伊朗中部高原某水处理厂五种抗生素的定性调查

抽象的

介绍．本研究旨在基于SPE-LC-MS-MS技术在伊朗中部高原的一个水处理厂调查总共五种常见的人和兽药抗生素。并比较了被动取样和抓取取样两种取样技术对所选抗生素的检测效果。材料和方法．1月至2012年3月，从水处理厂的流水和流出物中取出抢购和被动样品。使用固相萃取（SPE）制备样品，通过液相色谱串联质谱（LC-MS-MS）分析提取物。结果．结果表明，恩诺沙星，土霉素，并在没有样品均未检出泰乐菌素。然而，植物从流入（源水）被抓握和被动样品中检测到氨苄青霉素，并从植物的进水和出水（成品水）采取被动样品中检测到环丙沙星。结论. 结果表明，被动采样比抓取采样更适合于水生环境中抗生素的调查。水处理厂源水和成品水中氨苄西林和环丙沙星的存在可能导致潜在的耐药细菌出现，应在未来的研究中予以考虑。

1.介绍

药品在人类和兽医中广泛使用[1］.3000多种不同的化学物质用作人类药物和农业和水产养殖应用，其中抗生素是我们日常生活中最重要的常见药物之一[2］.除了抗生素在人类健康中的关键作用外，它们也是潜在的环境污染物，因此自20世纪90年代后半期以来，科学界对环境中存在的不同类型的药物越来越关注[3.］.

有不同的途径可以将抗生素释放到水生环境中。给予人类后，它们的代谢物以及非亚胺母体化合物排出到污水中[4］.污水处理厂(WWTPs)的设计初衷并不是完全去除抗生素，因此它们被释放到自然水域中。此外，抗生素可通过所有的天然过滤，并最终到达饮用水，因为其高水溶性和往往较差的降解性[5]. 此外，抗生素广泛应用于养鱼场，在养鱼场中，抗生素被用作饲料添加剂或直接应用于水中。向养鱼场过度投喂这些化合物的结果是，许多化合物最终进入沉积物中，在那里它们被缓慢降解或缓慢滤出回到周围水域[4］.对动物的细菌感染以及预防药物治疗兽用抗生素的使用是污染的另一个来源。动物排泄物污染是的主要途径，作为最这些物质在粪便中结束。母体化合物或它们的生物活性代谢物通过的降雨事件[存在于粪便可以从场到地下水移动，并最终进入地表水3.，4］.

鲜为人知的是，可能是人类和水生环境的抗生素生态的不利影响。虽然这些化合物的浓度水平似乎并不可能对人类健康和水生环境毒性作用，对长期和水生生物的连续暴露给他们[一个大问题1，6］.抗生素水平低与日益出现的有可能影响人类健康的耐药致病菌菌株有关。此外，兽药中使用的抗生素与专门用于人类药物的类似结构的抗生素之间可能会产生交叉耐药性[7，8］.因此，抗生素在环境中的发生受到了相当大的关注。

由于所分析基质的高度复杂性以及水生环境中目标化合物的浓度通常较低，环境中抗生素的分析是一项困难的任务。这种情况导致了非常灵敏的分析方法的发展，适用于监测这些低浓度水平的分析物[4］.然而，环境中抗生素分析最常用的方法包括固相萃取(SPE)预富集步骤和液相色谱分离-质谱联用(LC-MS)或串联质谱联用(LC-MS- ms)。因此，SPE-LC-MS (MS)方法能够对抗生素进行分离和定性定量检测，检出限低[1，12］.

对于水生环境中抗生素的调查，通常采用传统的水柱取样(包括抓取取样和复合取样)。但该方法存在许多不足，包括取样水量不足，无法满足分析方法的检出限要求，缺乏水生介质污染物水平的时间加权平均(TWA)，重复取样在物理和经济上存在困难。与抓取或复合采样相比，时间综合被动采样可以在较长的采样周期内估计TWA污染物浓度[13，14]. 这样，污染物的预浓缩可提高检测痕量浓度的能力。可使用极性有机化学综合取样器（POCIS）从水中采集与其他药剂学和极性农药相似的抗生素样品[15］.POCIS中随后的实验室程序(即提取、识别和分析物的测定)与传统取样技术相同[16］.

截至目前，许多研究已经对水生环境的各个车厢，例如，城市污水，工业废水，医疗废水，地表水，地下水和饮用水，以及抗生素的发生做[17- - - - - -21.］.此外，近年来，通过被动采样，水生环境中的抗生素检测到SPE和LC-MS（MS）已得到相当大的关注[14，15］.本文从喹诺酮类(环丙沙星和恩诺沙星)、大环内酯类(泰洛辛)、β-基于SPE-LC-MS-MS技术的内酰胺（氨苄西林）和四环素（土霉素）在伊朗中部高原的一家水处理厂使用。在这项研究中，我们将极性有机化学综合取样器（POCIS）作为被动取样器与标准抓取取样技术进行比较，以检测选定的抗生素。

2.实验

2．1.化学品和材料

氨苄西林(分析标准品)、环丙沙星(纯度≥98%)、恩诺沙星(纯度≥98%)、土霉素(纯度≥95%)、泰乐新(分析标准品)5种抗生素标准品均购自德国Sigma-Aldrich公司。化合物结构如图所示1．表中还描述了所研究的抗生素化合物的一些理化性质1. HPLC级甲醇和超纯水购自默克公司（德国达姆施塔特）。绿洲亲水亲油平衡（HLB）墨盒（200 mg/6 mL）从Waters（美国马萨诸塞州米尔福德）购买。0.45 μ.M醋酸纤维素过滤器和0.2μ.m醋酸纤维素注射器过滤器是密理博（美国）和惠特曼（德国迪塞尔）的产品。以下化学品均为分析级：来自Fluka的硫酸（纯度99%）和乙二胺四乙酸二钠（Na₂(EDTA)和硫代硫酸钠(Na₂年代₂O_3.从Sigma-Aldrich)。

每种抗生素的单独原液在浓度为0.05 - 0.5 mg/mL的甲醇和高纯水的混合物中(体积:体积:1)配制，并保存在冰箱(−10°C)中。工作标准混合溶液(0.02至5μ.g/mL)，每次使用前用甲醇与高纯水(3:1,v: v)的混合物稀释备用溶液，4℃保存。所有标准溶液(包括库存和工作溶液)均储存在用铝箔覆盖的玻璃瓶中，置于−10°C的冰箱中。所有玻璃器皿用洗涤剂和热水清洗，用蒸馏水和丙酮漂洗，在220°C的烤箱中烘干过夜。

２.２.抓取采样

2.2.1。样品采集与制备

从2012年1月至2月，在一个水处理厂的两个地点采集了水样(在POCISs暴露期的第一天和最后一天从每个地点采集)。水源水样在任何水处理过程之前在工厂入口采集，完成水样在处理水的水库采集。WTP和采样点的方案设计如图所示2．该植物有12.5米^3.年代⁻¹容量并由伊朗中部高原的一间多年生河流喂养。河流流经中等人口密度和高农业和水产养殖活动的地区。

在2.5个月内采集水样 l带螺旋盖的琥珀色玻璃瓶。取样前，按照上述程序清洁瓶子。对于成品水样，添加过量的淬火剂（硫代硫酸钠）以对样品进行脱氯。在进一步处理和分析之前，将装有样品的玻璃瓶在冷却条件下运至实验室。在实验室中，水样通过0.45的过滤器过滤 μ.m醋酸盐纤维素过滤器，并通过添加3.0进行酸化 M H₂所以₄，然后加入0.2g乙二胺四乙酸钠（Na）₂EDTA）。在这种条件下，样品中的任何抗生素活性保持最小，并且它们倾向于二价离子的趋势可能会降低。将样品在4℃下在黑暗中储存，直至在1周内提取它们。

2.2.2。固相提取

年代olid-phase extraction (SPE) experiments were conducted using 200 mg/6 mL Oasis HLB cartridges on an innovative setup (Figure3.）.用4 mL的甲醇和6 mL的去离子水对墨盒进行预处理。体积为1000 mL的水样，pH为2.8-3 (H₂所以₄)以5-8 mL min的流速通过墨盒⁻¹在7-9英寸处使用真空萃取歧管。Hg (Visiprepä， Supelco, Bellefonte, PA美国;1。Hg = 338.638 Pa). Afterwards the cartridges were rinsed with 10 mL of ultra-pure water and were air-dried for 5 min. The retained analytes were subsequently eluted with 10 mL of methanol into a glass test tube. The extract was concentrated to dryness under a stream of和重构以〜250 μ.L在超纯水/甲醇(9:1)溶剂混合物中。提取液经4 mm内径过滤。, 0.2μ.m孔径醋酸纤维素注射器过滤器，转移到琥珀瓶，在−15°C保存，直到LC-MS/MS分析。

2.3。被动抽样

2.3.1。POCISs表征

极性有机化学整合取样器（POCISS）由封存介质（例如HLB）组成，例如HLB，其封闭在两个亲水性微多孔聚醚砜膜中，用于极性有机化学品如抗生素的整合型取样。通过Alvarez等人描述了这种采样技术及其吸附剂材料的详细描述。[22.］.在本研究中，POCIS椎间盘的标准配置为180厘米²每克吸附剂的取样表面积[22.］.

2.3.2。POCISs的现场部署

所述POCISs样品放置在同一位置和时间作为收集抓取样品。At each site, a protective steel canister containing three POCISs, each with approximately 39.2 cm²有效采样面积，部署30天(2012年1月- 2月)。数字4显示了POCIS和部署钢罐。Before deployment, the sorbent, HLB, was preconditioned with 6 mL of MeOH followed by 10 mL of HPLC-grade water and left at room temperature until dry.

毒气罐处于垂直位置，深度为2 我在水柱里。在暴露期结束时，收集POCISs，用水冲洗，保存在容器中，并在冷却条件下运输至实验室。接收后，在提取前将POCISs冷冻保存。

2.3.3。POCIS中化学残留的回收

通过Bueno等人详细描述了从展开的Pociss中恢复螯合化学残留物的程序。[15］.简单地说，将POCISs分解，将HLB吸附剂转移到空的SPE墨盒(6cm)中^3.）并包装在两个聚乙烯玻璃料之间。The analytes from the sorbent were eluted with 15 mL of MeOH at 1 mL/min into a glass test tube. At the last step, the eluate was evaporated until almost dryness under a gentle stream of nitrogen at 35°C and reconstituted in 250 μ.L在超纯水/甲醇(9:1)溶剂混合物中。提取液用0.2μ.M醋酸纤维素注射器过滤器，AmpOulated，并在-15℃下储存直至LC-MS / MS分析。为了增加螯合残留物的总质量，每个Ampoulated样品是来自同一部署罐的三种单独的POCIS提取物的复合材料。

2.4。LC-MS-MS分析

The extracts were separated on the reverse phase Zorbax Eclipse XDB-C18 column, 4.6 mm × 50 mm ID and 1.8 μ.m粒径（安捷伦科技，加利福尼亚州，美国），使用LC系统，配备四元泵、真空脱气器和自动进样器。小份样品的进样量为5 μ.流速为0.5 mL/min的二元梯度。流动相A为0.1%甲酸水溶液(v/v)，流动相B为0.1%甲酸水溶液(v/v)，以甲醇为溶剂。B相为0%，流动时间为0.5 min，梯度从0.5 ~ 3 min增加到20%，从3.0 ~ 7.5 min增加到70%，从7.5 ~ 11 min增加到95%，从11 ~ 12 min降低到0%，保持在0%。所有目标化合物在15 min内从柱中洗脱，自动进样器在室温下操作。

LC柱的流动转移到配备ESI源的三重四极质谱仪。电喷雾电压为4 kV，毛细管温度为350℃，最大隔离时间为200 ms。采用氮气作为雾化和干燥气体，雾化压力为20 psi，干燥气体流量为13 L/min。

3.结果

本研究的结果包括分析抗生素的最佳仪器条件、分析物的代表性MS/MS谱图和水样中抗生素的出现情况。

优化后的LC-MS/MS参数及标定曲线信息如表所示2．因为所有的抗生素都属于第1和第2类EPA药物化合物[23.]，在ESI+中分离。

数字5显示了标准溶液中具有代表性的抗生素质谱图。这些数字代表产品用于分析物的数据。

在WTP的原料和处理水的分析样品中检测到5种抗生素中的两个（表3.）.用LC-MS / MS检测氨苄西林，用于在流动的采样部位抓取和被动样品;然而，仅针对被动样品检测到环丙沙星。任何采样程序都没有检测到eRC，OTC和Tyl的其他分析物。从所有来自流出物采样部位的样品，我们可以通过被动采样SPE-LC-MS / MS检测CIP。

4。讨论

在这项研究中，在伊朗中部高原的水处理厂进行了5种抗生素的出现。我们的主要目的是定量调查抗生素的发生。因此设定了每个分析物的校准曲线，它们的相关系数> 0.99（表2）.然而，由于一些限制，如缺乏有效的回收率和基质效应数据，以及经济和技术的限制，我们决定报告的结果作为目前/缺席。

在水环境中分析非常低的分析物，需要最佳采样，加工和分析条件[4]. 为了防止玻璃器皿污染，根据文献对其进行处理，即反复清洗、漂洗和烘烤[23.］.在抓取取样中，在成品水样中加入硫代硫酸钠，酸化所有的样品，并将它们保存在低温和黑暗的环境中，这些都是必要的，以避免分析物通过化学反应和微生物活动的分解[4]. 根据该领域的文献，一种螯合剂，即Na₂应用EDTA以降低抗生素与基质中的金属或多价阳离子结合的趋势，以改善峰形，并防止在抗生素提取过程中的干扰[4，24.］.

固相萃取(SPE)的安排几乎符合EPA Method 1694 [23.］.有一些合适的盒用于从含水基质中提取抗生素;然而，最常见的SPE盒是亲水性 - 亲脂性平衡（HLB）[25.］.年代o we use 200 mg/6 mL Oasis HLB cartridges in an innovative extraction setup (Figure3.). 样品pH和洗脱液被证明是使用SPE（14）进行抗生素预富集的关键参数。由于抗生素结构中存在酸性和碱性官能团，预计溶液pH值将显著影响抗生素的形态形成（图1）1). 它们的酸度常数（表1）1)表明这些抗生素在环境pH范围内容易发生质子化和去质子化[26.］.将样品酸化至pH为2.5-3，因为所选抗生素属于EPA制药化合物1和2组(具有酸性)，酸性条件使它们能更好地从水基质中回收[23.］.Tong等人。据报道，在pH 2.0，CQS和TCS的恢复分别超过70％和60％，而在中性条件下，TCS和FQS的率小于30％[27.］.Reverté等人。选定的pH 2.8用于从河水样本的TCS和QS的SPE之前进行样品调理[28.］.

根据EPA方法1694 [23.]，选择ESI(+)模式LC分离分析物。通过一系列的初步实验，利用甲醇、甲酸和水组成的不同流动相在不同馏分上对色谱分离进行了优化。选择甲醇作为LC-MS/MS体系中常用的有机流动相[29.，30.］.流动相中加入甲酸会影响色谱分离，改变流动相的pH值，影响电离效率[31.］.对不同浓度的甲酸在流动相A和B中的最佳色谱分离进行了评价，并在流动相A和B中加入0.1%的甲酸。柱温25 [32.]，30摄氏度[33.和室温[30.]被广泛应用于LC-MS/MS对所选抗生素的检测。在本研究中，柱在室温下操作。在相同的梯度条件下以不同的流速洗脱，最佳流速为0.5 mL min⁻¹．

被调查的抗生素属于氟喹诺酮类(CIP和ENR)、四环素类(OTC)、大环内酯类(TYL)和β-lactams (AMP)。根据表3.，所有五种抗生素中，有两种在输入水处理厂(AMO及CIP)的原水中检出。采用被动取样法在成品水中检测到CIP。该工厂的水由一条多年生河流提供，这条河流流经一个人口密度中等、水产养殖活动频繁的地区。河流流域受到几个点源和非点源的污染。在水源采样点上游，有一个2万多人口的城市和几个小城镇，一些家庭和企业非法排放污水到附近的干渠或河流中。还有一个重要的鱼类养殖区在上游，由河流的水供应。因此，AMP(兽医使用和人类使用)和CIP(人类使用)的发生可能是由于养殖场和居民区的非法排放，以及取样点上游(即水处理厂入口)河岸上的农田的径流。氨苄青霉素和其他ββ-内酰胺抗菌素，由于化学上不稳定的β-内酰胺环，易于水解[4］.因此，期望在成品水中未检测到氨苄青霉素。

抗生素在水环境中的存在是一个值得关注的问题，因为可能发展出耐药菌株的细菌。因此，有一些关于河水、水处理厂和饮用水中氨苄青霉素和环丙沙星耐药细菌流行的报道[34.- - - - - -36.］.因此，受污染的水处理厂的水源和成品水中存在一些抗生素是令人担忧的，特别是考虑到供应约400万人的饮用水中可能出现耐药菌株。这项调查强调了对水处理厂成品水和水源水中多重抗微生物细菌(至少对AMP和CIP)进行调查的必要性。

这项研究的另一个重要信息是，在监测水环境中的抗生素方面，被动采样(或POCIS)比抓取采样更有效，至少在定性上是这样。从表中可以看出3.，其中两个采样点和五个抗生素进行监测，我们可以在源水通过抓取采样检测只AMP。在另一方面，AMP和CIP在源水和CIP在成品水中通过SPE-LC-MS-MS通过被动采样技术来检测。这一发现是根据那些由Alvarez等发现。[22.在水环境中，被动取样比水柱取样更能检测出包括抗生素在内的更多有机污染物。这样做的原因是，POCIS监测微量污染物的时间延长了，例如，在我们的研究中，是30天。这一特性允许污染物的预浓缩和从通常不被抓取取样检测到的偶发事件的残留物的隔离。事实上，通过使用被动采样技术，定期监测抗生素可以跟踪水体的空间和时间趋势[15］.一般来说，与其他被动取样器类似，POCIS通常比由几升组成的水样更容易处理、保存和运输。因此，POCIS提高了方法的灵敏度和使用的简单性。

5.结论

采用SPE-LC-MS/MS单残留法对伊朗中部高原某水处理厂的水源水和终水中5种抗生素进行了调查。水样的采集采用两种取样技术，即抓斗取样和被动取样。由于一些技术和经济限制，以及缺乏有效的回收和基质效应数据，对抗生素的存在进行了定性评估。本研究结果表明，水源水中检出环丙沙星和氨苄西林，成品水中检出环丙沙星。结果表明，在水环境中，POCIS比抓取取样更有效。在调查的WTP水中存在AMP和CIP可能导致潜在的耐药细菌的出现，应在未来的研究中加以考虑。最后，我们的研究结果对公共健康的影响可能并不直接;然而，我们的研究确实强调需要对伊朗地表水中抗菌化合物的发生和细菌耐药性进行更广泛的调查。

利益冲突

没有利益冲突。

致谢

本文是批准的研究中心，伊斯法罕医学院（IUM）批准的研究项目结果。作者希望承认财务支持和研究项目的IUM研究副校厅，NOS。289220和290084。

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