文摘
背景和目的。的影响Proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9 (PCSK9)抑制糖尿病的血糖指数仍然远未明朗。我们探索的影响PCSK9抑制糖尿病大鼠的血糖指数模型。方法。准备anti-PCSK9疫苗,被称为免疫原性融合肽构造PCSK9-Tetanus (IFPT)与nanoliposome载体的表面。健康老鼠收到四个皮下注射疫苗的两周一次的间隔。过去接种疫苗两周后,anti-PCSK9抗体滴度,PCSK9瞄准,抑制PCSK9-low-density脂蛋白受体(LDLR)交互进行评估。经过验证的抗体生成、免疫老鼠腹腔内接受单剂量(45毫克/公斤)链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病。的水平测量空腹血糖(FBG),和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)进行了评估血糖状态。在研究结束时,总胆固醇,低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白),甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇浓度化验。组织病理学检查肝脏和胰腺也使用hematoxylin-eosin染色方法执行。结果。准备nanoliposomal疫苗可能强烈诱导anti-PCSK9抗体接种疫苗的老鼠。一周内注射STZ后,光纤光栅水平低接种组与糖尿病对照组(49% ( , ))。OGTT,注入大鼠显示改善葡萄糖耐量降低血糖水平反映的超过180分钟,与糖尿病控制。此外,ITT公司表明,胰岛素注射后,血糖浓度下降了49.3%接种组与糖尿病对照组。最少、接种疫苗的老鼠表现出低(-26.65%, )血浆低密度脂蛋白水平与糖尿病控制。胰腺组织的组织病理学检查表明,接种大鼠的胰岛细胞的人口有一个轻微的下降β肽和几α肽。正常肝组织学也观察接种疫苗的老鼠。结论。PCSK9抑制通过脂质体IFPT疫苗可以改善血糖和胰岛素耐受性障碍以及糖尿病的血脂。
1。介绍
Proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9 (PCSK9)是一个无聊的血浆蛋白生成和发布的肝细胞。的liver-secreted PCSK9主要以其作用调节低密度脂蛋白(LDL) (LDLR)肝细胞表面的受体,因此,止血的血液中的低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)(1]。血浆循环肝LDLR PCSK9控制通过通过针对LDLR的细胞外领域转译后的修改,表皮生长因子以重复(EGF-A),并对溶酶体消化(2]。事实上,EGF-A LDLR回收是一个负责任的域细胞表面(3- - - - - -5],PCSK9绑定阻碍常规回归LDLR的细胞膜,促进其在溶酶体的消化隔间,导致减少肝脏清除血浆低密度脂蛋白胆固醇(6,7]。
值得注意的是,糖尿病(DM)患者患有动脉粥被低密度增加,高甘油三酯血症,降低antiatherogenic高密度脂蛋白(HDL)粒子(8,9]。低密度与治疗目标被发现在糖尿病血脂异常,和LDL-reducing方法被证实能够减少心血管事件(CV)在糖尿病患者10]。他汀类药物是主要的ldl降低代理,通过抑制胆固醇生物合成的11)+大量的多效性的影响(12- - - - - -18]。虽然他汀类治疗显示了强劲的有效性改善简历端点事件(19- - - - - -21),许多随机对照试验的荟萃分析显示一个记录链接的提升机会的他汀类药物使用DM (22- - - - - -26]。
PCSK9抑制剂,主要是单克隆抗体(mab),提供一个强大的LDL-reducing方法,结合最大耐受剂量他汀类药物,可降低低密度约73% (27,28)和减少简历结果(29日- - - - - -31日]。尽管坚定地从各种临床试验数据显示一个明显的减轻PCSK9抑制剂evolocumab对高脂血症的影响在T2DM病人32),仍有一些问题关于PCSK9抑制剂和DM并发症之间的关系(33- - - - - -36]。因此,它是至关重要的评估新开发的PCSK9抑制剂对血糖的影响指数和糖尿病的进展。
为了解决这个问题,临床前和临床研究糖尿病模型和个人是不可避免的。我们之前的研究表明,针对PCSK9 nanoliposomal疫苗可以显著诱导抗体抑制等离子体PCSK9的生成,从而减少血浆低密度脂蛋白在动脉粥样硬化的实验模型(37- - - - - -40]。理解anti-PCSK9治疗血糖指数的影响,我们评估了预防的影响nanoliposomal anti-PCSK9疫苗的老鼠用链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病。
2。方法
2.1。Nanoliposomal疫苗制备和表征
Nanoliposomal接受疫苗的免疫原性肽共轭脂质体纳米颗粒表面构造根据先前所描述的方法(41]。总之,脂质薄膜水化法提供脂质体纳米颗粒。包含PCSK9和破伤风抗原表位肽结构称为免疫原性融合PCSK9-tetanus (IFPT)肽是附着在表面的纳米粒子使用postinsertion方法做好了准备。制备脂质体的连接效率和肽含量IFPT (L-IFPT)用高效液相色谱检测配方(高效液相色谱)分析(Knauer;柏林,德国)。peptide-linked脂质体的物理性质,包括粒子大小、电荷,和同质性评估的动态光散射(DLS)方法Zetasizer(英国莫尔文Nano-ZS)。验证L-IFPT配方被吸附到0.4%明矾佐剂(Sigma-Aldrich) 1: 1 ( : )比和用于STZ-induced糖尿病大鼠体内研究。
2.2。动物
共有24个男性纯种白化大鼠( )实验动物研究中心提供的是医学院的马什哈德大学医学科学,马什哈德,伊朗。所有动物处理程序进行了严格基于动物福利机构伦理委员会批准的指导方针和研究咨询委员会。老鼠重每周,在实验的最后,位于空调空间的室温 12:12 h光/暗周期,和美联储一个标准的啮齿动物的饮食和水随意。开始实验和STZ-induced糖尿病之前,老鼠管理与疫苗配方或盐水缓冲。尾静脉采血进行了最后一次免疫后两周的滴定等离子anti-PCSK9抗体,并注射STZ后光纤光栅测量。在实验的最后,鼠安乐死是由静脉注射硫喷妥钠(30毫克/公斤)[42,43),和血液收集通过心脏穿刺检查血浆血脂。胰腺和肝脏组织分离来确定他们的体重和细胞破坏。
2.3。疫苗接种计划
前一周的研究中,老鼠被驯化的随机被分成两组,vaccine-treated组( , )和参与集团( , )。疫苗组老鼠两周一次的接种4次皮下注射(南)200μ包含20 L L-IFPTA配方μg肽,而参与组大鼠同时收到了盐水缓冲。第一次免疫接种的时间点被称为周0 (W0)。三个推进器被牵连在W2, W4,将(图1)。时间点的血被撤回将(图1)和血浆样本制备和用于抗体效价分析。疫苗接种时间表,包括剂量和持续时间、计划基于我们之前的研究(41]。
2.4。评估的有效性Nanoliposomal Anti-PCSK9疫苗的老鼠
确定大鼠的脂质体疫苗的效力,等离子anti-PCSK9抗体效价,等离子PCSK9浓度,antibody-targeted PCSK9,和antibody-inhibited PCSK9 / LDLR交互分析解释在我们的最近的研究(41]。
简洁,脂质体疫苗诱发anti-PCSK9抗体ELISA方法评估了使用连续稀释等离子体( )。microwell板阅读器(日出、Tecan、瑞士)是用于检测光学密度(OD) 450海里。稀释系数由50%的最大光密度( )定义抗体效价测定(41]。量化的水平自由等离子PCSK9接种疫苗的老鼠,一个PCSK9酶联免疫试剂盒(CircuLex™, cy - 8078, MBL,沃本,MA)是按照制造商的指示。这PCSK9酶联免疫试剂盒也用于测定与PCSK9疫苗产生抗体的相互作用,因此,确定抑制大鼠血浆PCSK9生成的抗体(41]。发现诱导抗体的功能,接种疫苗的老鼠的等离子体的能力的抑制PCSK9-LDLR交互在体外评估是一个PCSK9-LDLR吗在体外结合分析工具包(CircuLex™, cy - 8150, MBL,沃本,MA)。ELISA OD显示了高的PCSK9-LDLR互动,在anti-PCSK9抗体的存在,这样的互动是阻碍,因此,ELISA检测OD降低(41]。
2.5。STZ-Induced T1DM
14天之后最后一个疫苗接种(W8,抗体效价时峰值水平,基于我们之前的发现(41]),vaccine-treated和参与组织受到糖尿病实验评估anti-PCSK9疫苗的抗糖尿病的作用。因此,overnight-fasted T1DM条件诱导(12小时)由单个STZ腹腔内注射的老鼠(45毫克/公斤,Sigma-Aldrich)新鲜溶解在citrate-buffered盐水(0.1 M, pH值4.5)[44]。nonvaccinated组的大鼠随机分成两组:正常的控制(NC)组( ;未接种疫苗的柠檬酸和接收缓冲区)和糖尿病控制(DC)组( ;未接种疫苗和接收STZ)。vaccine-treated组( )收到STZ和被指派为接种STZ-injected (VS)组。注射STZ后第一周,DC组的老鼠 确认T1DM模型(44]。
2.6。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
评估每个大鼠的葡萄糖耐受能力,一夜之间,一个在老鼠身上进行OGTT被禁食与葡萄糖在W9剂量的2 g /公斤。短暂,葡萄糖,口头上给了解决方案,和血糖浓度被一个检查(EasyGluco、韩国)时间点0分钟(葡萄糖负荷之前)和30,60岁,90,120,150,180分钟口服葡萄糖负荷后(45]。由此产生的数据被表示为一个集成的血糖曲线下的面积(AUC葡萄糖),由梯形法则计算使用GraphPad Prism 7.04版。
2.7。胰岛素耐量试验(ITT)
胰岛素耐量试验进行确定的外围利用葡萄糖。在W10,胰岛素(0.8 U /公斤)是overnight-fasted大鼠腹腔注射。血糖测量时间点0分钟(胰岛素注射前)和15、30、45、60、75、90和120分钟后胰岛素注射(46]。结果表示为AUC葡萄糖。
2.8。血脂分析
血浆水平的低密度脂蛋白,高密度脂蛋白胆固醇(HDL - c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)结束时进行评估研究(W10)与商业套件(生物系统公司)按照制造商的指示。
2.9。组织病理学检查
最后,老鼠安乐死、器官样本收集。立即删除,小块孤立的胰腺和肝脏组织的切割和浸没式缓冲福尔马林固定在10%。formalin-embedded组织逐渐脱水,嵌入在石蜡,切成5μ米部分,deparaffinized,最终用苏木精和伊红染色方法())。H&E-stained部分的组织学检查由一个专家病理学家,使用光学显微镜下提供数码相机放大400倍。
2.10。统计分析
GraphPad棱镜(7.04版)和IBM SPSS统计为Windows版本20(美国、IBM公司,纽约Armonk)被用于统计分析。结果分析了使用单向方差分析和Bonferroni事后多重比较检验评估动物群体之间的差异的重要性。值被表示为 或者是 ,图片右下方的95%置信区间的意思。结果与 被视为具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Nanoliposomal配方
空nanoliposomes和IFPT-linked nanoliposomes被发现有一个尺寸范围从150纳米到180纳米直径的多分散性指数< 0.2,揭示nanovesicles同质性高的准备。表面电荷分析也表明,准备配方-电动电势。通过高效液相色谱分析显示,96%的初IFPT多肽添加与脂质体纳米颗粒。
3.2。在大鼠脂质体Anti-PCSK9疫苗的效果
L-IFPTA疫苗可以诱导high-titer免疫球蛋白抗体PCSK9肽在大鼠4疫苗在每周两次的间隔(图2(一个))。疫苗anti-PCSK9抗体显示等离子PCSK9的具体针对接种疫苗的老鼠。作为显示在图2 (b)的等离子体浓度自由PCSK9疫苗组( )明显( )低于对照组( )。等离子PCSK9浓度显著降低57.8%接种疫苗的老鼠相比,控制老鼠。PCSK9透露的抑制试验使用ELISA方法,接种疫苗的老鼠的等离子体可能成为一个明显更高的OD450年信号比控制老鼠(图2 (c)),显示一个直接和具体针对等离子PCSK9的脂质体在大鼠诱发的anti-PCSK9抗体。此外,诱导抗体可以明显抑制在体外绑定PCSK9 LDLR,显示诱导抗体的功能。值得注意的是,这是发现,在接种疫苗的老鼠的等离子体的出勤率,在体外交互的小鼠PCSK9和LDLR明显阻碍了30%,相比之下,对照组的血浆样本(图2 (d))。总之,L-IFPTA疫苗能诱导特定和功能性抗体抑制PCSK9-LDLR交互通过等离子体的具体针对PCSK9的老鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。体重变化
的体重改变疫苗接种期间vaccine-treated (V)和参与控制(C)组计算初始重量(W0)减法从动物的最后重量的时间点注射STZ (W8)。体重显著提高V组( 体重增加, )和C组( 体重增加, )(图3(一个))。同样,压力曲线(AUC集成领域重量)疫苗接种期间并没有统计上的不同( )在V组( )和C组( )(图3 (b))。注射STZ后,身体体重增加明显失败VS和DC组但不是数控组。因此,注射STZ后的两个星期期间,身体重量的VS和DC组明显下降了 ( , )和 ( , ),而数控组表现出显著的身体体重增加 ( , )(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。脂质体Anti-PCSK9疫苗减少了光纤光栅的水平
注射STZ后一周内,光纤光栅测量表明,直流老鼠遭受了显著( )高血糖症( ,95%置信区间:301 - 402 mg / dL)与NC组( ,95%置信区间:82 - 91 mg / dL),验证STZ-induced糖尿病。有趣的是,没有显著增加的光纤光栅水平与集团( ,95%置信区间:94 - 266 mg / dL)相比,数控组。光纤光栅水平为49% ( , )低VS组与DC组(图4(一)和表1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.5。脂质体Anti-PCSK9疫苗提高葡萄糖敏感性
评价葡萄糖敏感性接种疫苗的STZ-injected老鼠(VS),进行OGTT注射STZ后一周(W8)。口服葡萄糖管理局(2 g / kg)的直流老鼠显示显著升高血糖水平(60分钟后)和展出,外源性葡萄糖政府明显葡萄糖耐量相比数控老鼠。对大鼠有显著提高葡萄糖耐受能力相比,直流老鼠。进一步,对大鼠记录显著减少血糖水平在180分钟相比直流老鼠(图4 (b))。综合血糖曲线下面积(AUC)葡萄糖)超过180分钟的直流大鼠显著( )高于数控的老鼠。AUC值的测量表明,血糖水平显著( )下降了34.5% VS老鼠相比,直流老鼠(图4 (c))。VS老鼠,血糖水平60分钟后开始明显减少趋势达到基线水平在180年时间,而在直流集团一致的葡萄糖水平表示60到120分钟。尽管血糖水平缓慢下降120分钟后直流老鼠,它没有达到基线水平在180分钟(图4 (b))。
3.6。脂质体Anti-PCSK9疫苗可以提高胰岛素敏感性
测量胰岛素敏感性,一个胰岛素挑战(0.8 U /公斤,i.p)进行OGTT后四天。血糖浓度和AUC葡萄糖DC组显著( )高胰岛素注射后不同时间点相比,数控老鼠。血糖浓度和AUC葡萄糖在对大鼠明显( )老鼠在ITT相比,直流低。血糖浓度的对老鼠没有显著高于90和120分钟后胰岛素注射与相应时间点的血糖水平数控老鼠(图4 (d))。AUC值比较发现,血糖水平下降了49.3% VS组相比,直流组(图4 (e))。
3.7。脂质体Anti-PCSK9疫苗降低了等离子体密度
在实验结束时,测量等离子体脂指数显示无显著差异的TC和TG不同组。没有区别是在直流和VS团体之间的血浆高密度脂蛋白胆固醇。明显,明显提高了低密度(90%, )和高密度脂蛋白胆固醇(45.8%, )被发现在大鼠相比,数控直流。对老鼠显示明显降低(-26.65%, )血浆低密度脂蛋白胆固醇水平比直流老鼠。NC组相比,与老鼠表现出明显高于低密度等离子体水平(39.4%, )和高密度脂蛋白(51.56%, )(图5)。
3.8。胰腺和肝脏的相对权重
相对器官重量测定 ,在实验的最后一个星期(W10)。相对胰腺重量 , ,和 体重在VS特区分别和数控老鼠。的相对胰腺重量VS组明显高于( , )比直流集团,虽然与NC组相比无显著差异。然而,相对直流集团的胰腺重量显示 ( )减少相比数控组。在肝脏中,相对权重被发现 , ,和 体重在VS特区分别和数控老鼠。统计分析表明,肝脏相对重量所有实验组之间没有显著差异。
3.9。胰腺组织病理学
胰腺的组织病理学改变是在所有大鼠(图)染色后展出6)。显微镜检查胰腺部分展示了正常形态和比例的外分泌腺泡的架构和朗格汉斯细胞变性和坏死的小岛,没有证据,数控的老鼠。胰岛细胞染色比周围的轻腺泡的细胞。正常的胰岛细胞显示胰岛素生产为主β肽与细胞质颗粒嗜碱和一些嗜酸性glucagon-producingα肽。顶端的腺泡的细胞包括锥体细胞嗜酸性胞浆,彩色强烈,住进了小叶与突出的基底核(图6(一))。直流的老鼠,病理改变的外分泌和内分泌隔间被观察到。包含小液泡指出Swollen-acinar细胞。小叶间导管被扁平上皮衬里。胰岛细胞表现出显著减少嗜碱性的人口β肽和几个嗜酸性α肽。胰岛中含有嗜酸性不成形的存款,暗示细胞坏死。演示的内分泌胰腺内分泌细胞变性和坏死的区域包括胰岛(图6 (b))。对大鼠的胰岛显示略有减少人口β肽和只有少数α肽。再一次,细胞变性和坏死胰岛内观察。萎缩性腺泡的细胞明显和外分泌和内分泌隔间之间的边界是明显不明显。总的来说,对胰腺表现出较小的强度曙红相比数控老鼠(图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.10。肝脏组织病理学
H&E-stained幻灯片的肝脏在数控直流,VS老鼠显示正常肝组织学结构组成与正常肝小叶中央静脉。每个小叶由辐射表、链的多边形中央静脉周围肝细胞形成一个网络。肝细胞有定义良好的细胞边界粉色嗜酸性胞浆,主要是中央单一核;夹杂物也不见了。没有血性(数据区域或纤维化明显6 (d)- - - - - -6 (f))。
4所示。讨论
直接联系DM和“动脉粥样硬化性心血管疾病风险升高已经记录(47,48]。最成熟的管理和糖尿病心血管并发症的治疗目标是低密度(10]。PCSK9抑制是一种安全有效的ldl降低的方法。然而,实验和孟德尔随机化调查表明,遗传变异PCSK9的显化低密度脂蛋白水平降低是伴随着增加光纤光栅DM(水平和提升的机会34- - - - - -36]。因此,PCSK9抑制剂的安全性和有效性,特别是那些除了马伯,对于调节糖尿病患者的血糖指数需要进一步调查。
在这里,我们首次展示了PCSK9抑制的影响通过在糖尿病大鼠STZ-induced DM的疫苗接种方法。有趣的是,结果表明,预防性管理anti-PCSK9疫苗可以降低低密度脂蛋白水平和防范STZ-induced糖尿病的恶化,这是相关显著改善血糖指数包括光纤光栅,OGTT, ITT公司,加上较低的组织病理学变化,肝脏和胰腺组织。脂质体anti-PCSK9疫苗被证明减少功能免费PCSK9糖尿病大鼠的血浆浓度通过直接和具体的目标,这是与抑制PCSK9 / LDLR互动,导致等离子体密度的减轻。
的ldl降低影响脂质体anti-PCSK9疫苗已经在我们的其他临床研究还发现,预防(37,38)和治疗(39,40)影响hypercholesterolemic老鼠以及疫苗的安全健康的非人灵长类动物(49)进行评估。这种效应同样报道了研究使用其他PCSK9抑制疫苗,包括AFFITOPE®的anti-PCSK9疫苗(50,51),一个人类重组蛋白质anti-PCSK9疫苗(52),由病毒样颗粒疫苗显示PCSK9肽(53]。有趣的是,刚才提到疫苗方法显著改善高胆固醇血症小鼠模型,如载脂蛋白e3莱顿。CETP老鼠AFFiRiS集团用于开发AFFITOPE®疫苗(51]。
STZ-induced糖尿病是一个模型的DM高脂血症和特点β细胞功能障碍,导致胰岛素不足及随后的高血糖以及实验动物体重的损失。在我们的研究中,明显升高血糖,以及酗酒的摄入的食物和水,被认为在STZ-treated老鼠(DC组),相比正常控制老鼠(NC组)。STZ-induced高血糖被发现在接种疫苗的老鼠(VS组)被抑制。光纤光栅测量表明,对大鼠的血液中葡萄糖的浓度没有明显不同于正常的控制,与直流的老鼠相比明显降低。OGTT分析如图所示,葡萄糖耐量明显受损DC组相比,数控。anti-PCSK9疫苗保护VS老鼠对STZ-induced葡萄糖耐受不良和改善葡萄糖敏感性VS组相比,直流组。ITT公司评估显示,STZ-treated大鼠的胰岛素敏感性是深刻的下降,和PCSK9疫苗缺乏抑制与老鼠,导致增强的外围利用葡萄糖通过anti-PCSK9疫苗接种。因此,STZ-treated大鼠胰岛素挑战并没有显示出他们的血糖浓度显著下降,潜在的糖尿病大鼠,这些失去了外围的胰岛素敏感性,因此不能使用体内注射胰岛素降低血糖浓度。这些发现表明,anti-PCSK9 STZ-induced疫苗接种可以保护对大鼠胰岛素抵抗。
我们的研究结果可以由傅里叶试验(54HbA)显示1 c和空腹血糖水平在糖尿病患者之间具有可比性,前驱糖尿病,或者normoglycaemia与evolocumab或安慰剂治疗。此外,综合分析结果的几个独立的3期临床试验,包括科目没有DM表明alirocumab施加对糖尿病的发病率没有显著影响,或空腹血糖(FBG)和HbA1 c相比,ezetimibe或安慰剂6-18-month后随访期间(55]。然而,一些孟德尔随机化研究显示功能丧失的突变PCSK9基因与低密度但高血浆空腹血糖浓度和DM(风险升高34- - - - - -36]。除此之外,当地deficiency-but不是等离子体水平的PCSK9已被证明是负责LDLR的胰腺细胞过度表达,导致细胞内胆固醇量和增加β细胞损伤(56]。这些结果表明,anti-PCSK9马伯,抑制PCSK9仅仅在血液循环,可能发挥的功能上没有负面影响β肽,而在提到孟德尔的研究中,全球PCSK9缺陷评估的影响。
此外,减肥是一个标志性的DM由于结构蛋白的破坏和肌肉损伤、并发症的胰岛素缺乏。缺乏insulin-induced营养吸收促进食欲过盛,而高血糖引起多尿症和随后的烦渴。虽然anti-PCSK9疫苗可以防止接种疫苗的老鼠STZ-induced高血糖和改善葡萄糖止血相同的程度上控制老鼠,身体体重的损失与组明显DC组以类似的方式。这种矛盾的影响疫苗接种STZ-induced糖尿病可以解释加剧了脂类分解和高脂质过氧化导致STZ-treated老鼠(减肥57]。
总之,上述的研究结果表明,低密度脂蛋白降低通过脂质体疫苗诱发anti-PCSK9抗体不仅不是对血糖控制产生的副作用,还能改善糖尿病动物血糖指数和胰岛素敏感性。目前发现呼吁更多的研究在其他糖尿病实验模型确认PCSK9免疫血糖指数产生积极的影响。
数据可用性
数据可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
Maciej巴拿赫是扬声器的信,安进、Herbapol KRKA, Polpharma, Mylan / Viatris,诺华诺和诺德、赛诺菲-安万特(sanofi - aventis) Teva, Zentiva;是雅培血管顾问,安进Daichii制药,Esperion, FreiaPharmaceuticals,诺华,Polfarmex,和赛诺菲-安万特;从安进和获得资助,Mylan / Viatris,赛诺菲,Valeant。所有其他作者没有利益冲突。
确认
研究报告在这个出版得到了精英研究员格兰特委员会奖963401号国家医学研究所发展(NIMAD),德黑兰,伊朗。我们也感谢马什哈德的支持大学的医学科学,马什哈德、伊朗(批准号941672)。