文摘

目标。趋化因子受体CXCR4扮演关键角色的发展糖尿病神经性疼痛(DNP)老鼠,及其机制是未知的。本研究旨在评价抗氧化剂防治作用的潜在治疗价值(NAC)在老鼠和如何对DNP趋化因子受体CXCR4参与DNP的形成。方法。控制或链脲霉素(STZ)诱导大鼠糖尿病Sprague-Dawley收到车辆或NAC 4周注射STZ后一周开始。冯·弗雷和哈格里夫斯装置被用来分析机械触诱发痛和热痛觉过敏的行为变化。趋化因子受体CXCR4、p-CXCR4白介素- 6 (IL),和肿瘤坏死因子(TNF)α在脊髓和脑额叶前部皮层被免疫印迹检测。血浆il - 6、TNF -α,超氧化物歧化酶(SOD) 1, SOD-2,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和15-F2t-Isoprostane被ELISA检测。结果。爪子提取阈值的值(佩恩表的编制者)和爪子撤军延迟(PWL)在糖尿病大鼠相比,减少了控制老鼠与趋化因子受体CXCR4的显著增加,伴随p-CXCR4, il - 6和TNF -α蛋白表达在脊髓和前额叶皮层。NAC治疗降低il - 6和TNF -α蛋白表达,进一步增加趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4在糖尿病大鼠的脊髓和大脑皮层,伴随着增强佩恩表的编制者和PWL。南京也明显减弱或恢复血浆il - 6的增加,肿瘤坏死因子-αSOD-1 SOD-2, MDA, 15-F2t-Isoprostane在糖尿病大鼠。结论。得出NAC治疗可以有效地减轻DNP和诱导趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4可能代表一种机制,NAC减弱DNP。

1。介绍

糖尿病神经性疼痛(DNP)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,这给糖尿病患者带来的痛苦(1,2]。DNP的底层机制是复杂的,外围和中心组件的感官系统据报道,参与神经病变的进展和维护。增加氧化应激是一种统一的机制在DNP的因果关系(3]。高血糖诱导激活多元醇、己醣胺通路,形成先进的糖化终端产品已知增加活性氧的生产(ROS)导致神经损伤4,5]。过度的一代的ROS发起一个恶性循环通过激活物NF-Kb等途径,p38 MAPK和蛋白激酶C (6)或促炎细胞因子,导致糖尿病并发症(7,8]。高血糖导致更高水平的促炎细胞因子,已被证明与神经病变的发生率[9,10]。

趋化因子受体CXCR4是一个特定的趋化因子受体matrix-derived因子- 1 (CXCL12)。趋化因子受体CXCR4 / SDF-1信号与神经性疼痛的发病机制在动物模型的一个子集,包括糖尿病神经性疼痛(11,12]。一项研究表明,特定的趋化因子受体CXCR4拮抗剂AMD3100能扭转DNP在老鼠模型中炎症趋化因子受体CXCR4坐标的II型糖尿病和糖尿病背根神经节(13)在糖尿病可能导致疼痛的发展(14]。我们先前的研究发现,佩恩表的编制者的价值观和PWL减少糖尿病大鼠中伴随的趋化因子受体CXCR4和TNF -的显著增加α在糖尿病的诊断相关蛋白表达(15]。然而,趋化因子受体CXCR4的作用与ROS DNP的发展还有待确定。

南汽,谷胱甘肽的前体,其抗氧化效果通过增强内源性谷胱甘肽(GSSG [16]。南京汽车也产生了广泛的影响,这包括衰减的疼痛(17和授予脊髓损伤后神经保护18和周围神经病变19]。我们先前的研究发现prooxidative NADPH氧化酶的表达和炎症标记物增加STZ-induced糖尿病大鼠的心脏,这些原因可能是减少了NAC (20.,21]。然而,南汽的潜在影响和机制DNP尚未探索。

疼痛传导是由表达下调通路,引起的周边和中枢神经系统敏感。神经性疼痛的中枢敏化是一个重要的发病机制,和神经性疼痛的维护在于中枢敏化(22]。因此,我们提出观察炎症因子和趋化因子受体CXCR4蛋白表达的变化在脊髓的糖尿病大鼠前额叶皮层DNP并确定抗氧化剂治疗的影响与防治炎症介质和趋化因子受体CXCR4在脊髓和前额叶皮层和对糖尿病神经性疼痛的影响。

2。材料和方法

2.1。实验动物

男性成人Sprague-Dawley链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病与非糖尿病控制老鼠。所有大鼠( ,6 - 8周)获得和安置在实验室动物服务中心(香港大学)和接受标准治疗的动物保健原则按照香港大学。委员会批准使用动物生活在教学和研究的实验协议。

2.2。诱导的糖尿病,抗氧化治疗

1型糖尿病是由尾注射STZ诱导(美国σ)的剂量65毫克/公斤体重在0.1 mol / L柠檬酸缓冲(pH值4.5)或柠檬酸缓冲单独控制麻醉的联合氯胺酮67.7毫克/公斤体重和甲苯噻嗪(6.77毫克/公斤体重23]。血糖测试由OneTouch UltraVue glucometer(美国约翰逊)注射后72小时。大鼠血糖水平高于16.7更易在注射STZ被认为T1DM L 72小时,进行后续实验。在基线血糖和体重测量和监控每周在实验。

一些治疗糖尿病老鼠NAC (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。老鼠被随机分为三组 每组:控制(C),未经治疗的糖尿病大鼠(D),和糖尿病大鼠治疗NAC (D + N)。NAC (Sigma-Aldrich)溶解在饮用水3周的治疗后1周开始时间诱导糖尿病(图1)。我们使用一剂NAC 1.5克/公斤/天;选择最优用量根据我们先前的实验(24]。南汽的日剂量(1.5 g / kg)溶解到2/3的体积平均每日的饮水量估计基于初步研究和先前的研究,确保南汽的总量被老鼠在额外的水供应。与此同时,血糖、体重和水的摄入量老鼠经常监控。

2.3。行为评估

老鼠受到行为评估注射STZ前(基线)和注射STZ后4周。测量机械敏感性,爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)的老鼠被电子·冯·弗雷测试评估(IITC) [25]。在实验之前,老鼠被放置在一个透明的塑料圆顶金属网层近30分钟。电子·冯·弗雷灯丝组有一个校准范围的弯曲力(浮动1 ~ 90 g)自动记录疼痛阈值。单个纤维应用于足底表面5倍的interstimulation间隔5秒。积极的回应被定义为至少1明显戒断反应5应用程序。舔爪子也被视为一个积极的回应。

定量评估的热阈值后爪,老鼠被放置在玻璃表面热试验装置与驯化前30分钟测试。手机辐射热源(哈格里夫斯装置)坐落在玻璃都集中到每个每个大鼠后爪。辐射热源是单独应用于中间的后爪长达60秒,用爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)测量。升温速率增加30°C到58°C / 60秒以一致的方式在每个场合(26]。30秒的截止是用来防止潜在的组织损伤。爪子被检查之前和之后的热测试,以确保没有出现热损伤的证据。的延迟撤军后连续三个试验的爪子是平均值,平均值是用作热阈值。有15分钟的间隔之间的试验。

2.4。免疫印迹分析

行为评估完成后,老鼠然后深深与戊巴比妥钠麻醉(65毫克/公斤),和腰(L3 L5)部分脊髓和脑额叶前部皮层的迅速切除,在液态氮冷冻。组织均质使用裂解缓冲,用近,离心机在12000 g 20分钟在4°C。蛋白质的浓度是由牛血清白蛋白量化和测量与考马斯亮蓝的吸收分光光度计。此后,样本冻结在-20°C,供以后使用。蛋白质是由标准所描述的西方墨点法评估(27]。简而言之,相同数量的蛋白质被sds - page分离和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF微孔,贝德福德,妈,美国)。细胞膜被封锁在5%脱脂奶粉稀释Tris-Buffered盐水Tween-20 (TBST)(氯化钠更易/ L: Tris-HCl 20日150年,pH值7.5,0.1%渐变20)在室温1小时(h),然后用抗体对肿瘤坏死因子-αil - 6,(英国Abcam)趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4(美国σ)一夜之间在4°C。广泛的洗涤后,膜与二次孵化辣根peroxidase-conjugated anti-mouse或anti-rabbit抗体(稀释1:2000;英国Amersham生物科学)。免疫印迹是可视化使用增强化学发光检测系统(Amersham淀粉微球的生物技术,乌普萨拉,瑞典)。蛋白质乐队由止动剂观察西方化学发光合衬底(美国微孔),然后由灰色处理扫描使用ImageJ(美国国立卫生研究院)。所有目标蛋白质被规范化β微管蛋白和计算比例的控制。

2.5。血浆肿瘤坏死因子-α、il - 6、SOD-1 SOD-2、MDA和15-F2t-Isoprostane测量

血液样本提取大鼠的心脏。血浆样本立即离心分离的3000 rpm 15分钟在4°C,然后分为整除和储存在−80°C的后续分析。血浆肿瘤坏死因子-α、il - 6、SOD-1 SOD-2、MDA和15-F2t-Isoprostane活动检测使用商用设备(开曼化学)如前所述23,28,29日]。

2.6。统计分析

所有的值了 。单向方差分析(方差分析)是用于统计分析(GraphPad软件,Inc .)获得的数据在同一组和组之间,分别,紧随其后的是图基组的多个测试比较的意思。值小于0.05被认为是表明统计上显著的差异。

3所示。结果

3.1。一般特征

基线体重和血糖没有显著差异的三个实验老鼠中组(数据未显示)。如图2,STZ-injected老鼠明显糖尿病高血糖症状和减肥。糖尿病大鼠的血糖水平增加但他们的体重减少与正常大鼠相比( ,D和C)。NAC治疗三周没有显著影响体重和血糖在糖尿病大鼠( ,D + N和D)。

3.2。影响的防治治疗在糖尿病大鼠行为参数

基线值的爪子撤军延迟(PWL)和爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)进行三组大鼠,并控制和糖尿病组之间无显著差异存在。

佩恩表的编制者的值都显著降低糖尿病组4周的糖尿病患者比对照组( ,图3(一个))。在4周注射STZ后,政府的南汽减毒机械痛觉过敏(^& ,图3(一个))。

显著降低糖尿病大鼠4周观察PWL比对照组( ,图3 (b))。在4周注射STZ后,政府的南汽减毒热痛觉过敏(^& ,图3 (b))。

3.3。防治治疗对肿瘤坏死因子的影响α和il - 6蛋白表达在糖尿病大鼠的脊髓和前额叶皮层

如图4,在TNF -显著增加α观察和il - 6与非糖尿病患者相比,糖尿病大鼠大鼠脊髓和前额叶皮层( ,D和C)。NAC治疗显著降低proinflammation TNF -α和il - 6水平与糖尿病大鼠(^& ,D + N和D)。

3.4。影响治疗趋化因子受体CXCR4的防治作用和p-CXCR4蛋白表达在糖尿病大鼠的脊髓和前额叶皮层

如图5,显著增加趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4观察糖尿病大鼠相比,非糖尿病的大鼠脊髓和前额叶皮层( ,D和C)。NAC治疗进一步显著增加趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4水平相比在糖尿病大鼠(^& ,D + N和D)。

3.5。影响血浆il - 6和TNF -治疗的防治作用α水平的糖尿病大鼠

如图6显著增加,血浆il - 6和TNF -α观察糖尿病大鼠比非糖尿病的大鼠( ,D和C)。NAC治疗显著降低血浆il - 6和TNF -α水平相比,糖尿病大鼠(^& ,D + N和D)。

3.6。防治治疗对等离子体的影响SOD-1 SOD-2, MDA, 15-F2t-Isoprostane糖尿病大鼠的水平

如图7,显著增加等离子SOD-1 SOD-2 MDA, 15-F2t-Isoprostane观察糖尿病大鼠相比,非糖尿病的大鼠( ,D和C), NAC治疗显著降低血浆SOD-1 SOD-2, MDA, 15-F2t-Isoprostane相比在糖尿病大鼠(^& ,D + N和D)。

4所示。讨论

在目前的研究中,首先,我们发现建立后的痛阈显著降低糖尿病。此外,肿瘤坏死因子-促炎的蛋白质α和il - 6显著调节脊髓中,皮层和等离子体。在糖尿病大鼠血浆SOD-1和SOD-2活动也显著增加相比控制老鼠。趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4表达显著增加脊髓和大脑皮层。第三,NAC治疗能提高痛阈,与此同时,下调TNF的表达α和il - 6,上调趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4表达,而糖尿病大鼠。

STZ损害β在胰腺细胞,静脉注射STZ的剂量65毫克/公斤可靠和可重复诱导1型糖尿病大鼠(30.,31日]。高血糖诱导增加生产活性氧(ROS),导致神经损伤32]。过度的氧化应激和过载的Ca^{(2 +)}神经性疼痛的条目是常见的特征。在全细胞膜片钳实验中,TRPM₂电流在DRG与STZ诱导糖尿病后被封闭的H₂O₂和H₂O₂全身TRPM2闸门完全被NAC (33]。南汽可能对氧化应激保护作用和钙流入TRPM通过监管₂频道糖尿病神经元。一项研究表明,南汽,成立后的糖尿病,可能提供预防中风的风险通过增强血小板谷胱甘肽和GSH-dependent甲基乙二醛消除和SOD-134]。九十例DNP完成了八周的研究中,结果表明,NAC显著提高血清SOD水平,谷胱甘肽过氧化物酶1和缓解痛苦的糖尿病神经病变的症状35]。

我们目前的研究发现,等离子体SOD-1 SOD-2活动增加糖尿病大鼠比非糖尿病的老鼠。这些可能的后果高血糖诱导氧化应激系统的过度反应(SOD-1和SOD-2)作为补充的反应与氧化应激,DNP的关键机制之一。NAC提高痛阈,与此同时,南汽的抗氧化治疗的有效性可能减弱补偿增加SOD的活动。NAC抗氧化剂治疗的有效性也可能是主要的机制,导致超表达的趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4脊髓和大脑皮层。

在高血糖状态,各隔间氧化酶类,包括内皮,媒体,和动脉外膜,产生活性氧,使血管平滑肌细胞(VSMCs)氧化应激(36]。氧化应激可能伤害VSMC或扰乱监管信号诱导炎症因素的upregulation [37]。我们先前的研究发现,il - 6和TNF -α增加血浆及心肌STZ-induced糖尿病大鼠(38]。糖尿病肾病患者(DKD)显示更高的il - 6和TNF -α水平比那些没有DKD [39]。il - 6和TNF -的水平α在肝脏40)和脊髓(41I型糖尿病的老鼠也增加正常大鼠的相比。在我们目前的实验是一个重要的发现,il - 6和TNF -α显著增加不仅在脊髓和等离子体还在大脑皮层。这表明,周边的炎症反应在一起导致了DNP和中央系统。

在我们的研究中,NAC显著衰减增加il - 6和TNF -α水平在糖尿病大鼠脊髓,皮层和等离子体。在诊所,NAC是有效改善神经性疼痛与糖尿病神经病变(35]。这进一步证明了DNP的重要机制,高血糖产生过多的活性氧与后续存在强烈的氧化应激,诱发急性炎症反应。

趋化因子受体CXCR4是一个G protein-coupled受体,参与导航和趋化性造血和免疫系统。趋化因子受体CXCR4的配体是基质细胞衍生因子(SDF) 1 / CXCL12与干细胞从骨髓迁移细胞表达SDF-1 [42]。鞘内管理SDF-1天真的大鼠诱发过敏。反复鞘内政府趋化因子受体CXCR4的拮抗剂,AMD3100,显著抑制神经性疼痛的开始和持续时间11,43]。SDF-1 / CXCR4信号还维护中央卒中后疼痛(44)和持续的腹痛与慢性胰腺炎大鼠(45]。SDF-1 / CXCR4信号导致骨癌疼痛[46和糖尿病神经性疼痛15,47]。

在我们的研究中,趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4受体表达显著增加在糖尿病大鼠脊髓和大脑皮层。这表明,趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4过度可能导致DNP的发展缺乏抗氧化治疗。然而,我们的研究发现特别有趣的是,NAC治疗缓解DNP但进一步增加趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4蛋白表达在脊髓和大脑皮层。这个结果似乎相互矛盾的报道什么趋化因子受体CXCR4在痛苦中发展的有害作用。值得注意的是,然而,在趋化因子受体,趋化因子受体CXCR4脱颖而出的多向性的作用以及其参与正常与异常发展,包括免疫疾病,病毒感染和癌症48]。SDF-1可以激活CXCR4-expressing细胞并诱导B细胞增殖和T细胞招聘。趋化因子受体CXCR4^−−/老鼠显示各器官受损的血管化,包括肠、胃和心脏(49]。使用基因敲除小鼠的研究揭示了CXCR4参与cardiogenesis和大脑发育。没有趋化因子受体CXCR4,纯合子基因敲除小鼠在出生之前死去。在体内研究中,CXCR4-overexpressing msc与减少观察视网膜损伤和upregulation视紫红质和了无蛋白质的差别,对这些炎性细胞因子il - 6和TNF -α(50]。因此,趋化因子受体CXCR4是正常发展的关键分子。

在前列腺癌的一项研究表明,活性氧积累细胞株产生的激活NADPH氧化酶(NOX)家族的酶。由SDF-1 NOX2回应和监管α/ CXCR4信号轴(51]。老鼠接受NAC呈现显著激活氧化酶和SOD与水晶silica-induced小鼠肺纤维化的差别,同时对这些酶氧化(SOD-2 NOX2,进气阀打开,XO) (52]。在我们的研究中,三个星期的1.5 g / kg NAC水处理减少氧化应激。NAC治疗可能的差别可能导致对这些NOX2减少氧化应激,因此upregulation的趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4表达。因此,它是有趣的假设增加趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4表达可能代表的主要机制之一,南汽变弱DNP,虽然这个假设需要进一步测试。

有临床研究结果显示有益增强趋化因子受体CXCR4在糖尿病患者的影响。糖尿病足溃疡(DFU)是最常见的糖尿病周围神经病变患者和血管病以及足部畸形。糖尿病足早期性能主要是脚冷,麻木等异常感觉,后来会出现感觉下降或丧失。研究表明SDF-1趋化因子受体CXCR4的特定配体,显著降低循环和组织切片的二型糖尿病患者和感染DFU [53]。内容和蛋白质SDF-1的表达α/ CXCR4蛋白表达在伤口组织的糖尿病DFU患者接受了8周治疗中国软膏(Xiaodu Yuji粘贴)都明显高于对照组,同时改善血管再生和伤口愈合54]。因此,我们推测,趋化因子受体CXCR4表达的增加和p-CXCR4在糖尿病的早期阶段在我们当前的研究(例如,4周后STZ诱导)保护血管,但同时可能会导致不正常的神经传导,最终导致疼痛阈值的降低。另一项研究表明,在趋化因子受体CXCR4表达降低与年龄有关的BM MSC损害造血利基与增加活性氧的生产活动,推动一个HSC衰老表型。因此,调制SDF-1 / CXCR4轴在MSC N-acetyl-L-cysteine (NAC)可能改善他们的利基支持活动和减弱公司衰老表型(55]。SDF-1 /趋化因子受体CXCR4在疼痛传导通路中发挥着重要作用。因此,我们推测,痛觉过敏引起的增加表达的趋化因子受体CXCR4在糖尿病的早期阶段是一种保护机制。趋化因子受体CXCR4抑制剂AMD3100减轻痛觉过敏通过减少疼痛传输通路。南京,是一种抗氧化剂,进一步增加趋化因子受体CXCR4的表达,通过保护途径缓解痛觉过敏。趋化因子受体CXCR4的确切机制在糖尿病神经性疼痛的发展值得进一步深入研究。

总之,在我们目前的实验设置,增强的趋化因子受体CXCR4和p-CXCR4 NAC治疗与DNP的衰减。这个有趣的发现值得进一步的研究来阐明趋化因子受体CXCR4的角色发展的一般在DNP特别痛。

数据可用性

研究数据将根据要求提供相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

茜茜李、李Xuying贡献同样在这个研究。

确认

本研究支持部分由海南省重点项目(ZDYF2018126)和RGC /平授予香港。