文摘

胰腺β细胞再生在活的有机体内为细胞替代疗法在糖尿病患者带来了福音,并发现相关的临床治疗策略将推动它向前临床应用。Liraglutide,一种广泛使用的抗糖尿病的glucagon-like peptide-1 (GLP-1)模拟,显示不同β-cell-protective影响2型糖尿病的动物。胰高血糖素受体(GCGR)单克隆抗体(mAb),临床前代理块胰高糖素途径,可以促进功能恢复β细胞在1型糖尿病小鼠。这里,我们进行了四周两种药物单独或结合的治疗1型糖尿病的老鼠。虽然liraglutide降低了血糖水平和血浆胰岛素水平增加,免疫染色显示liraglutide扩大β细胞通过自我复制质量,从前体细胞分化,分化转移胰腺α细胞β细胞。胰βGCGR马伯治疗后细胞大规模增加更重要,而联合治疗组没有进一步增加胰腺癌β单元格区域。然而,与GCGR马伯组相比,联合治疗降低了血浆胰高血糖素水平和增加的比例β细胞/α细胞。我们的研究评估liraglutide的影响,GCGR马伯单一疗法,或结合在血糖控制战略和胰岛β细胞再生,并为未来临床应用提供了有益的线索1型糖尿病。

1。介绍

胰腺β细胞功能障碍和细胞质量损失是一个关键病机在1型糖尿病(近年来)和2型糖尿病(T2D)。因此,很有必要保护β细胞功能和扩展β细胞对糖尿病治疗质量。Glucagon-like peptide-1——(GLP-1)基础治疗,包括GLP-1受体受体激动剂和dipeptidyl peptidase-4抑制剂,对胰腺有几个有益的影响β细胞,包括移植胰岛素基因转录和生物合成,增效分子胰岛素分泌和促进β细胞再生,促进β细胞增殖,抑制β细胞凋亡,诱导干细胞分化成β细胞(1]。最近的研究已经证明了这一点GLP-1过度或GLP-1受体受体激动剂晋升β细胞再生通过α-β-细胞分化转移(2- - - - - -4]。虽然在T2D GLP-1-based治疗显示了各种有利影响动物和人类,这些药物不能单独使用近年来治疗。GLP-1-based疗法是否也有类似的影响β细胞保护,特别是对β在近年来细胞再生,需要确定,治疗应结合GLP-1应评估。

REMD 2.59,一个完全竞争性拮抗胰高血糖素受体(GCGR)单克隆抗体(mAb),在近年来有很强的降糖效果和T2D啮齿动物和非人灵长类动物5,6]。一项随机临床试验显示,REMD 477,另一个有亲和力的GCGR马伯的GCGR相当于2.59 REMD,改善患者的血糖控制在近年没有严重副作用(7]。我们之前的研究表明,治疗GCGR马伯增加了β细胞质量通过促进α-β细胞转化(8]。然而,GCGR马伯大幅增加胰腺癌α细胞质量和血浆胰高血糖素水平。值得注意的是,GLP-1受体受体激动剂有抑制胰高血糖素分泌的能力。

在这项研究中,我们调查了可能影响liraglutide,常用GLP-1受体激动剂,β在近年来的老鼠细胞再生,评估与GCGR liraglutide马伯的综合效应。我们的研究为临床治疗提供了新的线索来维持葡萄糖体内平衡,促进胰腺β近年来患者的细胞再生。

2。材料和方法

2.1。动物和干预

所有的动物实验在北京大学健康科学中心(中国,北京)和机构批准的动物保健和使用委员会。八周大的雄性C57BL / 6 j小鼠(重要河流动物中心,北京,中国)被腹腔注射链脲霉素150毫克/公斤(STZ;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)柠檬酸缓冲(0.1 mol / L, pH值4.2)建立内转至模型。糖尿病条件确认如果空腹血糖11.1更易/ L或随机血糖是16.7更易与L至少两次。四个星期的治疗糖尿病动物腹腔liraglutide管理局(0.2毫克/公斤,每天两次;新生Nordish、丹麦)或REMD 2.59(人类GCGR马伯,5毫克/公斤,一周一次;REMD Biotherapeutics,打击士气、钙、美国)或组合的两个代理或生理盐水(控制)。

B6.Cg-Tg赫尔(Gcg-cre) 1 / Mmnc (cre表达胰脏α细胞谱系)和B6。Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato / J(当交叉cre recombinase-expressing应变,红色荧光蛋白(RFP)表达式是cre-expressing观察组织)老鼠交叉生成胰腺α细胞lineage-tracing小鼠,即glucagon-RFP老鼠。

每组有6 - 8只老鼠。糖尿病小鼠禁食8 h对空腹血糖的测量葡萄糖氧化酶法。特定的ELISA试剂盒用于检测胰岛素(微孔,圣查尔斯,密苏里州,美国)和胰高糖素(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。

2.2。免疫荧光染色

胰腺与10%福尔马林固定在一夜之间4°C和嵌入在石蜡,和5μ米厚的部分做好准备的话。孵化了部分主要抗体在一夜之间在4°C和二级抗体室温1 h,其次是洗涤和DAPI染色(1μg / mL, Sigma-Aldrich)。共焦荧光显微镜下图片被抓获(徕卡TCS SP8(徕卡微系统公司位于德国))。胰岛素和glucagon-positive细胞领域使用ImageJ软件进行了分析。

以下使用抗体和稀释:兔子antiglucagon(1: 800年,细胞信号技术,贝弗利,MA),鼠标antiglucagon(1: 400年,Sigma-Aldrich),鼠标anti-insulin(1: 800年,Sigma-Aldrich),鼠标antiproliferating细胞的核抗原(PCNA);1:400年,细胞信号技术)、兔anticytokeratin 19 (CK19;1:400年,Abcam), Alexa萤石594 -共轭AffiniPure山羊antimouse免疫球蛋白(H + L)(1: 800年,杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,PA), Alexa萤石488 -共轭AffiniPure山羊antirabbit免疫球蛋白(H + L)(1: 800年,杰克逊ImmunoResearch实验室),和Alexa萤石647 -共轭AffiniPure山羊anti-guinea猪免疫球蛋白(H + L)(1: 800年,杰克逊ImmunoResearch实验室)。

2.3。统计分析

数据表示为 由方差分析紧随其后的是两组之间的差异进行了分析事后Tukey-Kramer测试或学生的 - - - - - -测试(双尾)在适当的时候。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。统计分析了使用GraphPad Prism 8.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。

3所示。结果

3.1。Liraglutide和GCGR马伯治疗改善糖尿病内转至小鼠表型

与正常对照组相比,近年来的老鼠的体重明显降低,而血糖水平显示显示明显增加(数据1(一)- - - - - -1 (c))。无论是liraglutide还是GCGR马伯对身体重量(图有任何影响1(一))。Liraglutide本身并没有减少随机血糖(图1 (b)),而显示的趋势降低空腹血糖( ,图1 (c))。GCGR马伯显著降低了随机和空腹血糖水平(数据1 (b)和1 (c))。然而,GCGR马伯的组合和liraglutide (mAb +里拉)没有进一步降低血糖水平相比GCGR马伯组(数字1 (b)和1 (c))。

STZ治疗后,血浆胰岛素水平明显降低,血浆胰高血糖素水平比正常控制略有增加。Liraglutide并不影响胰岛素水平或胰高血糖素水平(数字1 (d)和1 (e))。GCGR马伯治疗显著地调节血浆胰岛素水平和胰高血糖素水平与汽车相比治疗在近年来的老鼠(数字1 (d)和1 (e))。马伯+里拉组合没有增加血浆胰岛素水平相比,马伯单独治疗(图1 (d))。值得注意的是,联合治疗组的胰高血糖素水平显著降低,当的价格相比GCGR马伯集团(图1 (d))。

3.2。Liraglutide和GCGR马伯治疗增加胰腺β细胞内转至小鼠在不同程度的领域

胰岛细胞的组织学分析是由使用double-labeled免疫荧光染色。STZ显著降低整个小岛面积,不到1/3的正常水平控制( vs。 ,数据2(一个)和2 (b))。STZ明显减少了β单元格区域( vs。 ,图2 (c)),增加了α细胞质量( vs。 ,图2 (d)与正常相比)控制。Liraglutide治疗胰岛总面积(图并没有改变2 (b)),但liraglutide增加了β单元格区域( vs。 ,图2 (c))和减少α单元格区域( vs。 ,图2 (d)),因此有增加的趋势β/α细胞面积比例与汽车相比近年来集团(图2 (e))。GCGR马伯治疗增加胰岛总面积(图2 (b)),增加β单元格区域( vs。 ,图2 (c)),α单元格区域( vs。 ,图2 (d)),β/α细胞面积比例与汽车相比近年来集团(图2 (e))。类似于GCGR马伯治疗,mAb +里拉组合也大大增加了胰岛总面积与汽车相比近年来集团( vs。 ,图2 (e)),但与马伯组没有区别。马伯+里拉组合增加了α细胞面积相比,汽车近年来集团( vs。 ,图2 (d)),而减少α细胞面积相比,mAb组。因此,马伯+里拉组合增加了β/α细胞面积比例显著( vs。 ,图2 (e))。

3.3。Liraglutide和GCGR马伯治疗促进β在近年来细胞自我复制小鼠

如上所示,liraglutide和GCGR马伯增加了β单元格区域。随后,我们试图确定新生胰岛细胞的来源。我们执行costaining检测胰腺胰岛素和PCNA的部分β细胞增殖。我们发现,PCNA的比例⁺胰岛素⁺细胞增殖的β细胞)在liraglutide高集团和马伯+里拉集团汽车组相比,虽然比例GCGR马伯组与其他组(数据没有显示差异3(一个)和3 (d))。

3.4。Liraglutide诱发Duct-Derivedβ在近年来的老鼠细胞新生

新生的前体细胞的恢复是一个重要的方法β电池质量。胰腺前体细胞通常是附近或成人胰腺导管内。我们之前的研究已经证明,GCGR马伯可以诱导胰腺duct-derivedα细胞再生,而不是β细胞再生,内转至小鼠8]。在这项研究中,我们costained胰岛素与胰管或胰高血糖素标记CK19评估细胞新生。结果表明,liraglutide组或马伯+里拉集团glucagon-positive细胞或insulin-positive细胞可能会出现相邻CK19, duct-derived的暗示α细胞或β细胞再生(图3 (b)和3 (c))。然而,胰高糖素或insulin-positive细胞位于导管是罕见的,所以我们不执行进一步量化。

3.5。Liraglutide和GCGR马伯治疗诱导α-β细胞分化转移在近年来的老鼠

评估α-β细胞分化转移,我们首先进行胰高血糖素和胰岛素免疫染色的两倍。与STZ组相比,胰高糖素的比例⁺胰岛素⁺细胞被liraglutide提高治疗( vs。 , )(数据4(一)和4 (c))。接下来,我们建立了胰腺癌α细胞lineage-tracing (glucagon-RFP)老鼠。结果表明,RFP的比例⁺胰岛素⁺细胞liraglutide治疗组显著高于STZ组( vs。 , )(数据4 (b)和4 (d))证实,一些新生β细胞来源于胰腺的分化转移α细胞。GCGR马伯可以促进α-β细胞分化转化,由胰高糖素比例的增加表示⁺胰岛素⁺细胞( vs。 , ),这是符合我们以前的报告(8]。值得注意的是,胰高糖素的比例⁺胰岛素⁺细胞马伯+里拉组合组甚至高于liraglutide集团( vs。 , )。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,GLP-1受体激动剂liraglutide增加胰腺β老鼠细胞质量近年来通过自我复制,从前体细胞分化,分化转移胰腺α来β细胞。尽管liraglutide和GCGR马伯并未证明葡萄糖水平和显著的协同效应β细胞面积、GCGR马伯的刺激效应α细胞面积和胰高糖素分泌的功能得到了缓解。有趣的是,分化转移胰腺α来β细胞也提高了组合组。的组合战略GLP-1与胰高血糖素受体激活堵塞在近年来环境可能是有益的,具有良好的血糖控制,β细胞再生,并不是很高胰高血糖素水平。

当前的治疗近年来是有限的,它是高度需要评估新的非传统治疗血糖控制,甚至β在近年来细胞再生。对胰腺GLP-1受体受体激动剂有各种有益的影响β细胞,包括促进β细胞再生(9,10]。然而,大多数T2D模型中得到的结论。我们目前的研究显示GLP-1受体激动剂liraglutide增加了胰腺癌β细胞面积STZ-induced内转至老鼠。此外,我们发现liraglutide不仅促进了现有胰腺的扩散β在管道衬里细胞,诱导细胞转化为胰岛细胞,但也推动了α细胞向insulin-positive transdifferentiate细胞。这样,我们确认以上参与liraglutide-induced来源β细胞更新。然而,liraglutide不能减少内转至小鼠的血糖。GLP-1-based疗法不能单独使用近年来治疗,以及结合其他药物是必要的。

我们之前的研究中,与他人一起,证明,GCGR堵塞可以降低血糖,改善内转至小鼠的表型。引人注目的是,GCGR马伯增加胰腺的数量β通过诱导细胞和调节循环胰岛素水平α-β细胞分化转移在近年来的老鼠8,11]。然而,GCGR马伯大幅增加胰腺癌α细胞质量,带来的安全问题α肿瘤细胞(12]。值得注意的是,GLP-1受体受体激动剂有抑制胰高血糖素分泌的能力和诱导α-β细胞分化转移。在这项研究中,我们试图评估GCGR马伯的协同效应和liraglutide内转至老鼠。虽然并没有显示出明显的优势组合在降低血糖或增加β细胞的质量,在联合治疗组血浆胰高血糖素水平显著降低,α细胞面积呈下降的趋势。总胰β细胞面积没有提升liraglutide结合GCGR马伯的进一步治疗后;因此,我们推测这两种药物在促进机制β细胞再生可能是相似的。

然而,我们的研究有一定的局限性。首先,我们没有探索潜在的分子机制。第二,precursor-specific lineage-tracing老鼠所需验证的干细胞β细胞。

总之,我们现在的研究评估的协同效应glp - 1在内转至受体激活和GCGR对抗老鼠。尽管我们没有发现更好的血糖控制β细胞再生,我们发现liraglutide GCGR马伯可以促进的组合α-β细胞分化转移,从而衰减GCGR mAb-inducedα细胞增生和hyperglucagonemia。我们的研究可能为近年来的临床治疗提供有益的线索。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

本文的作者都没有任何财务或个人关系与他人或组织可能影响(偏见)的研究结果。不存在利益冲突,这项研究的作者。

作者的贡献

低速齿轮和美国设计研究;低速齿轮,T.W., and X.C. performed the research; J.Y., K.Y., and R.W. analyzed the data; L.G. and D.W. wrote the manuscript; and J.Y., R.W., and T.H. revised the paper.

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81830022、81830022和81830022),北京市自然科学基金(7192225)和中国博士后科学基金会(2019 m660369)。我们感谢海燕(REMD Biotherapeutics,贝CA,美国)REMD2.59的礼物。