Tangeretin High-Glucose-Induced抑制il - 1βil - 6, TGF -β1,人类RPE细胞VEGF的表达

文摘

Tangeretin,从柑橘类植物中提取的天然化合物,据报道有抗增殖,治疗糖尿病药,anti-invasive和抗氧化性能。然而,tangeretin的角色在糖尿病性视网膜病变(DR)是未知的。在目前的研究中,我们调查了tangeretin是否影响β白介素1 (il - 1的表达β)、白介素6 (il - 6)、转化生长因子β1 (TGF -β1)和血管内皮生长因子(VEGF)在人视网膜色素上皮(RPE)细胞high-glucose (HG)条件。我们的结果说明,HG诱导il - 1的水平βil - 6, TGF -β1,VEGF表达,tangeretin显著降低HG-induced il - 1βil - 6, TGF -β1,人类RPE细胞VEGF的表达。此外,tangeretin有效地抑制活化的蛋白激酶B(一种蛋白激酶)信号通路在HG-stimulated RPE细胞。因此,tangeretin可能博士的治疗作用。

1。介绍

糖尿病性视网膜病变(DR)视力损害和失明的主要原因是工作年龄的成年人(1]。持续高血糖症中发挥着重要作用的发展博士视网膜色素上皮(RPE)细胞被认为有助于博士的发病机制促炎细胞因子,炎症介质,趋化因子也参与博士的发病之前的研究表明,高水平的β白介素1 (il - 1β)检测在糖尿病动物的视网膜2)和患者增生性玻璃体的博士(PDR) [3]。此外,高水平的白介素6 (il - 6)的玻璃也发现PDR患者或糖尿病性黄斑水肿4- - - - - -6]。

转化生长因子β(TGF -β)据报道,参与分化、迁移、增殖、凋亡和细胞外基质分子的积累在不同细胞类型(7]。TGF -β关键的中介和监管机构,与眼组织的病理生理过程开发或修复(8- - - - - -11]。TGF -β也被认为是参与TGF -博士的发展吗β诱导血管内皮生长因子(VEGF)人类RPE细胞分泌的一个关键的角色在neovascularisation糖尿病眼病(12]。VEGF是一个多功能分子是由一些细胞在糖尿病视网膜(13]。VEGF可以引发许多糖尿病引起的视网膜血管改变,包括血管渗漏、毛细管nonperfusion,视网膜neovascularisation [12,13]。高血糖症与VEGF的upregulation博士。

Tangeretin,提取柑橘类水果的皮,有多个药理特性,包括抗氧化、平喘药,抗炎和神经保护属性(14- - - - - -16]。据报道,tangeretin有有效的神经保护效应对pilocarpine-induced发作(17和减毒脑损伤大鼠模型18]。然而,tangeretin对博士的影响还没有被研究。因此,目前的研究表明,high-glucose (HG)诱导il - 1的表达水平βil - 6, TGF -β1,VEGF在人类RPE细胞。HG的磷酸化激活蛋白激酶B(一种蛋白激酶)在人类RPE细胞,和tangeretin HG条件下可以抑制一种蛋白激酶的磷酸化。此外,tangeretin显著抑制HG-induced il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF在人类RPE细胞。因此,tangeretin可能在博士的治疗作用。

2。材料和方法

2.1。试剂

Anti-Akt得到从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。il - 1βil - 6, TGF -β1,VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Abcam(美国Cambridge, MA)。LY294002得到来自Sigma-Aldrich /默克公司。

2.2。细胞培养

人类RPE细胞线(ARPE-19;crl - 2302)获得了来自美国文化类型集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM Gibco,大岛,纽约,美国;媒介与10%胎牛血清,补充100 ng / ml链霉素和100 U /毫升青霉素。这些细胞被维持在37°C的湿润孵化器有限公司5%₂。

2.3。MTT试验

MTT细胞生存能力进行了分析。人类的RPE细胞被镀成96孔板的密度 。治疗后与不同浓度的tangeretin(0、5、10、20和30μ米)24 h, MTT试剂被添加到每个和孵化4 h。中被删除,二甲亚砜(DMSO)添加到溶解甲瓒晶体。吸光度是阅读在使用标490海里。

2.4。实时聚合酶链反应(PCR)分析

从人类RPE细胞总rna提取使用试剂盒试剂盒。互补脱氧核糖核酸是准备使用RevertAid第一链cDNA合成装备(Fermentas,圣Leon-Roth,德国)。实时系统实时PCR是一式三份(Bio-Rad,慕尼黑,德国)。每个反应包含2.5μl cDNA、12.5μl Maxima SYBR绿色qPCR大师混合(美国Fermentas沃尔瑟姆,MA)和特定的引物(0.3μ每米),最后一个25的体积μl。引物如下:人类il - 1β5、前进 - - - - - -GGA CAA GCT GAG棉酚手枪GC-3和反向5 - - - - - -太极拳ATA太极拳TGT CCC TGG AG-3 ;人类il - 6, 5 - - - - - -TGG CTG AAA亚美大陆煤层气有限公司ATG手枪GCT-3和反向5 - - - - - -TCT GCA CAG CTC TGG GT-3总部 ;人类TGF -β1、前5 - - - - - -GCC gg ATA TGA GTT TGG GA-3和反向5 - - - - - -GGG TGC ATG TCT GCT有条件现金援助GT-3 ;和人类VEGF,向前5 - - - - - -亚美大陆煤层气有限公司插科打诨插科打诨GGC AGA ATC 3和反向5 - - - - - -ATC TGC ATG GTG ATG TTG GA-3 。反应条件是95°C 30年代,紧随其后的是39个周期95°C的5 s和60°C 30年代。RNA表达规范化GAPDH mRNA水平。

2.5。免疫印迹分析

治疗后,人类RPE细胞细胞溶解在radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲补充phenylmethylsulphonyl氟化物(PMSF)蛋白酶抑制剂。使用bicinchoninic酸测定蛋白质浓度是量化(BCA)。蛋白质样本加载10% sds - page凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔,Billerica的)。他们处理分析使用一个增强化学发光(ECL)检测系统(美国Amersham,阿灵顿高地,IL)。主要的抗体的稀释如下:anti-p-Akt稀释在1:2000年,和antitotal Akt是稀释1:1000。

2.6。ELISA分析

治疗后,样本收集。il - 1的蛋白水平βil - 6, TGF -β1,VEGF在文化上清液测定使用il - 1βil - 6, TGF -β1,VEGF ELISA包根据制造商的指示。

2.7。统计分析

执行统计分析使用一个单向方差分析(方差分析)其次是图基的测试。所有的数据表示为 (SD)。他们分析了使用SPSS 17.0(美国SPSS,芝加哥,IL)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Tangeretin对RPE细胞生存能力的影响

评估的细胞毒性效应tangeretin RPE细胞,细胞与不同浓度的孵化tangeretin(0、5、10、20和30μ米)24 h。MTT试验表明,tangeretin (30μ米)引起的细胞生存能力下降;然而,tangeretin浓度为5,10,20μ米不影响RPE细胞(图的可行性1)。

3.2。诱导il - 1βil - 6, TGF -β1,VEGF在HG RPE细胞的状况

我们检查了il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF在HG条件。人类的RPE细胞在DMEM培养包含正常葡萄糖(NG;5.5毫米)和高葡萄糖(30毫米)和暴露了24小时。实时聚合酶链反应和酶联免疫试剂盒数据显示il - 1增加mRNA水平βil - 6, TGF -β1,细胞中VEGF HG条件下(数字1(一)-1(d))。增加il - 1蛋白水平βil - 6, TGF -β1,VEGF也HG条件下观察到的细胞(数字2 (e)- - - - - -2 (h))。

3.3。HG的效果和一种蛋白激酶信号通路在人类Tangeretin RPE细胞

检查HG和tangeretin一种蛋白激酶信号通路的影响,人类的RPE细胞在DMEM培养包含NG(5.5毫米)或HG(30毫米),暴露10分钟或20分钟,有或没有预处理与20μM tangeretin 30分钟。免疫印迹分析表明,HG可以激活一种蛋白激酶的磷酸化RPE细胞。一种蛋白激酶的磷酸化被预处理与tangeretin HG条件下20分钟(图3)。

3.4。Tangeretin和Akt抑制剂LY294002抑制HG-Induced il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF在人类RPE细胞

有发现,HG促进il - 1的表达βil - 6, TGF -β1、VEGF诱导的一种蛋白激酶磷酸化人RPE细胞,然后检查HG-induced tangeretin是否影响il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF。此外,我们研究是否激活一种蛋白激酶的磷酸化HG-induced il - 1的表达中起着至关重要的作用βil - 6, TGF -β1,VEGF在RPE细胞。使用酶联免疫试剂盒和实时PCR鉴定,HG-induced il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF是抑制了tangeretin剂量依赖性的方式在人类RPE细胞(数字4和5)。与此同时,RPE细胞的预处理LY294002抑制HG-induced il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF(数字6和7)。

4所示。讨论

高血糖症是一种最重要的发起者博士持续高血糖症的发病机制可以移植生长因子,细胞因子和其他分子。研究表明,il - 1的水平β和il - 6是调节玻璃的PDR患者(2- - - - - -6]。在这项研究中,我们选择了il - 1β和il - 6作为我们的目标基因,研究对HG-induced tangeretin是否影响il - 1的表达β和il - 6。我们证明了HG显著增加il - 1的感应β和il - 6在RPE细胞暴露于30 mM时葡萄糖24 h。有趣的是,tangeretin显著降低il - 1的表达β和人类RPE细胞il - 6的情况下30 mM葡萄糖存在剂量依赖的相关性,表明tangeretin可以抑制细胞因子分泌HG条件下人类RPE细胞。

TGF -β,一个多功能的细胞因子,调节关键细胞生物学行为,如迁移、分化和凋亡。TGF -β报告中最重要的一个配体在视网膜纤维化疾病的病理过程,包括PDR、增生性玻璃体(PVR)和早产儿视网膜病变(ROP) [19,20.]。此外,TGF -β被认为是导致视网膜下的收缩和外层膜PVR和PDR患者20.]。neovascularisation VEGF是一个强有力的血管生成刺激器,它促进血管渗透性。VEGF的发病机制的研究中起着至关重要的作用[博士21- - - - - -23]。高水平的VEGF在人类和动物的报告与样品的开发和进展(博士24- - - - - -26]。我们的数据表明TGF -的表达β1和VEGF在RPE细胞调节的时候,接触到30毫米葡萄糖24 h。此外,tangeretin显著降低HG-induced表达式TGF -β1和VEGF在人类RPE细胞剂量依赖性的方式。研究结果表明,tangeretin会抑制TGF -的表达β1和VEGF在人类RPE细胞HG条件下。

磷酸肌醇的3-kinase PI3K / Akt信号通路起着重要的作用在博士和许多细胞功能,包括增殖、迁移,入侵,附着力,新陈代谢,和生存27]。PI3K通路与正常血管的形成(28]。有研究报道,Akt通路的抑制可能抑制病理vascularisation [29日和许多肿瘤类型30.]。我们之前的研究表明,HG一种蛋白激酶的磷酸化,激活和抑制PI3K / Akt信号通路可能抑制细胞外基质分子的表达在HG条件下在RPE细胞(31日]。在这项研究中,我们发现抑制Akt废除HG-induced il - 1βil - 6, TGF -β1,人类RPE细胞VEGF的表达。本研究的结果还表明,30毫米葡萄糖也一种蛋白激酶的磷酸化,激活和20μM tangeretin显著抑制RPE细胞的一种蛋白激酶的磷酸化HG条件下。这些发现表明,tangeretin可以抑制il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF通过一种蛋白激酶信号通路。

在未来的研究中,所扮演的角色在动物模型体内tangeretin应该调查。此外,参与炎症和氧化应激和其他途径激活高葡萄糖等物,P38 MAPK和NF -κB应该进行。这些都是本研究的局限性。总之,据报道,tangeretin多功能属性,包括anti-invasive、抗增殖、antimetastatic,治疗糖尿病药和抗氧化特性。然而,博士tangeretin的作用还不清楚。目前的研究表明,HG诱导il - 1的水平βil - 6, TGF -β1,VEGF表达和一种蛋白激酶的磷酸化和tangeretin显著降低HG-induced il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF在人类RPE细胞。因此,tangeretin显著降低细胞因子分泌在HG环境和扩展我们的知识在糖尿病视网膜病变的治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

附加分

突出了。高葡萄糖诱导il - 1的表达βil - 6, TGF -β1,VEGF在人类RPE细胞。Tangeretin抑制活化的蛋白激酶B(一种蛋白激酶)信号通路在人类high-glucose-stimulated RPE细胞。Tangeretin显著抑制high-glucose-induced il - 1βil - 6, TGF -β1,人类RPE细胞VEGF的表达。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突在这个研究。

确认

本研究支持的部门河南省科技(162300410112)。

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