文摘

的目标是。我们研究了视网膜结构的变化在正常糖耐量(NGT),葡萄糖耐量(IGT)、糖尿病(DM)和糖尿病肾病(DKD)阶段大冢Long-Evans德岛脂肪OLETF大鼠。方法。我们分配OLETF大鼠四组根据他们OGTT结果和24小时尿微白蛋白(24 h UMA)级别:NGT, IGT, DM, DKD组。我们观察到的结构和相应的病理变化和量化HIF-1的表达α伊诺,NF -κB, VEGF、ICAM-1 occludin的视网膜。结果。严重破坏了视网膜结构,尤其是视网膜神经节细胞(RGCs),观察在IGT阶段。HIF-1的表达α伊诺,NF -κB VEGF和ICAM-1显著调节,而occludin的表达下调。结论。严重视网膜病变发生在IGT阶段。炎症和缺氧可能损坏血视网膜屏障(马上回来),导致糖尿病性视网膜病变。

1。介绍

患病率增加的糖尿病慢性并发症,尤其是糖尿病肾病(DKD)和视网膜病变(博士),造成严重的社会问题,威胁着人类的健康。博士的整体流行,主要的视网膜血管并发症的糖尿病(DM),为任何在DM博士是34.6%。这是一个视觉损害和失明的主要原因在劳动年龄人口1- - - - - -3]。的主要原因是DKD全球终末期肾病(ESRD)。通常是伴随着DKD博士,都有类似的发病机理(4,5]。多项研究已经证明了一个重要的相关性和DKD博士在2型糖尿病患者6- - - - - -8]。一些研究还认为,博士可能会先于DKD [9,10]。病人可能患有不同程度的肾损伤之前或在糖尿病的诊断(11,12]。我们以前的研究集中在结构和功能损害肾小管受损的糖耐量减低(IGT)阶段(13]。博士可能发生在糖尿病的早期阶段,我们分析了视网膜的结构变化在糖尿病的发病机理研究的不同阶段在大冢Long-Evans博士德岛脂肪OLETF大鼠。

2。材料和方法

2.1。动物和组

这项研究是坚持执行国家卫生研究院(NIH)实验动物保健和使用指南(NIH出版。85 - 1996年启23日)和被批准的机构天津医科大学动物保健和使用委员会。

32男OLETF大鼠由大冢制药有限公司有限公司(德岛、日本)。他们被安置在一个空调房间20 - 25°C,湿度50% - -70%和12 h光暗周期和喂高脂肪的食物。我们允许老鼠免费获取食物和水。32男Long-Evans德岛大冢(勒托)老鼠用作非糖尿病的控制模型。

我们进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)每4周。在测试前,大鼠禁食16 h一夜之间,和30%葡萄糖溶液(2 g / kg)是由胃强饲法。我们之前收集血液样本尾静脉葡萄糖加载和30岁,60岁,120分钟后葡萄糖负荷。血糖水平使用自动血糖分析仪测定。血浆胰岛素浓度检测使用等。OLETF大鼠分为四个阶段根据OGTT结果(14)和24小时尿微白蛋白(24 h UMA)级别:正常糖耐量(NGT)阶段,对应于一个正常的血糖水平;IGT阶段,对应的峰值水平 ,或者一个 在120分钟;DM阶段,当上述条件都满足;和糖尿病肾病(DKD)阶段的24小时乌玛OLETF大鼠显著大于勒托老鼠。肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素- 6 (il - 6)的血清水平测试使用酶联免疫吸附试验(ELISA)。八OLETF大鼠随机选择NGT和安乐死,IGT, DM, DKD阶段,随着NGT, IGT, DM, DKD组和对照组中同样年龄的勒托老鼠安乐死的对照组。

2.2。视网膜结构

(1)免疫组织化学(包含IHC)。视网膜组织立即固定在4%福尔马林,随后嵌入石蜡。HIF-1的表达水平α(209601 - 1 - ap, Proteintech),伊诺(18985 - 1 - ap, Proteintech), NF -κB (ab7970 Abcam), VEGF (19003 - 1 - ap, Proteintech) ICAM-1 (ab124760 Abcam)和Occludin (ab31721 Abcam)使用包含IHC检测在视网膜上(2)光学显微镜。视网膜组织固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡。组织切片切在4μ米厚度,在二甲苯脱蜡,患者在水、乙醇浓度的减少通过苏木精和伊红染色()),并使用光学显微镜检查(3)透射电子显微镜。视网膜组织立即被放置在一个固定剂(2.5%戊二醛和锇tetraoxide 1%),使用梯度酒精脱水,环氧丙烷,嵌入在环氧树脂812。超薄的部分被使用一个ELICA ULTRACUT-R超微切片机和彩色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。部分是使用日立- 7500透射电子显微镜检查

2.3。统计分析

我们进行了使用IBM SPSS 26.0统计软件统计分析。所有被表示为正态分布数据 (SD)和所有其他数据都表示为中值(范围)。三组之间的差异进行了分析使用单向方差分析进行正态分布连续参数。如果观察到的差异,LSD - - - - - -测试是用于两组之间的比较。非正态的分布式数据使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行比较。如果观察到的差异,Mann-Whitney测试被用于两组之间的比较。用卡方检验比较不同的测量数据。如果双尾被认为具有统计显著性结果值< 0.05。

3所示。结果

3.1。OLETF大鼠的生化数据在不同的阶段

空腹胰岛素(鳍)水平和体重控制与NGT组在统计学上没有不同。然而,上述两个指标的含量在IGT阶段高于对照组。糖尿病和DKD组水平下降但仍高于对照组( )。

肿瘤坏死因子的表达水平α和il - 6在IGT阶段增加,继续随着疾病的进展而增加( )。24小时的水平乌玛NGT相似,IGT和DM组,但DKD组高于其他组(表1)。

3.2。严重视网膜病变发生在IGT阶段

在对照组(图1(一)(图)和NGT阶段1 (b)),视网膜中的所有层的结构是正常的。在IGT阶段,严重破坏发生视网膜,包括间质水肿的神经节细胞层,内部限制的不规则表面膜,以及视网膜神经节细胞的减少(RGCs)(图1 (c))。(图和DM阶段1 (d)),视网膜各层结构无序,细胞间物质水肿明显(如箭头所示)。在DKD阶段(图1 (e)),视网膜神经节细胞严重退化,和一个新的观察血管(如箭头所示)。

然后我们观察到视网膜超微结构使用透射电子显微镜。与对照组相比,NGT组大鼠视网膜形态以及超微结构(正常数据2(一个),2 (b),2 (f),2 (g),2 (k),2(左),2 (p),2(问))。然而,异常形态出现在IGT的神经节细胞阶段,包括线粒体肿胀、模糊波峰,液泡化(图2 (c))。可见光的细胞膜光盘受体是模糊和破碎的(图2 (h)),水肿的颗粒细胞观察(图2(米))。外颗粒层细胞不规则排列(图2(右))。上述形态学变化逐渐加重疾病进展(数字2 (d),2 (e),2(我),2 (j),2 (n),2 (o),2(年代),2 (t))。

3.3。炎症标记物的免疫组织化学染色改变、细胞因子和HIF-1α在不同的阶段

HIF-1αNF -κB、VEGF和ICAM-1显著调节IGT阶段,虽然occludin表达下调。

3.3.1。表达HIF-1α和伊诺OLETF大鼠的糖耐量受损的阶段

对照组(图一样3(一个)),HIF-1α主要是表现在视网膜神经节细胞层和低表达的内颗粒层NGT组(图3 (b))。而在IGT阶段,HIF-1的表达α内颗粒层(图中显著增加3 (c)),它进一步增加在DM阶段(图3 (d))。HIF-1 DKD阶段α表达了几乎整个视网膜,包括外颗粒层(图3 (e))。尽管伊诺的表达IGT阶段(图之间没有显著差异3 (h)(图),NGT阶段3 (g))和对照组(图3 (f)),它在DM阶段显著增加(图3(我)),在DKD阶段,几乎在整个视网膜(图表示3 (j))。HIF-1的量化α伊诺是如图3 (k)和3(左)。

3.3.2。表达式的NF -κB、VEGF和ICAM-1 IGT阶段的老鼠

NF -κB、VEGF和ICAM-1低表达在视网膜神经节细胞层和内颗粒层的大鼠对照组(数字4(一),4 (f),4 (k)(数据)和NGT阶段4 (b),4 (g),4(左))。这些炎症标记物在IGT阶段显著增加(数据4 (c),4 (h),4(米))。和他们进一步增加在DM阶段(数字4 (d),4(我),4 (n)),并在DKD阶段,他们表达了几乎所有视网膜层(数据4 (e),4 (j),4 (o))。NF -的量化κB、VEGF和ICAM-1数据所示4 (p)- - - - - -4(右)。

3.3.3。在老鼠身上Occludin表达式在IGT阶段

与对照组(图一致5(一个)),occludin主要是表现在视网膜神经节细胞层和内颗粒层NGT阶段(图5 (b))。在IGT阶段,occludin的表达拒绝在神经节细胞层(图5 (c)),进一步降低疾病进展(数字5 (d)和5 (e))。occludin的量化是图所示5 (f)。

3.3.4。炎症标记物的mRNA水平、细胞因子和HIF-1α在不同阶段OLETF大鼠的视网膜

与对照组相比,在IGT阶段,HIF-1的mRNA的表达α(图6(一)),进气阀打开(图6 (b)),NF -κB(图6 (c)),VEGF(图6 (d)),和ICAM-1(图6 (e))是调节了33.3%,18.2%,35.8%,23.4%,58.2%,occludin的分别,而(图6 (f))下降了32.7%。

4所示。讨论

我们的研究观察到病变发生在视网膜在IGT阶段,专注于神经节和感光细胞的损害。在视网膜双极细胞的感光细胞传递视觉信息,过程并将其传递给RGCs。接下来,RGC视神经轴突穿越,告诉大脑的视觉世界15]。的完整性RGCs承诺视网膜的正常功能;然而,高血糖等异常环境改变RGCs的结构或功能,和这种RGCs障碍是进步发展的后续博士(16]。

糖尿病性视网膜病变是一种神经与血管的疾病,严重的视力丧失的主要原因之一。RGCs受损的糖尿病性视网膜病变,产生细胞功能障碍及其后续损失(17]。

博士曾被认为是糖尿病微血管并发症,但是现在,这被广泛认为是一种神经与血管的疾病引起的神经与血管的单位(NVU)受伤。最近的观点是,视网膜神经退化发生在微血管损伤尤其是弱势群体神经元像RGCs;神经单元的破坏会导致血管单元损伤和加速微血管损伤(18]。研究表明,糖尿病视网膜病变是主要由视网膜光感受器引起的病变(19,20.]。在我们的研究中,我们观察到的异常结构,包括线粒体肿胀、模糊波峰,神经节细胞液泡化,模糊和破碎的视网膜感光细胞在IGT阶段。间质水肿和神经节细胞变性的视网膜神经节细胞层也观察到在IGT阶段。Neovascularity DKD阶段之前没有被观察到。这些结果表明,神经退行性变化可能发生在糖尿病的早期阶段。

血视网膜屏障(马上回来)是一个结构,保护视网膜细胞和视神经损害从细胞毒性物质,为他们提供了一个稳定的代谢环境。结构性破坏和增加的渗透性马上回来参与博士的发病机理然而,博士的发病机制仍不清楚,没有单一的机制可以解释马上回来的破坏。一系列的代谢异常,如缺血、缺氧、炎症,氧化应激,和一些细胞因子,被认为是参与了马上回来伤害。

最近,许多研究表明,地方、慢性低度炎症的发生和发展密切相关[博士21- - - - - -23]。的激活和释放NF -κB博士和其他炎性细胞因子发挥重要作用已经表明,il - 6等炎症标记物的表达,进气阀打开,TNF -α是调节在视网膜上博士(24- - - - - -27]。

同样,在我们的研究中,TNF的表达α和il - 6在IGT阶段显著增加,继续增加随着疾病的进展。通常,在视网膜VEGF水平低维护视网膜血管的完整性。异常,高水平的VEGF可以刺激内皮细胞迁移和血管增生,导致视网膜水肿和分泌,导致血管瘤。在我们的研究中,VEGF的表达,ICAM-1, NF -κB显著调节IGT阶段,继续增加随着疾病的进展。VEGF是一种重要的细胞因子,促进博士的出现和发展的许多因素能够移植的VEGF,缺氧是最直接作用的因素。在缺氧条件下,HIF-1的表达α是调节,从而促进VEGF的表达。我们还观察到HIF-1的表达α和伊诺在视网膜上逐渐增加,与先前的研究一致(28,29日]。随着病情的发展,VEGF的表达,ICAM-1, TNF -α逐渐增加视网膜,这反过来会使occludin的表达。作为occludin参与紧密连接的形成,它密切相关,马上回来。据报道,occludin的表达可以显著降低DM大鼠模型和视网膜血管内皮细胞刺激高葡萄糖[30.),损害了马上回来,导致血管渗漏。我们观察到occludin表达式在视网膜上的减少IGT阶段,进一步减少随着疾病的进展,表明损伤马上回来。上述结果表明,炎症和缺氧可能一起参与马上回来破坏,导致博士然而,其确切发病机制需要进一步研究。

总之,视网膜神经退化开始处于初期阶段。因此,早期预防和干预对糖尿病视网膜病变的治疗很重要。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有二元性的利益与此相关的手稿。

确认

这项研究受到了来自中国国家重点研发项目的拨款(2018 yfc1314000),中国国家自然科学基金(81774043,81774043,81900740),天津科技项目(17 zxmfsy00140)和天津市自然科学基金(19 jczdjc35300)。