他克莫司保护足细胞从细胞凋亡的差别,通过对这些TRPC6在糖尿病肾病

文摘

足突细胞损伤起着重要的作用在糖尿病肾病(DN),和细胞凋亡是其机制之一。瞬时受体电位通道6 (TRPC6)表达在足细胞足突细胞损伤引起的调节血糖水平高。他克莫司是一种新型免疫抑制剂,据报道在足细胞保护起着重要的作用。本研究的目的是探讨他克莫司潜在的足细胞保护机制的2型糖尿病(T2DM)病人体内大鼠糖尿病模型和不灭的小鼠足细胞(MPC5)。透射电子显微镜是用来评估肾损伤形态。与吸收FK506治疗后,我们测量24小时尿albumin-to-creatinine比率和肌酐清除率率以及主要生化参数如葡萄糖、胰岛素、血清肌酐、尿素氮、总胆固醇、甘油三酯,丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶。Nephrin TRPC6蛋白质表达和足突细胞凋亡率在活的有机体内和在体外使用免疫组织化学染色法测定,TUNEL分析,流式细胞术,分别。免疫印迹是用来测量表达cleaved-caspase-3和伯灵顿/ bcl - 2。暴露于高葡萄糖(HG), DM大鼠表现出破坏生化条件和足突细胞结构受损。TRPC6 nephrin和增加表达的表达减少,cleaved-caspase-3,和伯灵顿/ bcl - 2比率在足细胞被发现,连同凋亡比例较高,而他克莫司干预中和HG对足细胞的影响。我们的研究结果表明,他克莫司保护足细胞在2型糖尿病肾病的进展,可能改善足细胞凋亡的表达下调TRPC6的表达。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是一种最常见和严重的微血管并发症有糖尿病(DM);的一个主要原因是终末期肾病(ESRD) [1,2]。大约30% - -40%的糖尿病患者患肾脏疾病(3,4]。目前,DN是吸引了研究者的注意,因为越来越多的新的诊断以及治疗的难度,这两种社会经济压力强加给全球卫生保健系统。然而,对DN发病机制,可能与遗传因素有关,葡萄糖和脂质代谢异常、氧化应激、免疫反应,足细胞损伤,和其他因素。足细胞损伤是公认的一个重要特征DN导致蛋白尿。

肾小球足细胞终末分化内脏细胞,肾小球滤过屏障的重要组成部分(GFB),拥有有限的再生概率(5]。刺激的高糖,高脂肪,和各种细胞因子驱动足细胞损伤。证据显示足细胞损伤之间的密切关系,蛋白尿、和进步肾小球硬化症,这表明足细胞损伤在DN中扮演着重要角色6]。足突细胞损伤包括改变形态或足细胞的数量。足细胞是由几个部分组成:胞体,主要流程和二、三级脚过程(FPs)。相邻帧由专门的细胞连接结被称为狭缝横隔膜(SDs), nephrin, podocin和瞬时受体电位通道(TRPC)共存7]。任何异常的细胞骨架或SD会导致FP融合,导致GFB功能丧失和蛋白尿。Susztak et al。8]表明,细胞死亡导致足细胞损失DN。然而,细胞凋亡被描述为主要机制足细胞死于糖尿病和其他进步的肾小球疾病(9- - - - - -12]。足细胞暴露于高葡萄糖水平可能增加活性氧(ROS),导致细胞凋亡的激活MAPK和caspase-3家庭。

瞬时受体电位阳离子通道6 SDs (TRPC6)是一个重要的组成部分,位于足膜。大量的数据表明TRPC6承诺因素足突细胞消耗的各种疾病(13]。首先,功能的突变TRPC6与家族性发病有关形式的局灶性节段性肾小球硬化症;此外,过度或过度活跃的野生型TRPC6足以导致其他肾脏疾病(14- - - - - -16]。然而,既增加了TRPC6通道表达和活动推动高水平的Ca^{2 +}足细胞的大量涌入,最终导致亏损。最近的证据表明,TRPC6在DN的发展有重要的作用。似乎有TRPC6和足细胞损伤之间的关系。血管紧张素ⅱ、活性氧和其他因素发生在DN的设置可能刺激显著增加钙通过TRPC6渠道涌入,导致足细胞损伤(17]。

钙调磷酸酶抑制剂他克莫司(吸收FK506)等(cni)小说潜在的免疫抑制药物,广泛用于antiallograft拒绝在器官移植和各种免疫系统疾病的治疗。公司减少细胞因子的生产通过抑制核转录因子的激活T细胞(NFAT)。有证据表明,免疫功能紊乱的发病机制中扮演着重要的角色多种肾脏疾病,包括几种类型的肾病综合症引起的t细胞功能的失调。公司可能通过抑制NFAT保护足细胞激活,负责蛋白尿和肾小球硬化症18]。肾脏疾病:改善全球的结果(KDIGO) 2012年肾小球肾炎临床实践指南建议,公司应该被用于治疗特发性膜性肾病(IMN) [19]。他克莫司结合糖皮质激素和他克莫司单一疗法都有效的治疗IMN、24小时尿蛋白排泄明显减少,血清白蛋白增加,肾小球滤过率(eGFR) [20.,21]。若松等人表明,吸收FK506显著改善蛋白尿的antinephrin antibody-induced肾病大鼠模型(22]。

而足细胞损伤导致增加尿蛋白排泄和吸收FK506减少足细胞损伤,机制尚不清楚,可能有改善podocyte-specific表达的蛋白质如nephrin和podocin [23足突细胞epithelial-mesenchymal]或抑制过渡(EMT) [24]。我们以前的研究表明,吸收FK506保护DN足细胞通过上调自噬(25和表达下调氧化应激26]。然而,很少有研究对吸收FK506和足突细胞凋亡在DN。因此,在这项研究中,我们关注吸收FK506对足细胞的影响在活的有机体内和在体外。我们旨在确定吸收FK506足细胞的保护,如果是这样的话,它是如何实现这种效果,以及是否吸收FK506可以减少足细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。动物

八周大的男性纯种SPF老鼠(体重250 - 280克,由青岛动物实验中心,提供证书号SCXK(陆)20080010)被安置在单个笼子在温控房间( °C,相对湿度45 - 65%)和免费的食物和水在12 h光/暗周期。建立2型糖尿病模型大鼠喂食高热量饮食(10%的动物脂肪、20%蔗糖、2.5%胆固醇、胆盐1%,和66.5%的普通chow),如前所述[27- - - - - -29日]。8周后,大鼠喂食高热量饮食的腹腔内注射低剂量链脲霉素(30毫克/公斤,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。我们使用胰岛素敏感性指数(ISI) ( ,HOMA方法)确定2型糖尿病模型成立。

老鼠喂食高热量的饮食和腹腔内注射链脲霉素上面提到的被分为糖尿病组(糖尿病, )和颗组(吸收FK506, )。我们还建立了NC组(正常的控制, )。胃强饲法吸收FK506(0.5毫克/(公斤·d),阿斯特拉爱尔兰有限公司有限公司)吸收FK506集团或等于柠檬酸缓冲溶液的体积数控和DM组8周每天服用一次,和所有的老鼠有一个正常的热量的饮食。然后,身体重量(受虐妇女综合症)记录,收集尿液样本。随后,老鼠牺牲收集血液样本和肾脏。实验伦理委员会批准的协议是青岛大学附属医院(QYFYWZLL号25660)。

2.2。细胞培养

有条件地永生的小鼠足细胞(MPC5)培养如前所述[30.]。细胞培养growth-permissive条件下在33°C公司为5%₂rpmi - 1640年媒介(美国Hyclone)补充10%胎牛血清(Hyclone), 10 U /毫升鼠标移行细胞重组(IFN -γ;PeproTech美国)和100 U /毫升青霉素+ 100毫克/毫升链霉素(σ)。诱导分化,足细胞在非许可的条件下保持在37°C缺乏干扰素-γ至少2周,然后被用于实验。血清饥饿24小时后,分化足细胞被分为四组:NG组(正常的葡萄糖,5.5更易/ L), HG组(高葡萄糖,30更易/ L), HM集团( 25更易/ L), FK组(队 5μg / mL)。48小时后,表达水平nephrin, cleaved-caspase-3和伯灵顿/ bcl - 2蛋白测定使用免疫组织化学染色和免疫印迹分析。

2.3。生化参数的测量

血清胰岛素水平测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(水生诊断有限公司&格拉斯哥,苏格兰)。空腹血糖(FBG)、血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平测定使用7020生化分析仪(日立公司(Hitachi Ltd .)、东京、日本)的临床实验室,青岛大学的附属医院。白细胞的计数血液样本测量使用血细胞分析仪(撞击医疗,中国)。所有生化参数进行8周后吸收FK506的政府。

2.4。测定尿白蛋白肌酐浓度

测定尿白蛋白(年度)和肌酸酐(加州)的浓度,24小时尿液样本收集之前和8周后吸收FK506管理局。UAL排泄测量使用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(水生诊断有限公司&格拉斯哥,苏格兰)。sUcr水平测量使用一个自动生物化学分析仪(日立公司(Hitachi Ltd .)、东京、日本)。24小时尿albumin-to-creatinine (uACR)和肌酐清除率(Ccr)然后计算( , :毫升/ 24小时,24小时尿)。

2.5。无创血压测量

血压测量使用tail-cuff方法(美国DSL LE5002)休息,有意识的条件(23°C)专用房间。收缩压(SBP)连续测量5次,和五个读数的平均值被记录。

2.6。光和透射电子显微镜

体重和大规模的左肾重牺牲,之前和之后分别。肾脏肥大指数计算了肾质量的比值(公里)体重(BM)。肾脏是收获和10%多聚甲醛固定,脱水,嵌在石蜡中。薄片的组织创建hematoxylin-eosin(他),周期性acid-Schiff基地(PAS),和马森的三色的染色。病理变化使用光学显微镜检查。

肾标本固定在2.5%戊二醛,然后脱水。使用铀酰柠檬酸acetate-lead染色后,肾皮质的形态特征部分(50 nm),包括“绿带运动”的厚度和足细胞的条件使用透射电子显微镜测量。肾标本拍摄使用jem - 1200透射电子显微镜(日本东京Jeol有限公司)。足突融合率(玻璃钢)计算 ,在哪里是脚足突细胞融合过程的总长度吗的总长度是外周毛细血管基底膜。

2.7。免疫组织化学染色Nephrin TRPC6

Deparaffinized部分沾主要抗体,具体来说,rabbit-anti-rat nephrin抗体(1:200)。TRPC6,幻灯片孵化与山羊anti-TRPC6抗体1:500一夜之间在4°C,然后与生物素化的二次抗体(1:1000)。所有抗体都购自圣克鲁斯生物技术,Inc .(圣克鲁斯、钙、美国)。颜色是由孵化与diaminobenzidine(圣克鲁斯生物技术有限公司),用苏木精复染色。半定量的免疫组织化学分析得分如下:0,缺席或染色较弱;1, ;2、染色面积在25 - 50%之间;3、染色面积在50 - 75%之间;4, 。十个肾小球随机检查每张幻灯片来计算平均积分值。

2.8。免疫印迹

细胞和均质肾皮质组织细胞溶解在寒冷的细胞裂解缓冲蛋白酶和磷酸酶抑制剂。蛋白质分离10% sds - page凝胶(10%的分离胶,6%的浓缩胶),随后electroblotted到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。非特异性抗体绑定被预培养在TBS包含5%的脱脂牛奶1 h在室温下;然后,膜与初级孵化抗体cleaved-caspase-3,伯灵顿,bcl - 2, glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)(1: 1000年,所有从Abcam)和TRPC6(1: 500 - 1: 4000年,兔子anti-rat,圣克鲁斯生物技术,Inc .)在一夜之间在4°C,然后孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(Abcam 1: 10000年,Inc .)。这些墨迹受到使用增强化学发光(ECL)系统(北京中山金桥生物技术有限公司,中国)。

2.9。测量细胞凋亡

终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验与原位细胞死亡检测设备(罗氏公司、德国)是用来确定肾小球内细胞凋亡后,制造商的协议。简单地说,肾组织在4%多聚甲醛固定,孵化与TUNEL反应混合物,然后跟着antifluorescein-POD共轭。细胞凋亡的程度估计使用基于规模意味着每100肾小球部分TUNEL-positive细胞的数量。

细胞凋亡在体外量化使用流式细胞术(FCM)细胞染色后的膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备我(BD PharMingen)。简单,细胞被洗两次冷PBS和resuspended绑定缓冲 细胞/毫升。然后,5μL (FITC膜联蛋白V和propidium碘(π)添加到100年μ在黑暗中L细胞悬浮液为15分钟。孵化后,混合物稀释了400μL绑定缓冲和分析BD Accuri C6流式细胞分析仪(BD生物科学)。

2.10。统计分析

数据表示为 。统计上显著的差异评估使用方差分析(ANOVA)。迷幻药的 - - - - - -测试是用于每两组之间的比较。所有统计分析使用商用统计软件包(SPSS 17.0)。值< 0.05显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。生化参数

水平的SBP CCr、光纤光栅和ISI DM和颗组明显高于数控组;然而,糖尿病和颗组之间没有显著差异(表1)。受虐妇女综合症和公里/ BM在DM大鼠明显高于数控老鼠。使用吸收FK506后,公里/ BM的糖尿病大鼠在统计学上低于DM组。此外,脂质代谢水平参数如TG、TC水平DM组显著高于数控组;然而,没有明显差异在未经治疗的糖尿病组和FK506-treated组之间。在AST水平没有明显差异,ALT,和吸收FK506治疗后白细胞计数,这表明剂量的吸收FK506对肝或骨髓功能没有影响。

3.2。24小时尿Albumin-to-Creatinine比(uACR)

DM组有更高的24小时uACR比NC组( vs。 , ),这种差异是由8周吸收FK506治疗抑制( vs。 , )(图1)。

3.3。足细胞的形态学变化

确定足细胞的形态学变化,我们使用透射电子显微镜。我们发现脚邻近足细胞的过程是互相交叉。没有足突融合,肾小球基底膜的厚度均匀的NC组(数字2(一个)和3(一个))。DM组,肾小球基底膜(GBM)弥漫性增厚,足突融合率也显著大于( vs。 , ,数据2 (b),3 (b),3 (d))。然而,吸收FK506的应用减少了脚过程率( vs。 , )和增厚率GBM也改善(数字2 (c),3 (c),3 (d))。

3.4。的分布和表达Nephrin和TRPC6

在肾组织免疫组织化学显示均匀性和线性分布nephrin少TRPC6 NC组中表达,在肾小球局部(数字4(一)和5(一个))。DM组,nephrin表达水平显著下降,显示不均匀性和非线性分布( ,图4 (b))和显著增加表达TRPC6 ( ,图5 (b))。治疗8周后,抑制nephrin表达式被吸收FK506治疗显著提高( ,数据4 (c)和4 (d))的情况下增加TRPC6表达式( ,数据5 (c)和5 (d))。

3.5。足细胞凋亡在活的有机体内

TUNEL分析进行识别足细胞凋亡体内。凋亡足细胞的计数显著更大比NC组(DM组 vs。 每个肾小球 ,数据6(一)和6 (b)),而吸收FK506足突细胞凋亡显著改善( vs。 每个肾小球 ,数据6 (c)和6 (d))。

3.6。吸收FK506对小鼠足细胞凋亡的影响

确定吸收FK506足细胞凋亡的影响,流式细胞术细胞凋亡进行了分析。我们发现,足细胞表现出在高glucose-treated足细胞凋亡比例显著高于在正常情况下(数字7(一)和7 (c))。吸收FK506治疗足突细胞凋亡明显减少(图7 (d))。

3.7。免疫印迹分析凋亡蛋白

bcl - 2表达cleaved-caspase-3和伯灵顿的比例代表反应细胞死亡信号和被认为是激活细胞凋亡的指标。糖尿病动物显示肾脏的表达的水平大大提高cleaved-caspase-3和伯灵顿/ bcl - 2比率比控制老鼠(数字8(一个)和8 (b))。吸收FK506政府有凋亡效应,因为它阻止diabetes-induced cleaved-caspase-3水平增加和伯灵顿/ bcl - 2的比率( ,数据8 (c)和8 (d))。在体外、高glucose-treated FK506-treated小鼠足细胞表现出相同的结果,而没有发现差异HM和NC组(图8 (e))。

4所示。讨论

这里我们报告我们最近发现吸收FK506在足细胞凋亡的保护作用在DN, TRPC6的差别可能与对这些。我们利用DN大鼠模型的基础上,高热量的饮食和腹腔注射链脲霉素。如表所示1和数字1,2和3,DM大鼠表现出受损的生化参数和足突细胞形态。cleaved-caspase-3 TRPC6表达的增加,伯灵顿/ bcl - 2,和更高的细胞凋亡率检测一起nephrin的表达下降。所有这些可以提高低剂量的吸收FK506治疗之后,更重要的是,没有显著影响白细胞计数和ALT和AST(表1)。

DN患病率和发病率的增加全球社会经济负担沉重的医疗系统在世界范围内,被血液透析的主要指标之一。出于这个原因,它已成为迫切需要阐明的底层机制DN发病机理,确定早期诊断和治疗新靶点。足细胞是至关重要的组件GFB,尤其是因为他们受伤后不能再生。他们的细胞凋亡和结构性破坏导致的破坏GFB顺向蛋白尿,两者都是决定性的DN的预后。

在DN足细胞损伤的机制仍不完全清楚。研究人员已经提出了几种机制,包括足突细胞肥大,epithelial-mesenchymal过渡(EMT),足突细胞分离和细胞凋亡31日]。有不同的DN和其他glomerulopathies podocentric治疗选项,如angiotensinconverting酶(ACE)抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂(ARB),糖皮质激素,参股,甚至利妥昔单抗(32]。细胞凋亡通路被广泛参与许多疾病,对细胞生长和分化的影响。一些证据表明,足细胞凋亡密切相关,蛋白尿在DN (33]。在目前的研究中,我们建立了一个2型DN (T2DN)大鼠模型,研究吸收FK506对足细胞的影响在活的有机体内和在体外治疗后8周。我们发现高24 h uACR和异常在糖尿病大鼠肾组织结构,包括肾小球肥大,脚融合过程,和增厚基底膜。我们还发现异常TRPC6足细胞的激活和高glucose-induced DM和HG组织细胞凋亡,以增加cleaved-caspase-3的表达水平和伯灵顿/ bcl - 2比率,同时吸收FK506减少足突细胞损伤的程度与DN和减毒TRPC6的表达水平升高与改善nephrin表达式。我们的研究结果与之前的研究一致,证明高葡萄糖刺激的作用,吸收FK506对足细胞(29日,34]。

吸收FK506,通常称为他克莫司是一种发酵产品隔绝链霉菌属。这是一个强有力的免疫抑制剂,类似于大环内酯物抗生素的化学结构。吸收FK506的钙调磷酸酶抑制剂干扰calcium-dependent信号通路,阻断T细胞的激活和增殖的抑制细胞因子的产生,如白介素2 (2)。它主要用于防止器官移植后免疫排斥反应。最近,吸收FK506和细胞凋亡之间的关系引起了越来越多的关注。神经学的一项研究发现,吸收FK506保护神经细胞凋亡而促进轴突再生和神经复苏脑弥漫性轴索损伤(DAI) (35),可能暗示治疗戴的新方法。吸收FK506在许多肾脏疾病也表现出凋亡效应。在狼疮肾炎(LN)和嘌呤霉素aminonucleoside——(PAN -)引起肾脏损害,政府吸收FK506后,足细胞凋亡明显减少和降低蛋白尿(36,37),减轻肾损伤。在此基础上,我们提出,吸收FK506在DN发挥抗凋亡作用。我们发现吸收FK506显著逆转cleaved-caspase-3水平标高和伯灵顿/ bcl - 2比率在DM大鼠足细胞暴露于高葡萄糖水平,以及促进nephrin表达式。TUNEL检测和FCM的结果表明,吸收FK506减少细胞凋亡以及TRPC6表达式在活的有机体内和在体外。这些结果表明,吸收FK506改善TRPC6和凋亡蛋白表达,从而保护足细胞的DN。

TRPC6渠道与糖尿病并发症的发展,如有关DN。最近的研究进一步提供了重要证据关于TRPC6在DN的进展;既有积极的和消极的结果(38]。足细胞的重要组成部分,overactivation TRPC6驱动器涌入的Ca^{2 +}足细胞,导致足细胞损伤和凋亡。可以是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶由Ca吗^{2 +}/钙调蛋白;调查表明,监管TRPC6表达式的血管紧张素ⅱ需要TRPC6-mediated Ca^{2 +}涌入的激活能和核转录因子激活T细胞(NFAT) [39]。在目前的研究中,我们发现显著降低TRPC6, cleaved-caspase-3,和伯灵顿/ bcl - 2比例,降低与钙调磷酸酶抑制剂吸收FK506治疗后细胞凋亡比例。

尽管吸收FK506凋亡的影响,需要进行进一步的研究来探索吸收FK506对足细胞凋亡的潜在机制。陆et al。40)发现,葡萄糖高表达水平升高TRPC6在培养足细胞和细胞内钙而不是TRPC6击倒足细胞。TRPC6-dependent Ca^{2 +}涌入了参与足细胞凋亡引起血糖水平高、小干扰rna干扰和TRPC6击倒钝化glucose-induced足细胞凋亡(41]。Nijenhuis等人表明,在高葡萄糖条件下,有一个有害的正反馈机制,血管紧张素ⅱ诱导可以/ NFAT途径取决于Ca^{2 +}反过来,通过TRPC6涌入,增强TRPC6[的表达39]。它也表明,异常激活钙调磷酸酶(可以)有助于促进细胞凋亡在DN (42]。作为抑制剂,能吸收FK506可以减少apoptotic-associated蛋白表达和/或改善的表达通过抑制凋亡分子可以在TRPC6及其积极的反馈作用。

在DN的动物模型中,吸收FK506恢复podocyte-specific蛋白质,nephrin, podocin,维护GFB的完整性,因此,导致减少蛋白尿(21]。免疫细胞的异常,包括T细胞、B细胞、巨噬细胞,部分占DN发病机制,吸收FK506被认为缓解局部浸润的淋巴细胞和巨噬细胞在肾组织中以及各种炎症介质由于其免疫抑制作用。

另一个重要的DN是自噬的机制。这是一个高度保守的lysosomal-dependent蛋白质降解过程,对各种细胞维持体内平衡至关重要(43]。对胰岛β细胞自噬可以帮助保护细胞功能正常或压力条件下(44]。证据表明抑制自噬在老鼠和病人的2型糖尿病(44- - - - - -47]。我们之前有研究表明自噬后显著调节吸收FK506对2型糖尿病大鼠的干预,从而保护足细胞(24]。网络数据分析表明,DN的发病机制涉及到几个分子,包括toll样受体、细胞因子受体相互作用,MAPK、TGF -β,Ca^{2 +}信号通路(48]。吸收FK506可能发挥其治疗效果通过几个目标,其中有些重叠,这里讨论的机制。

总之,我们的实验结果表明,吸收FK506保护足细胞在DN通过减少细胞凋亡,减轻蛋白尿,延缓肾功能恶化的发展;这些效应可能是通过降低TRPC6表达介导的,可能提供新概念的使用吸收FK506治疗DN。然而,应该注意的是,吸收FK506带有副作用如血糖水平升高,感染,和肝脏和肾脏毒性,这取决于剂量和个人的敏感性。0.5毫克/的数量(公斤·d)吸收FK506用于8周在目前的研究中对肝脏功能无显著影响(ALT, AST)和白细胞计数。然而,长期吸收FK506治疗DN的安全性仍然是有争议的,并且还需要进一步的研究来管理这些问题。

数据可用性

表和图的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

所有作者声明没有金融竞争的利益。

作者的贡献

YW和RM co-first作者参与的设计研究,导致数据分析和写作和修改的手稿以及数据采集。XW YX,纽约参与其设计和协调。RW,毫升,YZ收集数据并进行统计分析。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持的山东省自然科学基金(批准号2012 zrb01659)。

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