文摘
GDM的患病率很高。GDM的具体发病机制目前并不清楚。最近的研究表明,在怀孕期间肠道菌群的变化起着关键的作用。因此,本研究旨在探讨肠道菌群的特点,妊娠糖尿病患者在怀孕的第三个三个月,发现肠道菌群与健康孕妇显著差异提供依据未来临床尝试使用肠道微生态制剂治疗妊娠期糖尿病(GDM)。我们测序V3-V4地区的16 s核糖体核糖核酸(rRNA)基因从52单胎孕妇的粪便样本> 28周的妊娠。我们的研究结果显示,和组之间有显著差异与GDM组和G组和LG集团之一拟杆菌,厚壁菌门,厚壁菌门/拟杆菌属。在物种水平上,有显著差异在八个物种的丰度也和GDM组。其中,相对丰富的Clostridium_spiroforme,Eubacterium_dolichum,Ruminococcus_gnavus呈正相关,光纤光栅,Pyramidobacter_piscolens与光纤光栅是负相关,而有显著差异在大量的5种G和LG集团。功能分析表明有多糖的生物合成和代谢的差异,消化系统,分类,和之间的肠道微生物降解和GDM组和G和LG组之间。这些结果表明,肠道微生物之间GDM患者在妊娠晚期妊娠和健康对照组的基本特征变化和可能参与调节患者的血糖水平。
1。介绍
GDM指的是第一次出现不同程度的葡萄糖代谢异常在怀孕期间。它是一种常见的妊娠并发症1,2]。根据国际糖尿病联合会(IDF),六分之一(16.8%)的母亲活产儿有某种形式的孕期高血糖,其中84%的人被诊断出患有GDM [3]。GDM亚洲人群的发病率可高达20%。尽管大多数GDM患者产后葡萄糖代谢恢复正常,20%的人继续有葡萄糖耐量或空腹血糖(FBG)产后和GDM患者使用寿命明显高于2型糖尿病的风险,这是non-GDM患者的7.4倍(4]。最近进行的一项研究还发现,独立于肥胖和2型糖尿病,GDM也是一个危险因素高血压、代谢综合征、心血管疾病(5- - - - - -8]。这些方面不仅产生严重影响的短期和长期健康的母亲和婴儿也继续增加医疗费用,大大增加社会负担。因此,GDM或早期识别高危人群的早期诊断尤为重要。
GDM的具体发病机制目前并不清楚。最近的研究表明,肠道菌群的变化在怀孕期间扮演着一个关键角色,它(9,10]。2007年,提出了“人类微生物组计划”。近年来,随着宏基因组和代谢组学的出现,越来越多的疾病已被证明与肠道菌群(11- - - - - -13]。正常肠道菌群和粘膜表面形成天然屏障,在消化和吸收起着至关重要的作用,调节免疫功能,防止致病菌的入侵。国内外研究表明,肠道微生物区系疾病的发病机制的研究中扮演着重要角色肥胖,2型糖尿病、炎症性肠病、肝病、肾功能损伤,自闭症,和其他疾病(14- - - - - -18]。怀孕,尤其是在妊娠晚期,是一个独特的时期。随着身体的代谢需求的增加,肠道菌群的代谢器官,“也会发生适应性变化(19,20.]。肠道菌群的特点在怀孕的第三个三个月及其与GDM发病的相关性已成为研究热点。
在这项研究中,我们使用16 s rRNA高通量测序技术检测肠道细菌与GDM孕妇和正常孕妇在怀孕的不同阶段(几个星期,36-41周),分析了不同植物的三组孕妇。如果正常孕妇的肠道菌群之间存在差异和GDM患者,这将有助于我们了解GDM的发病机制,并提供一个理论基础为未来治疗妊娠期糖尿病的补充益生菌。因此,本研究的目的是调查是否有正常的肠道菌群之间的差异与GDM孕妇和那些通过使用16 s rRNA高通量测序技术来确定正常的肠道菌群与GDM孕妇和那些在怀孕的第三个三个月。
2。材料和方法
2.1。研究人群
从10月1日至2018年12月30日,2019年,52单胎孕妇超过28孕周招募从郑州大学第三附属医院的门诊部。其中,23 GDM,进一步分为长妊娠周(LG集团 )和较短的妊娠周(G组, )根据胎龄是否大于36周。其余29 normoglycemic孕妇(或组)。入选标准如下:孕妇没有孕前糖尿病、高血压、严重损害其他器官,其他代谢疾病、其他内分泌疾病,慢性消化道疾病史,腹泻,或其他胃肠疾病在过去4周;那些服用抗生素或肠道益生菌在过去4周;与常规粪便检查异常。我们排除了这些标本不足数量的样本期间保留或污染标本保护。医学伦理委员会批准郑州大学第三附属医院目前的研究中,和所有参与者提供书面知情同意的形式。
2.2。GDM的诊断标准
GDM的诊断是如果下列条件得到满足:(1) ,(2)1 h血糖75克 ,和(3)2血糖75克 (21]。
2.3。样品收集
早餐前收集粪便样本(1 g),放入无菌塑料管子。采用一个抽样框保持样品在低温0.5 h运输回实验室,−80°C冷冻储存,DNA提取48 h内完成。
2.4。生化指标的检测
我们使用了日立7600 - 020自动生化分析仪检测光纤光栅(己糖激酶法检测)、总胆固醇(酶比色检测)、三酰甘油(TG、酶比色法检测)、高密度脂蛋白胆固醇(过氧化氢酶去除方法检测)和低密度脂蛋白胆固醇(过氧化氢酶去除方法检测)。五个测试项试剂都是由四川迈克生物科技有限公司所有实验过程进行了高级和低级控制产品质量,确保测试结果的准确性。
2.5。细菌的DNA提取和16 s rRNA基因测序
DNA提取和16 s rRNA基因测序由武汉华大基因测序中心。粪便样本的总细菌的DNA的提取是根据指令进行BGI凳子基因组提取工具。用显微分光光度计检测DNA的浓度和纯度。当吸光度260/280的比例是1.7至1.9,提取的DNA被认为是可用的。我们设计了16 s rRNA基因PCR引物使用总DNA作为模板放大16 s rRNA V3-V4高变区。随后,2500年Illumina公司Hiseq PE250协议用于有针对性的扩增子测序。我们使用了Flash软件合并对面的原始序列和把他们标记。最小重叠15岁英国石油(bp)和失配率< 0.1。
2.6。OTU集群
操作分类单位(OTU)指的是一个统一的标志设置人为一定分类单位(属,物种、分组、等)为了便于分析发展史或种群遗传学研究。我们使用软件USEARCH (v7.0.1090)集群通常辣子鸡和集群拼接标记成一个OTU相似度超过97%。丰富的OTU初步说明了样品的物种丰富度。
2.7。OTU物种注释
OTU获得代表序列后,我们使用RDP分类器(v2.2)软件比较代表物种的OTU绿色煤电数据库序列注释并设置置信水平为0.8。注释结果过滤如下:(1)删除辣子鸡没有注释结果和(2)删除注释结果不属于该物种在分析项目。例如,如果样本是由16 s细菌和OTU注释古生菌,它将被删除。
2.8。统计处理
我们使用软件R (v3.1.1)的维恩图包生成维恩图和OTU Core-Pan图和R (v3.2.1) ' s mixOmics包OTU PLS-DA分析。我们用R (v3.1.1) ' s gplots包生成一个物种丰度热图的欧几里得距离算法的聚类方法完成。GraPhlAn (https://huttenhower.sph.harvard.edu/graphlan)被用来生成一个物种组成的地图。R (v3.4.1)的集群和clusterSim包被用于植物类型分析。R (v3.2.1)被用来生成一个α多样性箱线图。R (v3.4.1) ' s ggplot包是用于生成β多样性指数盒阴谋。LEfSe (https://huttenhower.sph.harvard.edu/星系)是用于分析集群图和LDA图。我们用R(3.4.1)和克鲁斯卡尔-沃利斯检验屏幕所使用的不同的物种和R (v3.4.1)和Picrust软件预测植物的功能。Cytoscape被用来绘制网络图的物种。使用SPSS 23.0进行统计处理。正态分布的测量数据为代表 ,和统计数据由“百分比(%)或速度。“比较两组是由一个 - - - - - -测试。皮尔森相关系数是用来评估血糖和不同植物之间的相关性。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。分析两组之间的一般条件和生化指标
根据收集到的通用数据的统计分析和实验室数据,没有显著差异在年龄和胎龄GDM和或组。BMI的水平,光纤光栅,2小时血糖、糖化血红蛋白和TG,胆固醇,和低密度脂蛋白在GDM组显著高于组,和高密度脂蛋白水平显著降低GDM组比和集团( )。G和LG集团之间的比较表明,只有孕龄两组之间均有显著差异( ),和其他指标差异不显著。细节是在表中找到1。
3.2。OTU序列多样性和丰富性
52样本测序后,共有866个辣子鸡后生成聚类。OTU聚类分析后,获得的序列值,结果如下。平均有效序列获得的粪便菌群和集团是74841年和779年辣子鸡获得合并后97%相似,和测序覆盖深度覆盖指数为0.99932。获得的平均有效序列的粪便菌群GDM组74846人。在97%相似性合并之后,721得到了辣子鸡,测序覆盖指数为0.99938。此外,GDM组分为G组怀孕不到36周时。在608年97%的相似性,辣子鸡是获得,测序覆盖指数为0.99934。LG集团是由怀孕≥36周的孕妇和563辣子鸡获得97%相似性合并后,和测序覆盖指数为0.99941。测序深度在0.99以上,表明样本组中未被发现的序列的概率很低。
的α多样性指数的分析两组样本在97%相似性水平显示,观察到的物种指数,曹国伟指数,Ace指数和覆盖指数水平的GDM也组相似,无显著差异。香农指数GDM组显著高于集团,而辛普森指数低于或组。它可以大致估计α多样性的GDM组大于,或组。此外,在与GDM孕妇中,粪便菌群 周(G组) 周(LG集团)分析了α多样性指数在97%相似性水平。曹国伟的平均值和Ace索引在G组是235年和239年,分别在LG集团在233年和237年。结果表明,细菌的丰度在G组高于LG集团,但是差异没有统计学意义( )。香农和辛普森指数的平均值在G组分别为3.21和0.10,分别和平均值和组分别为2.75和0.19,分别。植物的多样性在G组高于LG集团,但是差异没有统计学意义( )。具体结果见图1。
(一)
(b)
维恩图分析表明,也和GDM组共享634辣子鸡(图2(一个))。PLS-DA分析表明,也和GDM组集群和杰出的(图2 (b))。它还建议有显著差异之间的植物样本的组成和结构两组。
(一)
(b)
获得对应于每个OTU物种分类信息,我们使用RDP贝叶斯分类器算法进行分类分析OTU代表序列和计算每个样本的细菌组成的门,类,顺序,家庭,属,物种。
热映射聚类分析可以直观地显示样本的聚类同样的待遇或类似的环境和反映细菌组成的相似性和差异的样本(数据3(一个)和3 (c))。GraPhlan物种组成地图主要表现的整体视觉显示每个分类的样本的物种组成,每个taxum用不同的颜色区分,反映了每个分类级别的物种丰度的大小通过节点,并使用外环的颜色深度热图代表每组的物种丰度。它可以用来发现主导微生物组(数字3 (b)和3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
我们分析了物种的相对多度的GDM也组织在门级。和组拟杆菌门,厚壁菌门,变形菌门是主要的植物,占68.2%,23.2%,和7.4%,分别占总数的植物,而在GDM组占53.6%,38.1%,植物总数的5.1%。结果表明,的比例拟杆菌GDM组明显低于不组,和的比例厚壁菌门GDM组显著高于不组。的比例厚壁菌门/拟杆菌GDM组(0.71)显著高于或组(0.34)。
占主导地位的细菌在G和LG集团拟杆菌门(43.79%和62.15%)和壁厚菌门(48.29%和29.19%)。拟杆菌门与G组相比均有显著提高,和厚壁菌门与G组相比显著降低。厚壁菌门和拟杆菌门比(1.10)的G组显著高于LG集团(0.47)。
3.3。分析肠道菌群的物种差异
LEfSe聚类分析的GDM组和组是由LDA,结果如图4(一)和4 (b)。和集团9组细菌组之间的差异的影响,也就是说,拟杆菌门,细菌性的,Bacteroidia,Betaproteobacteria,Alcaligenaceae,Sutterella,Burkholderiales,Pyramidobacter,Dethiosulfovibrionacea。GDM组,组的细菌组之间的差异的影响Coriobacteriaceae,Coriobacteriia,Coriobacteriales,Collinsella,Dorea,Coprococcus,瘤胃球菌属,Ruminococcaceae,毛螺菌属,Blautia,Lachnospiraceae,梭菌属的,梭状芽胞杆菌,厚壁菌门。
(一)
(b)
此外,通过Wilcoxon rank-sum测试和Mann-Whitney测试中,两组样本的物种在门中,类,顺序,家庭,属,物种水平显著差异分析和结果的差异在物种水平数据所示4(一)和4 (b)和表2。的相对丰度Blautia有的时候,spiroforme梭状芽胞杆菌,Collinsella aerofaciens,Coprococcus卡图斯,真细菌dolichum,Pyramidobacter piscolens,瘤胃球菌属callidus,瘤胃球菌属gnavus等,也和GDM组之间的差距显著。上述差异具有统计学意义( )。
3.4。相关分析的肠道微生物和血糖
了解肠道细菌之间的密切关系和血糖代谢,上述的相对丰度之间的相关性不同的细菌种类和光纤光栅分别进行了分析。结果如图所示5。的相对丰度spiroforme梭状芽胞杆菌( , ),真细菌dolichum( , ),和瘤胃球菌属gnavus( , )也和GDM组呈正相关,光纤光栅。Pyramidobacter piscolens( , )与光纤光栅负相关。其他细菌与光纤光栅没有相关。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。分析肠道微生物功能的差异
我们计算了每一个功能类别丰富的基于KEGG数据库中的信息和OTU丰度信息。此外,通路,我们使用PICRUSt获得三个级别的代谢途径的信息并获得每个级别的丰度表。同时,16 s物种信息映射的功能基因组成齿轮数据库中获取功能预测的结果。齿轮数据库有两个层次,即表示cog_level1 cog_level2。
我们预测功能的样品后,我们使用了Wilcoxon测试发现每组之间的差异函数。的比较结果KEGG二级和齿轮和集团的二级与GDM组和G组和LG集团在图所示6。区别cog_level2的比较结果表明,肠道微生物也和GDM组明显不同的细胞壁/膜/信封生物起源、有机离子运输和代谢,转译后的修改,蛋白质周转,和陪伴,转录,函数未知,细胞内贩卖,分泌,和膜泡运输(图6(一))。肠道微生物在G和LG集团在氨基酸运输和代谢有显著差异,复制、重组和修复,细胞壁/膜/信封生源论,和转录(图6 (b))。kegg_level2差异比较结果表明,肠道微生物也和GDM组明显不同聚特征而言,转录,多糖的生物合成和代谢,运输和分解代谢、消化系统、膜运输、传染病、折叠、排序和退化,细胞过程和信号,核苷酸代谢,和其他人(图6 (c))。肠道微生物的G组和LG组明显不同的消化系统,多糖的生物合成和代谢,传染病、核苷酸代谢,多酮类化合物和萜类代谢(图6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
作为一种常见的代谢性疾病孕妇,GDM严重危及生命、健康、和安全的母亲和他们的后代(22]。有研究指出,肠道菌群的变化可能与GDM的发病机制(23]。越来越多的学者发现,肠道菌群结构的变化可能是罪魁祸首在许多代谢疾病,如肥胖和2型糖尿病,糖尿病和妊娠期糖尿病的一种形式。近年来,已经有越来越多的证据表明,其发病可能与肠道菌群的结构变化(24,25]。研究在中国已经发现,与健康的孕妇(主要是妊娠28周),肠道微生物群的α多样性与GDM孕妇的孕龄降低(26]。然而,一些研究已经表明,大量的肠道菌群与GDM孕妇在怀孕中期高于健康的孕妇,但没有显著差异在两组之间的α多样性27]。本研究表明,α多样性的肠道菌群与GDM孕妇怀孕后期显著高于健康孕妇孕龄相同。三项研究之间的差异不能underlooked基于胎龄。这表明当前对肠道菌群的研究仍然是完全不同的,这可能与种族的差异等因素有关,年龄、饮食结构、生活习惯、实验和统计方法。一般来说,研究肠道菌群和GDM缺乏与大样本前瞻性研究和多个区域,和学者仍然需要继续探索。
此外,分析物种的相对多度GDM也组显示,占主导地位的细菌组拟杆菌门和厚壁菌门,但的比例拟杆菌门GDM组明显低于不组,和的比例厚壁菌门和组明显高于。的厚壁菌门和拟杆菌门GDM组的比例(0.71)显著高于或组(0.34)。厚壁菌门和拟杆菌门是两个主要优势在肠道细菌的群体。他们可以保持能量平衡的主机通过参与脂肪和胆汁酸的代谢。他们的比率( 值)通常是作为指标的不同个体的肠道菌群的组成(28- - - - - -31日]。学者名叫Ferrocino发现怀孕,妊娠中期到的的数量厚壁菌门在小肠增加,而的数量拟杆菌和放线菌减少(32]。的数量的增加厚壁菌门能促进碳水化合物的新陈代谢如果糖、半乳糖、甘露糖醇、淀粉和蔗糖在肠道,从而加重高血糖,而的影响拟杆菌门是相反的33- - - - - -36]。肠道菌群的失衡在妊娠中期和可能影响含氮物质的吸收,阻止胆汁酸周期,影响糖和脂肪在体内的新陈代谢,并最终导致GDM。怀孕期间肠道菌群的变化类似于肥胖患者。在怀孕中后期,以满足胎儿生长发育的需要,怀孕妇女对抗胰岛素样物质的增加。孕妇对胰岛素的敏感性随孕周增加,并相应地胰岛素需求增加。有一定程度的生理胰岛素抵抗(IR)在体内的葡萄糖代谢本身37,红外也是肥胖的一个重要机制,GDM。
进一步分析物种的差异表明,大量的8株有显著差异也和GDM组在物种水平,而有显著差异在丰富的五株G和LG集团。另外,也和GDM组之间的微分压力不同于G和LG组之间,表明有长期和短期妊娠肠道微生物的差异GDM患者在怀孕后期。在进一步分析不同菌株之间的相关性和病人的血糖,结果显示,G和LG集团之间的差异与血糖低相关。可能是不同菌株的数量很低,不足以影响血糖。的相对丰度spiroforme梭状芽胞杆菌,真细菌dolichum,瘤胃球菌属gnavus也和GDM组与光纤光栅呈正相关,和Pyramidobacter piscolens与光纤光栅负相关。研究表明,瘤胃球菌属可引起细胞吸收太多的糖,这可能导致肥胖或超重(38,39]。然而,一些研究人员相信瘤胃球菌属可以促进胆汁酸的代谢,可以绑定GBPAR1和胆汁酸受体(FXR)来帮助调节体内平衡的肠道菌群,防止肠道微生物释放过多的脂多糖,这有助于胰岛素降低血糖(40,41]。的瘤胃球菌属gnavus摘要物种属于属是一个物种瘤胃球菌属。这项研究的结果表明,它与光纤光栅在怀孕的后期呈正相关GDM患者。
随后,特定功能的变化引起的GDM肠道微生物的变化进行了分析。不同的分析表明,肠道微生物也和GDM组参与生物合成和代谢,消化、分类,以及多糖的降解。还有其他不同的生物效应,这表明有一个GDM的发生和发展之间的联系,并进一步分子实验是必要的研究机制。
5。结论
简而言之,与16 s rDNA高通量测序技术的发展,宏基因组,代谢组学,和其他技术,研究肠道菌群和GDM逐渐加深。肠道菌群代谢产物通过各种致病因素,诱发轻度慢性炎症和内毒素引起红外,胆汁酸代谢的途径,改变等,全面影响GDM的发生和发展。研究肠道菌群可能调整饮食结构、益生元、益生菌制剂和其他项目治疗GDM实现GDM和个性化治疗的早期预防和减少母亲和儿童的不良妊娠结局。进一步深入研究妊娠期糖尿病和肠道菌群之间的关系,相信在不久的将来,可以补充有益的细菌来预防和治疗妊娠糖尿病,具有重要意义在促进母亲和儿童健康,减少糖尿病的发生。
缩写
| GDM: | 妊娠期糖尿病 |
| OGTT: | 口服葡萄糖耐量试验 |
| 核糖体rna: | 核糖体核糖核酸 |
| 光纤光栅: | 空腹血糖 |
| OTU: | 操作分类单位 |
| LEfSe: | 线性判别分析效应大小 |
| PLS-DA: | 偏最小二乘分析的歧视 |
| TC: | 总胆固醇 |
| TG: | 三酰甘油 |
| 高密度脂蛋白胆固醇: | 高密度脂蛋白胆固醇 |
| 密度: | 低密度脂蛋白胆固醇。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
G.X.L.,S.H.C., P.Y., and W.L.G. researched and analyzed the data and wrote the manuscript. E.W.Y., Y.J.X., and S.H.C. designed the study and provided substantial contribution to the overall discussion. T.X.Z. and S.H.G. edited the manuscript. J.Y. is responsible for the integrity and the accuracy of the data analysis.
确认
武汉华大基因测序中心的技术帮助。这项研究得到了河南省科学技术厅、中国(202102310067)。