文摘
虽然在小胶质细胞形态变化与糖尿病视网膜病变已报告,对小胶质细胞和巨噬细胞早期变化在这种情况的恶化。本研究旨在描述视网膜小胶质激活在实验性糖尿病视网膜病变的早期阶段。为此,糖尿病性视网膜病变的模型是通过男性Sprague-Dawley大鼠腹腔注射链脲霉素生成。没有观察到明显的组织学变化在实验性糖尿病视网膜病变的早期阶段。然而,在糖尿病的发病4到16周后,糖尿病患者的视网膜小胶质细胞的老鼠表现出更高的密度比与正常对照组,与小胶质密度达到12周。特别是,活化的小胶质细胞的比例在糖尿病大鼠显著增加,特别是在神经纤维和神经节细胞层,而减少在12周内内网状层。此外,居民糖尿病视网膜小胶质细胞被激活后立即感应,12周时达到高峰,发病后长达16周。因此,实验性糖尿病视网膜病变导致逐渐缺氧和神经炎症,其次是激活的小胶质细胞和巨噬细胞的迁移。视网膜小胶质激活的分布和密度变化与疾病的进展通常早期糖尿病大鼠。
1。介绍
糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病的主要并发症和致盲的重要原因之一,与疾病的严重影响劳动年龄人口在全球范围内(1,2]。微血管病变和炎症的发病机制的研究中扮演着重要的角色当前博士博士接受了药物治疗包括糖尿病黄斑水肿intravitreal antivascular内皮生长因子(VEGF)或类固醇(3,4]。他们是由intravitreal注入和稳定的不利影响VEGF在微血管增生和渗透率5]。
然而,有一个相当大的未满足的需要适当治疗的早期阶段博士在最近几年,许多研究人员专注于潜在药理博士的早期诊断和治疗的目标有些小分子核糖核酸(microrna)可以调节基因的表达和相关信号通路。·兰等人报道的几个microrna的表达失调糖尿病小鼠和展示他们的能力是有效的介质在相关的病理机制[博士6,7]。这些可以揭示miRNA-gene-pathways调制在博士和其它微血管疾病的早期阶段。
其他研究报告,病理变化中诱导视网膜神经血管单元前血管损伤(8,9]。此外,小胶质细胞被激活并发挥关键作用在视网膜神经胶质激活博士和神经损伤也被报道在博士的早期阶段。
许多研究表明,激活小胶质可以反映在神经炎症变化。在糖尿病大鼠小胶质细胞形态变化已报告发生在神经元细胞凋亡和激活的胶质细胞在视网膜上(10,11]。在模型的链脲霉素(STZ)诱发糖尿病,视网膜的表达Iba-1增加了约25% - -70%,有显著性差异观察糖尿病发病后2个月(12- - - - - -14]。视网膜小胶质密度可以显著提高糖尿病大鼠(四个月大15]。
博士虽然小胶质细胞的作用是普遍接受的,对小胶质细胞和巨噬细胞的变化在早期的发展博士在慢性缺血损伤;此外,时间的变化在糖尿病早期视网膜小胶质细胞并没有被报道。在目前的研究中,我们调查了小胶质激活和增生的早期实验博士,即。,before the induction of chronic ischemic damage—to obtain insights into the contribution of these phenomena to DR—using appropriate cell markers.
2。材料和方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley老鼠(8周大;重250 - 300克;东方生物有限公司,韩国京畿道Seongnam-si)被用于这项研究。动物被关在一个塑料笼在恒温实验室12 h光/暗周期。所有程序中执行研究涉及动物按照道德标准机构的动物保健和使用委员会(IACUC)和实验室动物学系(DOLA)天主教大学的朝鲜进行了研究。天主教大学的韩国Songeui校园认可韩国优秀动物实验室设备的韩国食品和药物管理局在2017年和获得的评估和认证实验动物保健协会(AAALAC)国际2018年完整的认证。
所有动物程序依法进行了实验动物福利法案,指导的护理和使用实验动物,和指导方针和政策为啮齿动物实验提供的IACUC医学院,韩国天主教大学(批准文号:和- 2019 - 0199 - 06)。这篇文章不包含任何研究与人类参与者由作者。
2.2。诱导的糖尿病
糖尿病(DM)的模型建立了一个STZ腹腔内注射(Sigma-Aldrich;60毫克/公斤体重)0.05米HCl-sodium柠檬酸缓冲溶液(pH值5.5)。的日子STZ注入被定义为第一天。动物们被安置在一个包含2%异氟烷氧毒气室。无意识时,动物被从美国商会,但是保留了麻醉面罩(1.5%异氟烷氧)。
血清葡萄糖测定使用自动从尾静脉Accu-Chek glucometer(美国罗氏诊断有限公司,印第安纳波利斯)糖尿病诱导后3天。当血清葡萄糖测量> 250 mg / dL 3天,DM的发展证实了,老鼠被用于进一步的实验。体重和血清葡萄糖水平DM感应后每周记录。
2.3。组织准备和组织学评价
眼球是无核的麻醉和zolazepam甲苯噻嗪在一个无菌的方式。地球仪的后半浸在4%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.4。整个视网膜解剖,沉浸在同样的固定剂2 h。固定后,视网膜沉浸在30%蔗糖,在液氮冷藏一夜,然后瞬间冷冻和储存在-70°C保存。Five-micrometer-thick部分被苏木精和伊红染色(他)。
2.4。免疫荧光染色
视网膜中央部分的部分被剪掉上象限和冲洗0.01磷酸盐(PBS), pH值7.4。彻底清洗后,视网膜部分嵌入在4%琼脂,切成40μ米厚的垂直部分。视网膜部分收集文化井使用immunofluorescent显微镜和加工。阻止非特异性结合位点,部分处理缓冲区B (1% BSA, 0.2%牛明胶和皂苷0.05% 0.01 PBS) 3 h在冰上。部分被孵化后抗体:单克隆鼠标anti-Ki67(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国;稀释1:1500),单克隆鼠标anti-ED1 (Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国;稀释1:100)和多克隆兔anti-Iba1 (Wako、日本;稀释1:500)在一夜之间在4°C。与0.01 PBS洗涤后,使用二次抗体免疫反应性是可视化包括species-appropriate Cy3-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA,美国;稀释1:3000)和Alexa萤石488驴anti-mouse共轭免疫球蛋白(生活技术,大岛,纽约,美国;稀释1:2000)在室温下2小时。 Before mounting, cell nuclei were counterstained with 4 ,6-diamidine-2 - - - - - -phenylindole盐酸盐(DAPI热科学,沃尔瑟姆,妈,美国;稀释1:1000)。在0.1磷酸盐缓冲剂,洗后的部分是安装在载玻片的安装介质(美国Dako,圣克拉拉,CA)。
2.5。共焦显微镜
Immunofluorescent染色是评估通过共焦激光扫描显微镜(LSM 800元,卡尔蔡司有限公司,德国)。荧光图像捕获与红色(红色:激发650海里,排放647 - 700 nm)在240 x,和PEDF图像观察到400 x放大能力。捕获的图像转换成JPEG格式。
2.6。统计分析
统计分析比较的同龄糖尿病组进行控制使用方差分析。在各个年龄段,学生的 - - - - - -与Bonferroni调整测试是用来评估的意义年龄组和糖尿病大鼠之间的变化。
3所示。结果
3.1。血糖水平和体重的老鼠注射STZ后
在正常控制老鼠,血糖水平保持相对稳定( mg / dL)在整个实验期间,随着时间的推移,体重逐渐增加(图1)。然而,在大鼠注射STZ,血糖水平显著增加注射后1周,到达了一个高原在16周( mg / dL)。在16周,没有观察到显著差异在体重STZ-injected老鼠和控制。
(一)
(b)
3.2。小胶质形态
组织学分析HE-stained部分视网膜显示无显著变化在早期的时间点。8周后,轻微的视网膜变薄层内部的观察(图2)。在对照组,Iba-1 +细胞主要分布在视网膜的内部层,和大多数小胶质细胞表现出分歧的形态。糖尿病组,观察变形形态的神经节细胞层(GCL)和视网膜内网状层(IPL),糖尿病发病4周后,随着时间的推移增加细胞数量。确认为活化的小胶质细胞,有些小胶质细胞表现出相对过度增大的细胞体。活化的小胶质细胞在糖尿病大鼠视网膜12 - 16周提出更过分生长细胞体粗过程。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。小胶质密度和激活
Iba-1 +视网膜小胶质细胞的密度显著提高糖尿病大鼠相比,控制老鼠四周postdiabetes发病和达到12周postdiabetes发作( )。这是保持在一个较高的水平在16周postdiabetes发作( )(图3)。
(一)
(b)
共焦分析double-stained组织部分证实了ED1表达式主要出现在Iba1 +细胞体和也观察到在某些过程。虽然确定活化的小胶质细胞,显著增加ED1表达式中检测出细胞暴露于高葡萄糖1星期。ED1表达达到了一个峰值在四周postdiabetes发作,在糖尿病大鼠(图16周仍然很高4)。
3.4。小胶质分布
通常在控制老鼠的视网膜小胶质细胞分布在GCL ( )和IPL ( )。此外,更少的小胶质细胞中观察到外网状层(OPL),外核层(筒)和杆锥层。在四周糖尿病老鼠, 小胶质细胞是位于GCL和 IPL ( )。在此期间,小胶质细胞的数量增加了GCL,顺便还能减少IPL。然而,小胶质细胞的分布改变GCL的同时增加IPL 12和16周后( 和 ,)(图5)。
3.5。小胶质细胞增殖
确定糖尿病建模影响视网膜细胞的增殖,我们评估ki - 67的表达,使用包含IHC增殖细胞标记。控制的眼睛,观察弱ki - 67表达只在内皮细胞;然而,在糖尿病大鼠,弱(但明显)观察ki - 67表达主要在内部视网膜层。我们确定了细胞coexpressed Iba-1和ki - 67,表明激活小胶质细胞(Iba-1 +)也激增(ki - 67 +)和迁移。Iba-1强度+ / ki - 67 +细胞在四周略微增加糖尿病大鼠相比,年龄控制大鼠( , )。然而,显著增加观察糖尿病大鼠(12 - 16周 , ; , ,)(图6)。
4所示。讨论
最近的证据表明小胶质细胞的活化和迁移可能有害或有益的影响相邻的神经元。因此,重要的是要研究小胶质激活的机制。见解获得这样的研究将使我们能够找到有效治疗疾病与小胶质功能障碍有关。
小胶质反应神经损伤可以归因于因素诱发急性神经元死亡,招募外周免疫细胞,引起居民的变换小胶质细胞吞噬macrophage-like细胞。这些细胞中发挥关键作用的缺血性视网膜炎症过程通常从系统性免疫系统隔离blood-ocular障碍(16,17]。
在人类的眼睛里,可以看到许多集群肥厚性小胶质细胞在不同阶段的博士(18]。一项研究报道在四周糖尿病动物的视网膜小胶质激活,就是明证的过渡成为网状的小胶质细胞形成的不规则形状的形式(15,19];然而,陈等人。19)报道,12周的糖尿病大鼠表现出显著增加活化的小胶质细胞的比例,没有任何并发小胶质密度增加。在目前的研究中,我们评估了促炎的条件下小胶质反应的早期阶段STZ-induced糖尿病包括4周内。
Iba-1是静止和活化的小胶质细胞的标记。活化的小胶质细胞表现出高Iba-1表达式,扩大soma,越来越短的过程。在先前的研究,Iba-1突出表现在四周糖尿病老鼠,和Iba-1表达达到12周postdiabetes发作,表明小胶质细胞的显著变化。然而,施等人报道,Iba-1不能自行检测使用活跃的小胶质细胞实验(博士20.];他们建议costaining Iba-1和其他小胶质激活CD11b等标记可以准确反映小胶质激活的状态。因此,在本研究中,我们使用ED1作为标志来评估小胶质细胞的激活。包含IHC透露,ED1 +细胞数量显著增加糖尿病诱导后1周;此外,活化的小胶质细胞增生和肥大展出。在我们的研究中,表达Iba-1增加在四周postdiabetes发病和达到12周;这与以前的研究结果是一致的(20.,21]。
在目前的研究中,尽管没有显著增加Iba-1表达检测,小胶质活动形态变化和分布开始1周内糖尿病发病。大部分分布在视网膜内小胶质细胞,特别是IPL,在正常大鼠的控制。在实验性糖尿病大鼠小胶质细胞反应的1周内迁移反应。视网膜小胶质细胞被重新分配,高数量的IPL GCL和较低的数量。这种变化可能相对归因于小胶质迁移,可以确定两个生理和病理条件下(22- - - - - -24]。
在目前的研究中,Iba-1表达式在视网膜上略微增加在四周postdiabetes发病和达到更高水平在8 - 12周的postdiabetes发作。最显著的变化在小胶质细胞被发现在12周postdiabetes发病;这种变化与Ki67表达式是相一致的。ki - 67抗原的增殖细胞的标记。双重染色Iba-1和ki - 67可以使检测激活小胶质细胞的增殖。我们是增殖细胞在糖尿病大鼠小胶质细胞为主的细胞和巨噬细胞浸润较少[25,26]。的表达显著增加ki - 67和Iba-1诱导实验性糖尿病后大概可以归因于暂住的小胶质细胞和巨噬细胞的渗透或扩散。这个假设可以进一步证实的事实的表达ki - 67和Iba-1中没有检测到控制的眼睛,即使血源性巨噬细胞是可见的,从而表明后续细胞浸润。然而,进一步的研究需要解决是否增加ki - 67和Iba-1表达是因为视网膜小胶质细胞的渗透到还是居民小胶质细胞的增殖的结果。
原则从纵向研究发现是:古典小胶质激活是糖尿病发病后1周。即使小胶质细胞激活的总量没有增加,小胶质细胞的分布的变化已经开始一周内。此外,包含IHC Iba-1和ED1表达证实小胶质激活在早期阶段的实验性糖尿病大鼠的视网膜。Upregulation后这些分子的诱导糖尿病大鼠恰逢小胶质激活中涉及的各种疾病(24,27]。
尽管小胶质激活博士被认为是一个显著的神经病理变化,其发病机制还有待阐明。活化的小胶质细胞释放多种炎性趋化因子和细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子和interleukin-1β(28- - - - - -30.)在最近的研究中,二甲胺四环素(小胶质激活抑制剂)已经被用来探索小胶质细胞的作用在不同的疾病19,31日]。然而,他们的研究结果可能仅仅是一个限制性的效果。需要更精确的研究来研究小胶质细胞的功能和影响。
5。结论
在早期糖尿病大鼠的视网膜小胶质细胞被激活;改变观察小胶质形态、密度和分布在1星期内糖尿病发病。早期糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞的激活可能暗示博士发病机理的重要性,这就需要进一步调查。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIT)(2019号r1g1a1100084)。