(83%)、复方磺胺甲恶唑(STX) (90%)。这个观察重申这一发现在其他研究中抗生素耐药性细菌特别是报道大肠杆菌与牛和其他动物以惊人的速度增加15- - - - - -18]。在这项研究中,所有隔离的易感性显示多个电阻最小的九个抗生素是3 (2.6%)。12(10.5%)隔离到十抗生素产生抗药性,6(5.6%)隔离对13个不同的抗生素,和42(36.8%)隔离到12抗生素产生抗药性,而9(7.9%)隔离到十五抗生素产生抗药性。这一发现与类似的结果与其他研究报道一些水平的多种抗生素耐药性大肠杆菌从牛、肉类产品,和其他动物19,20.]。Ajayi et al。17)确定抗生素敏感性的共生的模式大肠杆菌在Ado Ekiti看似健康的牲畜的粪便,尼日利亚,从准备宰杀的牛。他们的结果显示大肠杆菌显示隔离电阻测试至少3的八个抗生素(17]。所有的隔离显示多个抗菌素耐药性在这项研究中筛选可能的ESBL生产。Extended-spectrum内酰胺酶的确是麻烦医生的超级细菌和微生物学家,创造环境压力制药管道发展的新的抗生素。

英国健康保护署的建议测试Cefpodoxime或者头孢噻肟和头孢他啶作为第一筛选试验(21]。本研究显示两者的结合后药物分离在20毫米距离达到80%敏感性充分检测ESBL生产,这意味着只有20%的隔离需要进一步测试。这符合一些其他的研究。Garrec et al。22)报道,使用同样的方法灵敏度为77%。一般来说,双阀瓣扩散试验显示敏感性的评价方法的范围从79%到97%,特异性(从94%到100%不等23,24]。本研究Cefpodoxime的敏感性是89%,特异性是82%。假阳性预测率(1−特异性)为0.18 (18%)。Cefpodoxime被发现有最高的灵敏度在这项研究中,因此同意一项研究Jain和Mondal [25]他们总结报告使用标准纸片扩散的筛检试验识别ESBL生产商Cefpodoxime被发现最有效的抗微生物剂的敏感性为93%,特异性85.7%,筛选分离作为潜在ESBL生产商紧随其后的是头孢他啶敏感性为89.6%,特异性为80.9%,头孢噻肟(敏感性81.6%,特异性85.7%25]。然而,据报道,充分使用头孢噻肟,一贯容易CTX-M,头孢他啶,这是一个持续良好的基质对TEM和SHV变异但如果只使用一种药物,然后最好的指示器ESBL生产商已经发现Cefpodoxime [11,26]。

使用Oxoid ESBL华晨琼脂,敏感性为79%,特异性为67%,假阳性预测率(1−特异性)为33%。这是与黄的一项研究表明,et al。27),报告敏感性为94.9%,特异性为95.7%。数据显示在文件Oxoid (http://www.oxoid.com/),该产品的性能被评为敏感性95%,特异性94%。在这项研究中观察到的差异可能是由于使用的特征已经(已知)ESBL生产隔离在评价任何结果发布的这个方法是假定的,应该得到其他方法确认。

以下的筛查大肠杆菌隔离ESBL基因用聚合酶链反应(PCR),中检测出48(42.1%)和中检测出51(44.7%)和没有检测到任何隔离。这些发现表明,更普遍的ESBL基因在这些隔离,符合其他研究[11,28]。在这项研究中,产ESBL的发生大肠杆菌高达63.2%,ESBL基因检测在72年从114年分离筛选。这是惊人的和令人担忧的,高于报告临床分离株在尼日利亚,A和D ESBLs p-AmpC被发现在医院,和患病率从27.5%至10.3不等(6,29日- - - - - -32]。

尽管这些研究大多是使用E。杆菌从人类分离,ESBLs已报告质粒编码的暗示这些阻力因素被发现在我们的环境中,可以从一个组织转移到另一个。这些ESBL生产商的高患病率在动物粪便样本进一步支持假设动物甚至可能成为感染源或水库(自然持久的感染源)导致这些细菌的传播(9]。这些耐药特征要求总监控社区设置因为ESBLs基因是一个世界上不断增长的可用抗生素治疗但仍低估了其流行病学效果和评价较低的意识。

总之,我们所知这是第一个表型和分子的调查报告bla基因(CTX、SHV和TEM)从动物粪便样本和流行病学关联不同的表型和分子的方法。多重耐药ESBL生产大肠杆菌存在于粪便样本的Ado Ekiti牛和猪。检测ESBL阳性分离株中观察到的差异由三种不同的方法可能是合理的低灵敏度的表型方法和环境因素的影响发病率的阻力。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者真诚地感谢所有的医学实验室科学家LAUTECH教学医院和医学实验室复杂的健康科学学院,Isale Osun, Osogbo,对于他们的帮助,支持和贡献这个项目的成功。他们感谢Adefioye年代和夫人Olowe RA的阅读。

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