相对比肠球菌使用浒座和EPA方法的海水和废水中的物种多样性1600

摘要

EPA Method 1600和Enterolert可以互换使用肠球菌用于公共海滩的粪便污染，但不同的方法偶尔会产生不同的结果。在这里，我们评估这些差异是否归因于某些物种的选择性肠球菌团体。两种方法用于获得来自17个环境样品的1279个分离物，包括四种废水处理厂的流水和流出物，来自七个不同海滩的环境海水，以及来自两条流系统的淡水城市径流。分离物被鉴定为物种水平。检测非肠球菌Enterolert法(8.4%)略高于EPA Method 1600法(5.1%)。粪大肠和大肠都有效，通常与人类粪便有关，主要存在于废水中;然而Enterolert对粪大肠使用实验室创建的样本也显示了这一点。在大多数海滩水和城市径流样本中没有观察到相同的物种选择性。这些样本中植物伴生物种的比例相对较高，大肠casseliflavus(18.5%)和大肠mundtii（5.7％）与废水相比，建议对海滩和径流的环境投入。在评估海滩的卫生质量时，应考虑水检测方法之间的物种选择性的潜力，以便公共卫生警告基于代表粪便来源的指标。

1.介绍

EPA方法1600和EnteroLert（Idexx，Westbrook，Me，USA）是两种常用于衡量的EPA批准的方法肠球菌作康乐洗浴水质评估[1］．这些方法可以互换用于(1)监管监测，以检测可能的粪便污染的水;(2)将游泳者的发病率与水中肠球菌密度相关联的流行病学研究;(3)微生物源追踪研究，以减少粪便输入以保护公众健康。许多研究发现，这两种方法通常产生可比较的结果[2-5.］．然而，一些作者发现结果可能明显不同[6.-9.］．

除了样本的可变性外，有几个原因可以解释方法之间的不一致。EPA Method 1600是一种膜过滤方法，水通过一层膜，然后被放置在上面肠球菌吲哚yl-β- d -葡萄糖苷(mEI)琼脂，孵育后，检查有蓝色晕的菌落。Enterolert是一种确定的底物方法，基于肠球菌代谢4-甲基伞形酮-来测量荧光端点β- d -葡萄糖苷。

这些培养基中生长控制底物组合的差异可能导致肠球菌种类的选择性和非肠球菌的检测，包括链球菌SPP。，气球菌属spp。,乳球菌spp。10］．Enterolert的假阳性率在4%到26%之间[11梅琼脂的11％至26％之间[10］．

偶尔方法之间的另一种可能的原因将是物种中的差异选择性肠球菌特别是Enterolert使用的是液体肉汤培养基，而EPA Method 1600使用的是固体琼脂，这会影响细胞的生长动力学。在液体介质中，生长速度快的细菌比生长速度慢的细菌长得快，即使是在稀释的样品中[12］．相比之下，在琼脂培养基上的膜上生长的细菌细胞在空间上是分开的，提供了更少的竞争机会。

的知识Entercoccus.城市径流和废水中的物种分布可能有助于评估基于肠球菌水质标准认为不安全的游憩水域。粪大肠和大肠都有效是人类粪便中最常见的两种物种[12];大肠casseliflavus和大肠mundtii与植物和土壤有关[13];这些物种并不被认为是人类肠道菌群的典型成员[14］．因此，应该使用不受物种选择性影响的方法来描述粪便污染代表的肠球菌种类的分布。

在这里，我们测试了EPA Method 1600和Enterolert方法在物种选择性上的不同假设，当这两种方法被用于处理一组共同的样本时，我们通过检查它们分离的物种组成来检验它们的物种选择性。

2.方法

利用18个环境样品和一个已知物种组成的实验室创建的样品，测定了物种选择性的差异。环境样本收集于七个海岸泳滩地点、两个淡水城市径流地点、四个污水处理厂(污水处理厂)的进水及四个污水处理厂(污水处理厂)的二级出水(见表)1)．海滩上的水是用100毫升的塑料瓶在到达脚踝的深度时收集的。城市径流以水面以下1l的样本采集。从进水或出水管道中收集1l的废水样品。

实验室创造的样品由干净的海水组成，每100毫升接种约1,000个菌落形成单位大肠都有效和粪大肠．海水在海上收集18公里，10米深度深度，没有可衡量的肠球菌。使用来自使用EPA方法1600的环境样品的菌株制备肠球菌培养物，并使用Vitek微生物识别系统（Biomérieux，莫，Mo，USA）鉴定到物种。

所有样本均在收集后六小时内按环保署标准进行分析[15和Enterolert制造商说明。EPA方法1600年10 - 50毫升容量的样本被过滤到美,并假定enterococci隔离是通过选择获得五个殖民地(样品)和蓝色光环从梅琼脂(美国东北部实验室,沃特维尔,我)和接种到胰蛋白酶的大豆琼脂(TSA) 5%的羊血(东北实验室,沃特维尔,我,美国)。35℃孵育24 h后，检测血琼脂平板(BAPs)，确保其为纯培养物。从BAPs分离的菌株传代到TSA斜体上(Northeast Laboratory, Waterville, ME, USA)，并与之前一样孵育。TSA斜面保存在4°C，直到进行物种形成。

在Kinzelman等人的方法之后，将10ml样品用于肠溶料Quanti-Tray方法和肠球菌分离物。[6.］．Quanti-Tray的背面用70%的酒精消毒，使用无菌注射器从多达5个荧光(阳性)孔中取出培养基。然后将培养基接种到含6.5% NaCl的脑心灌注(BHI)肉汤(BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)中，稀释倍数为1:20。然后接种的肉汤在41°C孵育48 h。将有生长的培养物传代到bap上，然后将bap上的菌落传代到TSA斜体上，培养，4°C保存。

2.1。孤立鉴定

使用Vitek微生物鉴定系统(bioMérieux, St. Louis, MO, USA)从EPA Method 1600和Enterolert获得的17个环境样本中，分别鉴定了大约80个菌株(表)2)．隔离标识为肠球菌区分度小于80%的物种被归类为“不确定”。被鉴定为非肠球菌被分类为“非肠球菌“。大肠casseliflavus/大肠gallinarumFerguson等人对Vitek无法识别的分离株进行了运动性和色素生成测试[10来区分这些物种。自从大肠mundtii没有通过Vitek识别[16]，我们利用已公布的生化测试(包括活动性测试)，从泳滩水、废水及淡水中筛选了107株该物种的分离株;颜料生产;阿拉伯糖、蔗糖和甘露醇的发酵[17］．

3.结果与讨论

3．1．肠球菌物种组合

1279强推测肠球菌与环境样品（海滩水，城市径流和废水处理厂流入和流出物）的分离物（表2）使用EPA方法1600和肠道进行检查，并发现包含九种物种肠球菌．大肠都有效和粪大肠是使用Enterolert获得的分离株中识别频率最高的物种，每个物种约占所有样本分离株的三分之一(图1)．这些也是使用EPA Method 1600获得最多的物种大肠都有效更常见（44％）比粪大肠（13％）。大肠gallinarum和大肠casseliflavus是第二种最常见的被两种方法鉴定的物种。非肠球菌菌株中8%来自Enterolert, 5%来自EPA Method 1600。最常见的非肠球菌是变形杆菌来自Enterolert的水井草绿色气球菌属来自EPA Method 1600。这两种方法鉴定的其他物种包括链球菌宝那美国uberis那变异链球菌,美国肺炎．5%的分离菌株被确定为低确定性，并被归类为“不确定性”。

所有环境样本的物种总体相对丰度在不同方法之间没有显著差异(（1，）= 47.4，)．但是，相对比例大肠都有效和粪大肠废水样品的测定方法有显著差异粪大肠最常见的enterlert的物种和大肠都有效占主导地位的EPA方法1600(图2)．的比例粪大肠和大肠都有效在两个城市径流样本和8个海滩水样本中大致相似(Fisher的精确测试，)．

在具有类似浓度的实验室样本中，还观察到使用肠道的废水样品中观察到的相同选择性。粪大肠和大肠都有效（数字3.)．EPA Method 1600鉴定出65%的菌株为粪大肠, 30%的大肠都有效， 5%为“不确定”。相比之下，98%的Enterolert菌株被鉴定为粪大肠．

利用Vitek进行肠球菌种类鉴定，并辅以色素生产和运动试验进行鉴定大肠mundtii和大肠casseliflavus这可能会被误解为大肠gallinarum由Vitek单独[16］．在筛查的107株菌株中大肠mundtii， 12个菌株被误鉴定为大肠gallinarum由Vitek;其中六个被证实为大肠mundtii,四个非肠球卡物种，两种作为大肠casseliflavus根据额外的生化测试色素沉着和运动能力Vitek识别的粪大肠和大肠都有效更为准确;除了一个，所有的都是孤立的粪大肠和大肠都有效通过Vitek和常规生化测试也能得到相似的鉴定

３．２．肠球菌物种选择性

虽然这两种方法通常得到相同的物种组合，但Enterolert鉴定的比例较高粪大肠比EPA方法1600在所有样本类型上都有。有许多原因可能发生这种原因，其中一个是液体和稳定增长媒体之间的差异。另一个差异是媒体制剂。EPA方法1600中使用的MEI媒体含有添加剂，例如三苯基四唑氯化物来区分肠球菌从其他革兰氏阳性球菌，叠氮钠和萘啶酸抑制革兰氏阴性菌的生长，环己亚胺抑制真菌的生长;Enterolert培养基是专有的，目前尚不清楚是否存在类似的添加剂来增加特异性。各媒体检测肠球菌所用的报告分子也有所不同。而mEI传媒依靠的能力肠球菌代谢吲哚酚-β- d -葡萄糖苷产生蓝色化合物，Enterolert培养基依赖于4-甲基伞形素β- d -葡萄糖苷产生荧光代谢物。

观察到的差异的另一个潜在机制是氧可用性。探针介质在料盘中热密封，与培养皿中的Mei琼脂相比，产生更多的厌氧潜伏条件。Enterococci是兼职Anaerobes [17，但尚不清楚在不同的氧气水平下，不同物种和菌株的生长速度是否不同。在增长率上的差异肠球菌物种也可以解释不同方法的不同结果。Quanti-Trays中某些肠球菌菌株的延迟生长速率和阳性荧光反应(24小时后)引起了人们对Enterolert可能低估肠球菌密度的担忧[9.那18］．可以在BHI肉汤（具有6.5％NaCl）中可以引入物种选择偏差，以便促进从eNTEROLERT分离肠球菌的步骤。这种富集步骤用于减少非肠球菌也因为以前尝试直接从Enterolert传代到非选择性培养基，导致未检测到肠球菌。为了评估潜在的选择偏差，我们比较了粪大肠(写明ATCC 29212),大肠都有效(写明ATCC 35667)大肠casseliflavus(ATCC 700527)在6.5% NaCl的BHI肉汤与Enterolert培养基中，使用光密度(600纳米;UV160U分光光度计，岛津科学仪器，哥伦比亚，MD，美国)和板计数的mEI。大肠都有效增长速度超过粪大肠在肠道中，并含有6.5％NaCl的Bhi Brooth。但是，enteroLert没有选择大肠都有效,大肠都有效在实际的样本中并没有占主导地位，这表明其他因素可能解释肠特勒特选择性粪大肠在废水样品中观察到。Enterolert也显示了同样的选择性粪大肠在不使用BHI步骤直接从实验室创建的样品继代培养的分离株中。

3．3．物种形成方法的局限性

我们使用了Vitek系统，这是环境实验室经常使用的系统，用于验证mEI上的推定肠球菌，用于大多数物种鉴定(APHA 2000)。Vitek的一个限制是数据库不包括大肠mundtii，这是环境水域中存在的物种[10］．在先前的研究中，Moore等人。[16发现，没有补充测试的Vitek所指定的14％的分离物被误识别。在我们的研究中，与传统的生化测试相比，由Vitek鉴定的17％的分离物具有差异的鉴定。其中大多数是vitek被错误识别的孤立大肠gallinarum后来被确认为大肠mundtii那大肠casseliflavus或非肠球菌根据补充测试，包括色素，运动性和额外的生化测试。因此，总的百分比大肠gallinarum在本研究中单独使用Vitek可能有些夸大。

分子方法可以用来识别肠球菌分离物包括16S rRNA基因测序[18]和属和物种特异性多重 - PCR [19］．这些方法快速、经济、允许高通量。在某些情况下，传统的生化检测与分子方法(如16S rRNA测序)结合使用可能是有用的[20.那21］．例如，颜料生产和运动可用于区分大肠casseliflavus和大肠gallinarum具有相同16S rRNA基因序列的[16］．自从大肠casseliflavus与植物有关，区分这两个物种对评估自然资源是很重要的。多重pcr是另一种基于分子的物种形成方法，在从环境和粪便分离菌中鉴定肠球菌物种时，与Vitek和传统生化方法的一致性为90% [19］．然而，多重PCR的敏感性可能是一个问题;Layton等。[22]，采用改良的Jackson多重PCR方法鉴定了8种肠球菌在动物粪便样本分离株中，发现小于30菌落形成单位(CFU)的样本需要培养富集步骤;富集后，使用多重PCR检测到70%的潜在肠球菌。

3．4.肠球菌废水，海滩水和城市径流的物种分布

虽然EnteroLert和EPA方法1600之间的物种选择性存在一些差异，但这些差异远小于不同样品类型中的两种方法的物种组成差异。例如，两种方法都发现了更高的百分比大肠casseliflavus在海滩样品中(~20%)比在废水样品中(<4%)多。两种方法还发现，尽管在大小、处理过程和服务区域的性质上存在差异，但四个污水处理厂的污水中有相似的肠球菌种类分布。的统治地位大肠都有效和粪大肠在废水系统中与以前的研究一致，这些研究检查了物种分布肠球菌在废水中[23-25］．更高比例的粪大肠和大肠都有效在废水流中，还与已经确定这两个物种的临床研究一致，即这两个物种包含人类和动物粪便中发现的肠球菌的大部分[14那22那26］．同样，流行大肠casseliflavus在具有最小人类粪便源的海滩和径流样本中，其在废水样品中的下降率也与临床人类粪便样本相一致[27那28]其与天然来源的已知关联，例如植物[29那30.］．

4.结论

EPA Method 1600和Enterolert检测到相似比例的肠球菌海洋和尖刺样品中的物种;但是，enteroLert更有选择性粪大肠在废水样品。另外，Enterolert产生了更高比例的非肠球菌海滩水和径流样本中的生物，这可以解释使用这两种方法的水质评估偶尔的差异。进一步洞察的多样性肠球菌环境水域中的物种可能有助于改进健康风险评估的研究。进行物种鉴定肠球菌使用培养方法，建议EPA方法1600获得更准确的表征。

利益冲突

作者希望确认与可能影响研究调查结果的工作没有已知的利益冲突或财务支持。

致谢

作者感谢Matthew Hamilton, Melissa Madison, Linda Tran, Andriana Gallegos-Amparo，以及洛杉矶县卫生区，奥兰治县卫生区，南奥兰治县废水管理局，Encina废水管理局和奥兰治县公共卫生实验室，感谢他们在收集和处理样品方面的帮助。

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