文摘
背景。糖尿病(DM)已成为全球最常见的一种慢性代谢疾病。由于增加患病率和各种并发症,糖尿病DM患者带来了一个巨大的经济负担。如今,越来越多的研究揭示了疾病和肠道微生物群落之间的关系。我们旨在探索的变更在T2DM病人中肠道微生物的组成和功能。方法。总共有137糖尿病患者,179岁,准确性健康人样本中心的健康对照组选择在郑州大学第一附属医院被分成DM组和诈骗集团,分别。我们收集他们的静脉血进行实验室测试和粪便样本16 s rRNA测序。两组之间的比较包括肠道微生物的组成和功能。结果。我们发现α细菌类群的多样性DM组相比有明显的降低,诈骗集团。在门级,DM组有明显的减少拟杆菌门和显著增加变形菌门,放线菌,和Verrucomicrobia。在属级,拟杆菌和普氏菌下降最时Escherichia-Shigella,Lachnospiraceae_incertae_sedis,Subdoligranulum,肠球菌,克雷伯氏菌DM组有不同程度的扩张。中华民国246年基于最佳辣子鸡非常高的测试效率92.25%的AUC的训练集和测试集的90.48%。作为代谢功能的预测,预测DM患者的肠道微生物组是更积极地环境信息处理和人类疾病但少的新陈代谢。结论。我们观察到改变肠道微生物的组成和功能的DM组。这些变化可能为DM患者提供新的治疗策略和新的研究目标。
1。介绍
糖尿病(DM)是全球最常见的代谢性疾病之一,特点是高血糖。因为它的患病率不断上升,糖尿病已经成为一个世界性的健康问题带来巨大的财政负担。国际糖尿病联合会宣称糖尿病会影响全球6.42亿人到2040年。数以百万计的DM患者有各种并发症如视网膜病变、肾病、神经病变,引起巨大的痛苦的病人。
肠道微生物群的参与越来越认可与近年来各种疾病有关。这些细菌寄生的生活在人类肠道可能表明主机处于疾病状态时肠道菌群的组成和比例发生了变化。一些研究发现糖尿病和肠道微生物组成之间的关系(1]。更重要的是,如今gut-kidney轴是一个新的研究方向,这可能表明肠道微生物之间的关系和肾疾病包括糖尿病肾病(2]。
根据最近的研究,DM和肠道微生物之间的关系引起了越来越多的关注。药效学的影响近年来层提取高脂肪饮食和低剂量的体外实验2型糖尿病大鼠进行检测时,发现和结果表明,近年来层提取可能影响2型糖尿病通过调停host-microbial代谢轴(3]。几个报告微生物代谢物相关的肠道微生物群与事件的风险增加有关2型糖尿病、减少胰岛素分泌和胰岛素敏感性4]。
然而,某些肠道微生物群的参与和糖尿病之间的关系还不清楚。DM患者的细菌群落的改变也不是完全学习。肠道微生物的多样性是如何发挥作用的过程中,糖尿病也有待探索。我们的项目的目的是发现肠道微生物组的差异DM患者和健康对照组之间的组成和功能。通过对肠道菌群的分析,我们的目的是提供新的诊断或治疗糖尿病的有效目标。
2。设计和方法
2.1。伦理批准
所有的科目包括在这个项目提供书面知情同意。郑州大学第一附属医院伦理审查委员会授予伦理研究批准。
2.2。参与者识别和样本收集
在这个以人群为基础的横断面研究,共有137名患者(18 - 75岁)与DM登记,承认在郑州大学第一附属医院从2018年10月到2019年10月。糖尿病的诊断标准如下:(1)空腹血浆葡萄糖的两倍 ,(2)两次口服葡萄糖耐量试验( ),和(3)糖尿病症状(多尿症,口渴,喝更多的水,和不明原因的体重减轻)伴随着两次随机的血液 。所有注册的DM组由DM患者进行以下研究。
粪便样本的179岁的准确性得到了健康对照组的健康人样本中心郑州大学第一附属医院。诈骗集团由这些健康的志愿者与DM组进行比较。排除标准如下:(1)长期抗生素应用,消化系统疾病(2),(3)感染的近代史。
除了粪便样本,我们也获得临床资料包括基本信息(年龄、性别、SBP和菲律宾)和实验室检查(表皮生长因子受体,Hb,迷奸、铬、铝青铜,24 h-pro,格兰,LYM,和T / Cr)从我们的公共临床数据库。
所有参与者的粪便样本和静脉血样采集12 h(隔夜后禁食。被收集后,所有样本暂时存储在冰袋,马上带到实验室中冻结在-80°C环境中2小时进行进一步分析。
2.3。DNA提取、16 s rRNA放大和基因测序
DNA提取使用E.Z.N.A.完工®粪便DNA工具包。DNA提取的过程被称为一项研究的彭et al。5]。
16 s rRNA V3-V4高度保守区,由PCR扩增,得到纯化扩增子MiSeq测序。所有程序都完成上海该款生物医学科技有限公司使用MiSeq平台(美国Illumina公司Inc .)根据制造商的协议。最后,我们将我们的数据与16 s细菌和古细菌核糖体数据库来确定更改。
2.4。注释的OTU
嵌合序列被移除后使用UPARSE(7.1版本,http://drive5.com/uparse/),我们分类操作分类单位(辣子鸡)基于相似度97%。分析16 s rRNA基因序列的系统发育关系,我们使用RDP分类器(http://rdp.cme.msu.edu/)对席尔瓦(SSU123) 16 s rRNA数据库有信心阈值的70%。
2.5。生物信息学分析
香农稀疏曲线是用来估计是否OTU丰富基本上接近饱和在所有样品中的微生物多样性和比较DM和反对团体。我们使用了非参数Shannon-Wiener (SW)多样性指数和辛普森多样性指数来评估样本多样性指标。的非参数Mann-Whitney测试是用来比较OTU两组的差异。维恩图被用来比较不同的肠道菌群基于两组之间的辣子鸡。使用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验。加权和未加权的UniFrac QIIME计算。此外,主坐标分析(PCoA)生成的情节也QIIME管道未加权的形象化UniFrac不同。置换多元方差分析(PERMANOVA)是用来检查两组使用的统计学意义差异10000排列。我们随后使用线性判别分析(LDA)效果(LEfSe)检测微分分类单元级别的丰度。分类单元显示如果 与一个值< 0.05。系统未被注意的国家调查社区的重建(PICRUSt)是用于识别显著不同的代谢途径和DM和反对团体之间的同源组相比KEGG数据库( 与一个值< 0.05)。
2.6。肠道Microorganism-Based民国建筑
为了确保是否肠道菌群可用于区分糖尿病患者与健康人,参与者被随机分为测试组( , )和培训集团( , )。我们使用LEfSe评估所有辣子鸡获得最佳的辣子鸡 。差异的基础上获得两组辣子鸡,我们试图建立操作特性曲线(ROC)来验证诊断肠道微生物群的功效在DM患者和健康对照组。ROC曲线下的面积(AUC)值生成R (http://www.R-project.org/)。
3所示。结果
在我们的项目中,我们收集了316名志愿者的粪便样本包括137名糖尿病患者和179名健康对照组。根据他们不同的生物信息学分析和临床诊断,总共316份粪便样本被分成了DM ( )或反对( )组。DM之间的微生物群落和反面比较发现两组的差异。的新陈代谢,我们识别不同KEGG(京都基因和基因组的百科全书)通路和同源组(Ko) DN和MN患者之间通过PICRUSt(系统发育调查社区重建的未被注意的状态)。
3.1。基线特征的参与者
实验室检查的结果如表所示1。SBP、菲律宾、迷奸,格兰,24 h-pro, T / Cr观察DM组显著增加( ),Hb和胆红素有明显降低DM组( )。然而,在表皮生长因子受体无显著统计学差异,两组之间的Cr, LYM ( )。
3.2。微生物多样性的DM或反对
我们分析了DM的微生物多样性和反对团体。Shannon-Wiener曲线基于辣子鸡已经持平,表明我们的测序深度已经足够(图1(一))。相似和重叠的细菌群落组成两组的维恩图(图所示2 (b))。利用香农和辛普森指数,我们发现α细菌类群的多样性DM组相比,在减少诈骗集团(数字1 (c)和1 (d))。计算加权UniFrac算法后,β多样性的两组如图1 (e)通过PCoA。结果表明,PC1的组件和PC2占总方差的83.65%比例在两个维度。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。DM在肠道微生物组成的差异或反对团体
肠道微生物组的平均相对丰富的门和属水平两组数据所示2(一个)和2 (b)。
门级别的,有一个明显的下降拟杆菌门DM组相比Con组。然而,变形菌门和放线菌DM组有明显增加(图2(一个))。
在属的水平上,拟杆菌被发现有一个相当大的减少DM,紧随其后的是吗普氏菌和Lachnospiraceae_incertae_sedis。然而,相比Con组,Escherichia-Shigella,Subdoligranulum,Akkermansia,肠球菌被发现丰富了DM组(图2 (b))。
通过LEfSe分析,肠道微生物组显著差异在丰富门和属水平数据所示2 (c)和2 (d)。在属级,共36个基因的细菌有显著差异的LDA分数超过2.0,甚至15人一个LDA分数超过3.6。
3.4。ROC曲线下面积(AUC)值
通过LEfSe分析,我们评估共有3115个辣子鸡获得最佳的辣子鸡 。结果,我们得到246辣子鸡是不同的两组之间丰富的 。基于这些微分辣子鸡,我们建立了中华民国,以评估是否有差异DM患者和健康人之间的肠道微生物组。令人惊讶的是,我们发现,这些246年最佳辣子鸡已经很高的测试效率与ROC曲线下面积(AUC) 92.25% (95% CI: 88.71%至95.79%;截止值:352559年,灵敏度:0.9222,特异性:0.7581;图3(一个))后的训练集,我们随后验证测试集相同的方法,结果表明,相似的效率与ROC曲线下面积(AUC) 90.48% (95% CI: 84.39%至96.58%;灵敏度截止值:232645.5:0.7872,特异性:0.9091;图3 (b))。
(一)
(b)
3.5。肠道微生物的功能改变DM和反对团体
PICRUSt用于识别不同KEGG通路和同源组(Ko) DM和反面组之间(数字4(一)和4 (b))。Con组相比,DM组的肠道微生物的功能改变是巨大的。六个主要代谢途径中,环境信息处理和人类疾病观察DM组显著增加( )。然而,新陈代谢,基因信息处理和有机系统预测更活跃在诈骗集团( )。例如,它更多的是活跃在膜运输和信号转导DM组,翻译和能量代谢降低。同时,DM组有更多的改变在环境信息处理等异型生物质降解和代谢。
(一)
(b)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们分析了16 s rRNA测序数据的粪便微生物个体组成的群体的DM患者和健康对照组。结果表明,生态失调的肠道微生物在DM组相比Con组。然后,我们分析了差异和相似的肠道微生物组两组,收购了微分细菌门和属的水平。微生物的功能改变也KEGG的研究在某种程度上,这可能提供了一个新的目标在延缓或治疗糖尿病。除了肠道菌群的组成,我们还探讨了肠道微生物和实验室检查结果之间的关系,旨在为临床治疗提供方向。更重要的是,探索对细菌基因组的功能是另一个创新的研究,试图为未来的研究提供新思路。
通过16 s rRNA基因测序,两组的多样性分析显示,DM组的多样性显著降低Con组相比,这是符合其他研究[6]。解释这一现象可能是糖尿病患者的肠道微生物区系障碍和二甲双胍的应用程序,这可能会加重肠道微生物在DM患者的失调。
在门层面,我们发现拟杆菌门很明显降低DM组,按照王等人的研究。7]。尽管如此,变形菌门,Verrucomicrobia,放线菌被发现在不同程度增加。厚壁菌门有两组之间没有显著差异。相关研究表明,肥胖和血脂异常患病率低门拟杆菌门的增加厚壁菌门和拟杆菌门比(8),这可能是一个因素在糖尿病患者血脂水平的变化。
更重要的是,我们发现更多在属级微生物丰度的变化,包括减少的拟杆菌,Blautia,Faecalibacterium,毛螺菌属,Pseudobutyrivibrio,Roseburia的增加Escherichia-Shigella,Subdoligranulum,Akkermansia,肠球菌,双歧杆菌属,克雷伯氏菌,乳酸菌,Megasphaera通过LEfSe的 。
门的减少拟杆菌门主要是由于穷人丰富的拟杆菌DM组在属水平。拟杆菌基因组的能力而闻名,可以各种糖发酵成短链脂肪酸(SCFAs) (9]。在SCFAs,丙酸可以减少内脏脂肪。乙酸和丙酸与相关机制维持或改变葡萄糖稳态(10]。因此,我们猜测的减少拟杆菌是一个重要的原因导致葡萄糖DM患者的体内平衡失调。
Lachnospiraceae是一种厌氧,孢子形成的细菌,这是一个最丰富的人类肠道微生物组。后帮助宿主消化一些碳水化合物和纤维,一些成员的属能产生丁酸在人类结肠。据报道,与2型糖尿病动物模型,丁酸中发挥了关键作用,诱导glp - 1在小肠生产和保护肠粘膜屏障功能,改善葡萄糖稳态主机(11]。更重要的是,受益于它的能力,抑制某些蛋白质产生炎症,促进抗炎丁酸产生了很大的影响。特别是,它有助于控制炎症免疫反应通过调节T细胞可以促进炎症(12]。
类似于拟杆菌,Blautia,Faecalibacterium,Pseudobutyrivibrio,Roseburia,bacterium-producing短链脂肪酸(SCFAs)都是那么丰富的DM组。在一个多中心、随机、非盲临床试验,二甲双胍和中国草药配方显著增加coabundant组为代表Blautiaspp。,这明显与改善葡萄糖和脂质稳态(13]。
平均的相对丰度普氏菌被发现显著降低DM组,这似乎与雷特等不一致的研究(14]。尽管如此,普氏菌发现没有统计差异分析的进化分枝图LEfSe在我们的研究中。这可能是因为这的相对丰度普氏菌在几个样本DM患者在极低的水平。普氏菌也属于门拟杆菌门。这些差异的原因可能是不同的饮食。研究表明,大量的普氏菌在粪便与高纤维、高碳水化合物饮食摄入量(15]。高纤维的饮食可以改善葡萄糖体内平衡和增加普氏菌水平在粪便16]。普氏菌有大国发酵饮食多糖(17]。它也发挥了关键作用在肠道炎症18]。研究表明,普氏菌主要受体激活TLR2和诱导Th17 CD4 T细胞极化。此外,普氏菌也会影响诱导IL8由上皮细胞和白细胞介素6分泌,有利于Th17反应和中性粒细胞招募19]。受益于它的各种功能,普氏菌应该是一个有吸引力的候选人probiotic-based疗法在糖尿病的发展20.]。
也有一些丰富的属(Escherichia-Shigella,Subdoligranulum,Akkermansia,肠球菌,双歧杆菌属,克雷伯氏菌,乳酸菌,Megasphaera)丰富DM组。Escherichia-Shigella被发现增加大多数DM组的粪便样本,这是与先前的研究一致(21]。Escherichia-Shigella被认为是一种投机取巧的病原体对人类而言,这可能会产生各种促炎的组件(如脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN),最后引发宿主的免疫反应,导致不同程度的肠道炎症22]。更重要的是,作为促炎的细菌,Escherichia-Shigella接触到上皮完整性受损,导致慢性炎症和自身免疫反应,这可能增加患1型糖尿病的风险(23]。
Subdoligranulum厌氧,spore-free革兰氏阴性细菌。对其他疾病的研究,Subdoligranulum被发现与慢性炎症相关的免疫标记[紧密相关24]。
在过去的十年中,肠道共生菌Akkermansia muciniphila一个物种的Akkermansia,已经成为一个“肠道的哨兵”,这被认为是一个敏感的指标肠道通透性(25]。它对改善葡萄糖耐量有很大影响26),而肥胖有助于减轻炎症(27]。然而,与先前的观察,不一致Akkermansia被发现在DM组明显增加。的异常增加的原因Akkermansia可能是由于应用二甲双胍的糖尿病患者。研究表明,二甲双胍可以增加丰富的的应用Akkermansia在一个小鼠模型(28]。然而,饮食可能是另一种解释这一现象。Gurley等人报道,后提供水平的绿茶的茶多酚与那些被人类大量的Akkermansia muciniphila观察显著增加(29日]。我们观察到的异常增加是否可以归因于二甲双胍的影响应用程序和不同的饮食仍得到证实。
肠球菌和克雷伯氏菌是存在于人类肠道的条件致病菌。以前的研究发现肠球菌呈正相关,肥胖(30.),而肠球菌倾向于导致尿路感染时,主机有一个削弱免疫状态。克雷伯氏菌被认为是与肺部感染临床相关。我们猜测,由于肠道微生物区系紊乱在糖尿病患者中,他们两人抢更多的生存空间和营养。因此,他们发现了更丰富的DM组在我们的研究中。
双歧杆菌属和乳酸菌属一般被认为有益的细菌。在最近的研究中,饮食开心果恢复正常菌群和增强等有益微生物的存在双歧杆菌属和乳酸菌属在体外糖尿病的大鼠模型31日]。肥胖老鼠,都有双歧杆菌属和乳酸菌被发现有一个明显的减少32]。侯赛因和他的同事发现乳杆菌LB818一个物种的乳酸菌,可以有效地改善身体体重增加和减少总脂肪通过调节HFD-fed小鼠空腹血糖水平降低丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG),提高血清中高密度脂蛋白水平和减少沉积在肝脏的脂肪滴(33]。
Megasphaera还发现增加妊娠糖尿病患者(34]。在研究Gaike et al .,据报道,丰富的Megasphaera增加在DM患者长期使用药物积极与空腹血糖和糖化血红蛋白(35]。我们推断这可能是欠的发酵果糖和乳酸的功能Megasphaera。
基于这些歧视性微生物辣子鸡,我们建立了中华民国AUC高(92.25%),训练集来评估微生物差异DM组和诈骗集团。更重要的是,我们在测试组验证结果,成功地获得了类似的结果AUC的90.48%。测试效率高的中华民国不仅可以被用来证明微生物不同的两组还区分DM患者与健康人。
至于预测细菌的代谢功能,肠道微生物在DM组预测更活跃在环境信息处理和人类疾病。我们推断,增加环境信息处理与膜运输的增加有关。随着肠道微生物组成的改变,肠道如pH值和湿度的环境也发生了变化。因此,肠道微生物在环境信息处理会更活跃。在人类疾病的增加,这可能是主要是因为等机会致病菌的生长Escherichia-Shigella和克雷伯氏菌,这将增加宿主病的风险。然而,观察代谢降低DM组。可能是相关的减少生产和短链脂肪酸代谢前面提到的。探索关于改变肠道微生物的代谢功能可能为治疗2型糖尿病提供新思路。
我们的研究有许多优势。首先,我们的项目有最大样本量据我们所知,减少个人误差对结果的影响。更重要的是,我们结合肠道微生物与实验室检查和讨论了影响由于改变糖尿病患者的菌群组成。我们也试图探讨肠道微生物的功能改变,所以我们希望为2型糖尿病提供新的治疗目标。
另一方面,也有一些局限性。我们没有多中心外部验证减少种族和饮食影响的结果。由于缺乏动物和细胞学实验中,我们的研究无法解释变更的机制和肠道微生物的影响。
5。结论
总之,粪便微生物群落的二型糖尿病患者有明显的改变。我们的研究发现肠道微生物的变化在2型糖尿病患者的组成和功能。中华民国的结果充分证明我们的结果,甚至可能被用来帮助区分糖尿病患者与健康人。通过确定肠道微生物群改变糖尿病,我们希望提供新的治疗策略,调节肠道微生物群的组成和功能来帮助在血糖控制。
数据可用性
本研究的数据是可用的要求从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
赵薛和一丁张同样这项工作。雪赵和一丁主任是负责研究设计、方法选择和编写初稿。瑞雪郭和卫浴负责画表和数据在这个研究。吴Fanliang张和冯负责数据分析。金商负责审查和编辑稿件。所有作者贡献的解释数据和文章的重要修订和批准。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
我们感谢所有作者参与了研究。我们感谢所有志愿者捐赠的样品我们的研究。这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81700633)。