文摘
Shenlian (SL)煎草药配方由黄连、人参、黄连素和人参皂苷是主要的成分。尽管SL汤在中国广泛用于治疗糖尿病,糖尿病功能的机制仍需进一步研究。肠道微生物群失调是导致糖尿病的重要因素之一。探索SL汤对肠道菌群的影响,分析了小鼠的肠道微生物群测序肠道细菌16 s rRNA V3 + V4地区和宏基因组。在这项研究中,结果表明,SL煎煮和有一个更好的血糖过低的影响β比人参或黄连细胞保护效应。α多样性分析表明,所有干预措施与人参、黄连,SL汤可以扭转增加肠道微生物群的多样性和丰富性db / db老鼠。PCoA分析显示口腔SL汤显著改变在db / db小鼠肠道微生物群组成。395 SL治疗后辣子鸡显示显著差异,其中37个辣子鸡丰富了SL煎煮与光纤光栅表现出显著的负相关,和204年辣子鸡减少了SL煎煮与光纤光栅呈显著正相关。KEGG分析和宏基因组测序的结果表明,SL汤可以减少Prevotellaceae,Rikenellaceae,Helicobacteraceae,与脂多糖生物合成、核黄素新陈代谢,和过氧物酶体,分别。它还可能上调的丰富类杆菌,这导致了淀粉和蔗糖代谢以及pentose-glucuronate互变现象。在物种水平,SL汤明显上调Bacteroides_acidifaciens的相对丰度与光纤光栅表现出显著的负相关,据报道,一个潜在的代理调节代谢疾病如糖尿病和肥胖。总之,SL汤在低血糖症有效,其机理可能与调节肠道微生物群通过上调Bacteroides_acidifaciens。
1。介绍
糖尿病是一种慢性血糖代谢紊乱疾病,与过多的卡路里摄入量有关,缺乏锻炼,遗传素质,等。根据国际糖尿病联合会(IDF)的数据,有4.63亿人被诊断出患有糖尿病在全球范围内,2019年预计将增加数量到7亿年的2045 (1]。随着糖尿病患病率的增加,其并发症也变得大威胁人类健康。越来越多的关注都集中在糖尿病。机制研究取得了很大的进步,许多有效的糖尿病药物被开发出来了。除了现代药物,中药已被证明是一个不错的选择治疗糖尿病。例如,来自高等人的研究表明,中药干预可以减少IGT的转化率糖尿病和改善胰岛素抵抗(2]。另一个随机临床试验显示,本厂Jiangtang平板电脑(中成药)可以有效地降低糖尿病的发病率,甚至扭转前驱糖尿病正常(3,4]。Tianqi胶囊,另一个中成药,也被证明是减少发病率的2型糖尿病与IGT科目。因此,中医是值得进一步研究。
Shenlian煎煮,它由黄连、人参在中国被广泛用于治疗糖尿病。用黄连和人参治疗糖尿病可以追溯到唐代,这是记录在书中前进,孙思邈写的。在明朝,这两种草药首先作为处方并记录在这本书Wanbinghuichun Shenlian汤。如今,许多研究表明,黄连和人参都有调节葡萄糖代谢的功能(5- - - - - -9]。此外,元等人的一项研究表明Shenlian汤在保护胰腺的功能β细胞(10]。然而,还需要进一步的研究来阐明其糖尿病的机制功能。在这项研究中,我们试图发现机制的调节肠道微生物群。
2。材料和方法
2.1。药品和试剂
黄连和人参从北京Kangmei制药有限公司,购买的内容代表化学成分的研究和实验中心由北京中医药大学(表1)。盐酸二甲双胍片是购买从中美上海施贵宝制药有限公司
2.2。动物治疗和粪便样本集合
所有动物实验伦理委员会的批准进行实验动物研究所的中医基本理论。六个雄性C57BL / KsJ-db / db小鼠和正常的同胞(db / m)从常州卡文购买实验动物有限公司(批准文号:SCXK(超自然)2016 - 0010)。所有的动物都被安置在一个装有空调的动物实验的房间与一个稳定的温度22 - 24°C,湿度的50 - 60%,12小时的光明与黑暗周期,免费的水和食物(标准食物饮食)。与光纤光栅水平高于13.9 db / db老鼠更易与l被随机分配到5组( ),包括糖尿病控制(DC)组(蒸馏水,0.2 ml / 10 g),黄连(HL)组(黄连、4.55克/公斤),仁生(RS)组(人参,0.455克/公斤),Shenlian (SL)组(黄连和人参,4.55 g和0.455 g / kg,分别),和二甲双胍(遇到)集团(二甲双胍,0.228克/公斤)。db / m老鼠作为正常控制(NC组)。干预由填喂法(0.2毫升/ 10 g) 8周。空腹血糖(FBG)是衡量使用血糖仪(强生)尾静脉血液一旦4周,8周。8周后,从每个动物新鲜的粪便样本收集通过一个干净的捕获方法,颗粒的表达直接进入无菌离心管和存储在-80°C。粪便样本被送往上海Majorbio Bio-Pharm科技有限公司有限公司,进行进一步处理。
2.3。免疫组织化学
免疫组织化学是如前所进行的过程(11]。胰岛素的抗体购自Proteintech(目录:15848 - 1 - ap)。
2.4。DNA提取、图书馆建设和宏基因组测序
总基因组DNA提取使用E.Z.N.A.粪便样本®土壤DNA工具包(ωBio-Tek,共同协助,乔治亚州,美国)根据制造商的指示。图书馆建设的过程和宏基因组测序是如前所进行的12]。
2.5。质量控制和基因组序列组装
上的数据分析了自由Majorbio云平台的在线平台(http://www.majorbio.com)。paired-end Illumina公司读取修剪了适配器和低质量的读取( 或质量 或有使用fastp(基地)13]。读取被BWA对齐到老鼠的基因组(http://bio-bwa.sourceforge.net、版本0.7.9a)和任何打击与读和他们的交配读取被移除。宏基因组数据组装使用基于[14,15)(https://github.com/voutcn/megahit1.1.2版本)。重叠群的长度或超过300英国石油公司被选为最后的组装结果,然后,叠连群被用于进一步的基因预测和注释。
2.6。物种注释和评价
样品测序结果集群。所有序列分为辣子鸡(操作分类单位)根据不同使用Uparse相似的水平。代表序列的辣子鸡相对丰度是用来计算社区丰富,群落多样性和社区覆盖指数mothur v.1.30.1(版本)。然后,代表序列的相对丰度表辣子鸡是用于UniFrac主坐标分析(PCoA) (Lozupone和骑士,2005),物种差异分析,冗余分析,和相关的热图分析。
2.7。基因预测、分类和功能注释
开放阅读框(orf)从每个组装叠连群预测使用MetaGene [16)(http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)。预测的orf(不少于100个基点)检索和翻译成氨基酸序列与NCBI转换表。目录是由CD-HIT nonredundant基因(17)(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/4.6.1版)序列的身份和90%的覆盖率为90%。读取后质量控制目录映射到nonredundant基因有95%的身份使用SOAP对准器(18)(http://soap.genomics.org.cn/2.21版),在每个样本和基因丰度评估。代表nonredundant基因序列目录是NCBI NR数据库一致截止值的使用钻石[19]。与钻石KEGG注释进行(http://www.diamondsearch.org/index.php、版本0.8.35)对基因和基因组的京都百科全书数据库(http://www.genome.jp/keeg/)和一个截止值的 。
2.8。统计分析
数据表示为 并使用SPSS 22.0进行分析。两组之间的显著差异被学生的评估 - - - - - -测试或韦尔奇的 - - - - - -测试样本的正态分布,Wilcoxon rank-sum测试样品不是正态分布。三个或更多的团体间的显著差异进行评估与Bonferroni单向方差分析的多重比较检验。是水平的意义 ; ; ; 。
3所示。结果
3.1。空腹血糖、体重和HOMA-IR db / db小鼠的免疫组织化学
光纤光栅和体重进行评估后6 h(除食品在早上(20.]。如图1(一),在8周的观察,db / db呈现显著高血糖小鼠与野生型相比控件( )。二甲双胍、HL、RS和SL汤显著降低血糖在前4周( ,0.05、0.01和0.05)。然而,在第八周,只有SL组血糖水平明显低于糖尿病对照组( )。至于体重,观测HL组无显著差异,RS, SL集团和满足集团,而DC组(图1 (b))。免疫组织化学进行了胰岛素的胰岛组织评估的功能β细胞。结果表明,减少胰岛素检测与db / db / db老鼠相比,老鼠( ),和霍奇金淋巴瘤( )和SL汤( )可以改善胰岛组织的胰岛素生成。SL汤的功效似乎比RS或霍奇金淋巴瘤在促进胰岛素生成(数字1 (c)和1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。α多样性分析细菌的相对含量
探索SL汤对肠道菌群的影响,分析了小鼠的肠道微生物群测序肠道细菌16 s rRNA V3 + V4地区和宏基因组。首先,我们使用MiSeq运行分析肠道微生物群的结构变化。总共2176480可用原始序列和3222辣子鸡,nonredundant目录1609093基因构造。保险(社会保险)多样性曲线表明,覆盖了几乎所有的序列的测序结果的示例中,这意味着结果能反映真实情况的微生物群社区样本(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
哭泣(观察到的丰富)和香农多样性(香农多样性指数)曲线显示大部分的多样性和丰富性的肠道微生物群社区已经被抓获。DC组有显著较高的微生物群的多样性和丰富性与NC组( )。治疗8周后,增加微生物群的多样性和丰富性被HL成功逆转,RS和SL汤(数字2 (d)和2 (e))。
3.3。肠道微生物群的组成变化
PCoA分析显示一个清晰的分离肠道微生物群直流和其他组织之间的结构(图3(一个)相比),特别是与直流SL集团集团(图3 (b))。此外,肠道微生物群的相对水平比较组间的门水平。DC组Epsilonbacteraeota的丰度,变形菌门,Tenericutes明显高于NC组(图3 (c))。值得注意的是,HL、RS和SL汤能减少大量的Epsilonbacteraeota Tenericutes,和二甲双胍降低变形菌门。更重要的是,HL、RS和SL也增加了大量的Verrucomicrobia和减少大量的放线菌,Patescibacteria和Deferribacteres(数据吗3 (d)- - - - - -3 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4。肠道微生物群的结构和光纤光栅之间的相关性
SL汤在db / db小鼠显著改变肠道微生物群组成,肠道微生物群的相对水平明显不同直流和SL集团在家庭水平和属级(数字4(一)和4 (b)),前20名OTU差异如图4 (c)。为了识别特定的肠道细菌,可能与光纤光栅SL治疗后,斯皮尔曼之间的相关性分析肠道微生物群社区和光纤光栅(图4 (d))。总的来说,395 SL治疗后辣子鸡显示显著差异。316辣子鸡是下降,79年增加。在79 SL辣子鸡丰富,37个辣子鸡与光纤光栅表现出显著的负相关(补充表1),这些辣子鸡属于Akkermansiaceae ( ),unclassified_o__Bacteroidales ( ),unclassified_k__norank_d__Bacteria ( ),Tannerellaceae ( ),Ruminococcaceae ( ),Rikenellaceae ( ),Peptostreptococcaceae ( ),norank_o__Rhodospirillales ( ),Muribaculaceae ( ),Lachnospiraceae ( ),Erysipelotrichaceae ( ),肠杆菌科( ),和类杆菌( )在家庭层面上。在316辣子鸡减少了SL 204辣子鸡呈显著正相关与光纤光栅(补充表2);这些辣子鸡属于unclassified_o__Bacteroidales ( ),Tannerellaceae ( ),链球菌科( ),Saccharimonadaceae ( ),Ruminococcaceae ( ),Rikenellaceae ( ),Prevotellaceae ( ),Peptococcaceae ( ),norank_o__Gastranaerophilales ( ),Muribaculaceae ( ),Moraxellaceae ( ),Marinifilaceae ( ),杆菌( ),Lachnospiraceae ( ),Helicobacteraceae ( ),Erysipelotrichaceae ( ),Eggerthellaceae ( ),Desulfovibrionaceae ( ),Deferribacteraceae ( ),Clostridiales_vadinBB60_group ( ),Clostridiaceae_1 ( ),Christensenellaceae ( ),Burkholderiaceae ( ),Bifidobacteriaceae ( ),和类杆菌( )在家庭层面上。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。代谢和合成功能的变化引起的肠道微生物群SL煎煮
探讨代谢和合成功能的改变在肠道微生物群由SL, KEGG通路富集分析。最丰富的功能包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核酸代谢,复制和修复能量代谢,代谢代数余子式和维生素和多糖生物合成(图5)。KEGG分析之间的差异表达基因直流和SL如图6(一),斯皮尔曼KEGG之间的相关性分析和光纤光栅图所示6 (b)途径3级。淀粉和蔗糖代谢的丰度,以及pentose-glucuronate互变现象,表现出显著的负相关与光纤光栅和SL治疗后显著增加。此外,核黄素新陈代谢的相对丰度,过氧物酶体和脂多糖生物合成呈显著正相关与光纤光栅和SL治疗后明显下降。
(一)
(b)
贡献能力的分析不同菌株的宏基因组测序,类杆菌被发现显示的最大贡献淀粉和蔗糖代谢和戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象。Prevotellaceae贡献最核黄素代谢和脂多糖的生物合成。过氧物酶体,Rikenellaceae、Helicobacteraceae Prevotellaceae(图做了巨大的贡献7)。重要的是,SL汤能显著减少大量的Prevotellaceae, Rikenellaceae, Helicobacteraceae和增加丰富的类杆菌。类杆菌的相对丰度的变化和Prevotellaceae在SL集团特别重要,相比与其他治疗组(图8)。更重要的是,SL汤能减少的相对丰度与光纤光栅21种呈正相关(表吗2)属于Prevotellaceae、Rikenellaceae Helicobacteraceae值得注意的是,与脂多糖生物合成,核黄素新陈代谢,和过氧物酶体。它还可以移植的相对丰度与光纤光栅(表6种负相关3)属于类杆菌,这导致了淀粉和蔗糖代谢以及pentose-glucuronate互变现象。
直流和SL集团的数据显示为相对丰度(%)的物种,在每组家庭。统计分析是由Mann-Whitney执行的多个测试的测试调整。
4所示。讨论
糖尿病是一种慢性代谢疾病死亡率和发病率高,从而导致多器官损伤,包括肾脏、眼睛、心脏、神经和血液循环。
传统中药(TCM)治疗糖尿病的历史悠久,可以追溯到汉朝。中国古代医生在这数千年,积累了很多经验在治疗糖尿病。Shenlian汤就是其中之一。越来越多的研究表明,降糖中药调节葡萄糖通过调节肠道微生物群。关丽珍等人证明,人参提取物可以调节microbiota-lcFa-Bat轴,在肥胖(发挥了重要作用21]。小檗碱、黄连的主要提取,用于治疗糖尿病和调节肠道微生物群被证明是糖尿病的主要机理函数(22]。在这项研究中,结果表明,Shenlian汤有很好的降糖功能,这是比黄连或人参后8周的干预。结果胰岛素包含IHC还表示,SL汤在保护的功能有一个更好的效果β细胞比人参或黄连。因为在中医理论,糖尿病的基本机制是“热伤气阴。“这意味着病原体热、气虚和阴虚是糖尿病患者的主要症状。因此,在临床实践中,中医医生总是使用黄连一起清除热量和人参温补气血和阴。一些研究报道,人参未能降低血糖(23]。原因是人参可以温补气血和阴但不能明确病原体热量。因此当使用人参单独治疗糖尿病,不能足够好的功效。
越来越多的研究表明,糖尿病有密切关系的紊乱的肠道微生物群(24]。失调的肠道微生物群可以扰乱肠道屏障,导致病原体,促炎细胞因子,和有害代谢物进入血液循环,有助于慢性低度炎症(25]。失调的肠道微生物群在糖尿病也表现为下降的短链脂肪酸(舱)生产。低级的方法诱导减少肽YY和glucagon-like肽- 1 (GLP)分泌,增加食物摄入量,而且破坏了肠道屏障(26]。更重要的是,支链氨基酸(BCAA)生物合成是提升当失调的肠道微生物群的发生和高BCAA水平会导致胰岛素抵抗[27,28]。在这项研究中,结果表明,SL汤可能会改变在db / db小鼠肠道微生物群组成。改变辣子鸡,37个辣子鸡与光纤光栅表现出显著的负相关,204辣子鸡和光纤光栅呈显著正相关。更重要的是,与组成、肠道微生物群的功能也由SL汤,包括淀粉和蔗糖代谢,pentose-glucuronate互变现象,核黄素新陈代谢、过氧物酶体和脂多糖生物合成相关的边后卫。进一步分析表明,SL汤能够减少Prevotellaceae的相对丰度,Rikenellaceae, Helicobacteraceae和增加丰富的类杆菌。这四个家庭的贡献主要是FBS-related功能。
在物种水平,SL汤移植的相对丰度Bacteroides_acidifaciens值得注意的是,与光纤光栅表现出显著的负相关,据报道,一个潜在的代理调节代谢疾病如糖尿病和肥胖。报道,野生型C57BL / 6小鼠喂食了Bacteroides_acidifaciens明显更有可能获得更少的体重和脂肪和显示,血清胰岛素水平升高,伴随着增加血清glucagon-like peptide-1和减少肠道dipeptidyl peptidase-4 [29日]。因此,Bacteroides_acidifaciens upregulation可能是血糖过低的SL的函数汤的关键机制。此外,α多样性的结果分析表明,HL和SL汤减少微生物群的多样性和丰富性,由前研究[30.,31日]。这个结果可能主要是由黄连的抗菌效应(32]。肠道微生物群的多样性和丰富性db / db老鼠可以给有益的细菌更多成长空间。这意味着SL汤调节肠道微生物群通过“重启微生物群”模式。
总之,SL汤被证明是有效地通过调节肠道微生物群的低血糖,尤其是Bacteroides_acidifacien的物种。在将来,一个随机对照试验应该进行进一步证明其疗效和机制研究应关注的家庭Prevotellaceae, Rikenellaceae, Helicobacteraceae、类杆菌。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
伦理批准
本研究进行了按照巴塞尔宣言的原则和建议的动物实验伦理。所有动物实验进行实验动物伦理委员会的批准,学院对中医基本理论。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Rui-xi太阳,Wei-jun黄,肖姚参与本研究的设计,完成动物实验和写作论文。“豆豆”小王和花鸟画μ帮助完成动物实验。他奶奶,Bo-ran倪,萧蔷黄Xuan-quan王,刘Yi-fan帮助完成preexperiment和数据分析。金喜善赵和Qiang-Fu设计研究和监督工作。所有作者同意最后的手稿。Rui-xi太阳,黄Wei-jun,肖姚的贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81774272和81774272)。
补充材料
补充1。补充表1:37个辣子鸡的物种分类信息。
补充2。补充表2:204辣子鸡的物种分类信息。