文摘
糖尿病患者愈合的伤口造成沉重的经济负担和受损患者的生活质量。人类皮肤成纤维细胞(HDF),这是一种重要的效应细胞在伤口愈合过程中,代表不同的生物学行为在正常和糖尿病皮肤。有鉴于此,我们试图探索功能变化在糖尿病皮肤取出HDFs,试图找出“集线器”基因调节糖尿病HDFs和可能的潜在治疗靶点糖尿病伤口愈合。我们在地理数据库搜寻相关的microrna (GSE68185 GSE84971)和信使rna (GSE49566 GSE78891)配置文件。消除后批处理效果和识别差异表达基因(度),我们应用富集分析,发现3 microrna和30 mrna在糖尿病HDFs差异表达。富集分析表明,这些基因是伤口愈合密切相关,例如,细胞外基质(ECM)组织、血管生成、细胞增殖和迁移。随后,我们构建了基因相关的网络度识别中心基因通过合并蛋白质交互网络,基因coexpression加权网络,并预测miRNA-mRNA监管网络。基于基因关联网络,我们确定了前三中心基因:mir - 181 a - 5 - p, POSTN, CDH11。其中,POSTN预测的目标mir - 181 - 5 - p和应该与CDH11官能团。最后,我们验证了基因表达模式的中心由体外量化实验glucose-cultured HDFs。 Our study suggested that miR-181a-5p possibly plays a key role in modulation of HDF behaviors during the diabetic state. However, the effects and mechanisms of miR-181a-5p in high glucose-cultured HDFs remain to be explored in the future.
1。介绍
糖尿病是一种慢性代谢疾病,给患者带来了彻底的病理生理变化,如血糖水平高,干扰水和电解质平衡,损害炎症和免疫反应。未受控制的糖尿病可以导致各种皮肤的变化,如持续的炎症反应和缺血状态,导致无法愈合伤口。糖尿病患者愈合的伤口是糖尿病患者常见的并发症。在严重的情况下,糖尿病患者愈合的伤口在下肢需要截肢,占大约70% nontraumatic截肢根据以前的出版物(1,2]。
糖尿病引起的变化发生在吞噬细胞、血小板内皮细胞,角质细胞,重要的是真皮成纤维细胞。真皮成纤维细胞是主要负责生成结缔组织细胞和从伤病中恢复。在伤口愈合过程中,成纤维细胞迁移到伤口床和产生生长因子和细胞外基质(ECM)促进肉芽组织成熟。刺激后的TGF -β1由巨噬细胞分泌,成纤维细胞发生表型改变,改变myofibroblasts负责伤口收缩。
糖尿病皮肤,皮肤成纤维细胞的数量减少,和分泌基质的能力也是妥协(3]。真皮成纤维细胞功能受损的原因在糖尿病伤口皮肤伤口可以解释为不平衡的微环境,是由巨噬细胞,endothelia, ECM。然而,从皮肤分离后,由糖尿病引起的纤维母细胞基因表达差异坚持high-glucose体外条件(4]。因此,真皮纤维母细胞的细胞学变化的原因不应该完全归因于不平衡的伤口微环境;他们也可能构成纤维母细胞的异常基因表达模式本身。
多个基因被发现在糖尿病皮肤成纤维细胞特异表达5]。然而,在差异表达基因(度),而最有助于促进糖尿病皮肤成纤维细胞的细胞学变化,每度之间的关系是什么,是否存在“集线器”基因测定糖尿病患者皮肤成纤维细胞中发挥关键作用仍有待探讨。
在目前的研究中,我们分析了发表microrna的培养的人皮肤成纤维细胞和mRNA表达的分析数据(HDFs)与糖尿病患者。消除后批影响从不同的研究和识别度,我们应用富集分析和GSEA理解糖尿病状态带来的功能变化。然后,在试图找出“集线器”基因可能掌握糖尿病HDFs的分子调控和糖尿病伤口愈合的潜在的治疗目标,我们构建了基因相关的网络度通过合并(PPI)蛋白质相互作用网络,基因coexpression加权网络(WGCNA),并预测miRNA-mRNA目标监管网络。最后,我们测试了我们的分析结果确定差异表达microrna的表达模式和中心蛋白编码基因在高glucose-cultured HDFs。
2。材料和方法
2.1。数据源
我们搜查了地理数据集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)使用“糖尿病”和“伤口或皮肤或皮肤或皮肤”作为搜索条件;每个搜索结果的总结与研究设计手动审查。研究比较信使rna或microrna的表达谱的真皮成纤维细胞从糖尿病患者非糖尿病的患者在我们的分析中。研究夹杂物后,我们得到2 mRNA表达分析数据集,GSE49566 (GPL8300平台)和GSE78891 (GPL15207平台),和2个microrna的表达分析数据集,GSE68185 (GPL17537平台)和GSE84971 (GPL17537平台)。为了避免混杂因素的影响伴随着糖尿病溃疡,如感染和组织接触,只有纤维母细胞样本来自糖尿病溃疡的糖尿病皮肤而被用于我们的分析。因此,总共11糖尿病烹饪和纤维母细胞(DSF)样品和9非糖尿病患者皮肤取出纤维母细胞(NDSF)样本包含在mRNA表达谱分析;7 DSF样品和7 NDSF样本包含在microrna的表达谱分析。数据集被下载从GEO数据库;系列矩阵文件被用于分析。所有表达信号值的每个数据集log2-transformed正常化。
2.2。度鉴定和功能富集分析
从不同的研究,消除一批影响mRNA和microrna的数据,分别使用“上海广电”的R包识别分析的微分表达式。“limma”包被用来识别度。对于度过滤,表达式值褶皱变化(FC) 和 被用作截止值。
基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析差异表达mrna进行了利用“clusterProfiler”包。此外,REACTOME通路数据库也用来标注识别度。去途径接受 被认为是极大地丰富。功能富集分析差异表达microrna的目标也进行了了解这些microrna的监管职能。目标基因的差异表达microrna被母星v3.0预测(6)(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php从多个target-predicting年代),它提供了预测结果数据库。度函数的广义理解,去接受 被用于分析microrna的目标。维恩图去条款和KEGG通路的microrna的目标是吸引发现差异表达microrna的常见功能。
基因集富集分析(GSEA)应用使用mRNA表达分析数据来验证真皮成纤维细胞的主要功能变化引起的糖尿病状态。GSEA是基于“c5。英国石油公司”、“c5。cc”、“c5。曼氏金融”、“c2.cp。kegg”和“c2.cp。reactome“基因集合(MSigDB Broad研究所,剑桥,妈,美国)。规范化浓缩评分(NES)计算每个基因集。数量排列的GSEA软件(https://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)被设置为1000,置换类型设置为“基因集。”错误发现的基因集 被认为是极大地丰富。
2.3。基因相关网络分析
度从mRNA分析研究分析了构建蛋白质相互作用(PPI)网络通过使用搜索工具提供的字符串数据库(https://string-db.org/)。相互作用与信心 包括后续网络分析。WGCNA差异表达分析mrna进行了使用“WGCNA”包。对于WGCNA coexpression网络建设,经验值使用。Cytoscape网络出口阈值设置为0.3。度,确定目标基因的差异表达microrna构成miRNA-mRNA监管网络。miRNA-mRNA监管网络,PPI网络,WGCNA coexpression网络度被集成的基因关联网络。基因相关网络可视化使用Cytoscape软件(v3.7.1;http://cytoscape.org/)。中心基因Cytoscape CytoHubba插件的标识。CytoHubba得分排名的基因关联网络中的每个节点由12个不同的内置方法计算,平均排名是用来识别基因中心。MCODE插件被用来提取的基因簇中最相关的基因关联网络。为了进一步确定可能的microrna控制中心蛋白编码基因的表达(7,8),我们使用两个预测工具DIANA-microT-CDS [9]和miRWalk [10),除了母星v3.0。排名前100的预测每个预测工具,microrna的可能目标每个中心编码蛋白质的基因池,然后作为Cytoscape miRNA-mRNA网络。
2.4。细胞培养
成人人类皮肤成纤维细胞(美国ScienCell HDF-a)获得ScienCell研究实验室。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(美国Gibco DMEM)补充10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1% penicillin-streptomycin解决方案(英国Gibco)。所有文化都保持在37°C和5%湿润孵化器有限公司2的气氛。70%汇合的纤维母细胞文化保持24小时在生长培养基的细胞周期同步。为进一步实验,细胞处理3种不同浓度的葡萄糖:5.5毫米,25毫米,60毫米72小时。
2.5。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)的分析
总RNA提取使用Eastep™超级总RNA提取工具包(Promega、上海、中国)按照制造商的指示。提取RNA的浓度和完整性检查,紫外分光光度计。使用RevertAid执行逆转录合成第一链cDNA工具包(美国热费希尔科学)。rt - pcr进行的量化与ABI StepOne qPCR系统(生活技术,美国)使用Maxima SYBR®绿/火箭qPCR大师混合(美国热费希尔科学)。为定量PCR引物设计使用底漆总理5.0软件根据基因库的序列数据。的引物序列mir - 181 a - 5 - p, mir - 143 - 3 - p, miR-21-5p, CDH11, POSTN列出补充材料(可用在这里)。使用的结果进行了分析ΔΔC (t)的方法。
2.6。统计数据
所有实验值被表示为 。组间差异的重要性确定使用单向方差分析其次是事后分析。被认为是在统计意义 。统计分析使用统计产品与服务解决方案软件进行V22.0 (SPSS、美国)。
3所示。结果
mrna表达的差异与细胞外基质有关组织缺氧反应,细胞粘附、增殖、分化、和发展。
消除后的批处理影响GSE49566 GSE78891数据集,我们合并两个数据集,并获得30个差异表达mrna在培养HDFs的糖尿病患者与正常相比个人。度如图的热图1。在30个差异表达mrna, 12 mrna表达下调和18 mrna调节。GO术语相关的细胞组件丰富了细胞外基质和蛋白质的细胞外基质。去条款相关的生物学过程主要是丰富的缺氧反应,细胞粘附、细胞增殖、分化、和多个器官系统和组织的发展,例如,骨骼系统,结缔组织和泌尿生殖系统。没有去条款相关的分子功能或KEGG途径明显富集。然而,根据REACTOME数据库,细胞外基质组织的途径,分子与弹性纤维,弹性纤维形成明显丰富(图2)。
(一)
(b)
(c)
3.1。Ubiquitylation Endomembrane系统活动,细胞粘附是差异表达microrna的共同目标
基于分析GSE68185 GSE84971数据集,3 microrna, mir - 181 a - 5 - p, mir - 143 - 3 - p,和miR-21-5p发现差异表达。所有的3 microrna调节糖尿病HDFs。microrna的目标基因预测利用母星V3.0数据库显示,6003年目标基因mir - 181 - 5 - p 4068目标基因mir - 143 - 3 - p,和2781年miR-21-5p目标基因。
根据丰富的条件,在细胞组件,细胞前缘和细胞基质结,都与细胞运动和附着力,共同丰富的所有目标基因(图3 microrna3)。分子功能和生物过程,3 microrna的目标基因共同丰富条款,参与ubiquitin-like蛋白转移酶活动,nucleoside-triphosphatase监管活动,细胞粘附,endomembrane系统组织,利用自噬的机制和过程。总之,丰富的这些microrna的分析目标基因表示,所有3 microrna共同去参与细胞粘附,endomembrane系统活动和ubiquitylation。
(一)
(b)
KEGG分析还显示,有普遍的途径(表3 microrna的目标基因1),例如,内吞作用、细胞粘附、肿瘤(神经胶质瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌等)信号和细胞凋亡。一些分子途径,如MAPK、ErbB, mTOR,和胰岛素信号通路,也3 microrna的共同目标。其中,ErbB和MAPK信号通路被REACTOME通路分析进一步证实了共同的目标路径。
3.2。GSEA显示特异表达膜运输、拓扑错误的蛋白质反应,转录和翻译,在糖尿病HDFs和物质代谢
GSEA使用整个mRNA表达分析数据进一步证明在培养HDFs糖尿病带来的功能变化。我们使用术语,KEGG通路,REACTOME通路预定义的基因集(图4)。在糖尿病HDFs, 14去相关的预定义的基因集合蜂窝组件的内容丰富,包括涂膜,spliceosomal复杂,核核小体,翻译始发前复杂。随着生物过程相关条款,3基因的细胞反应集拓扑错误的蛋白质,内质网,细胞核信号和翻译起始丰富。没有分子function-related在糖尿病HDFs条款明显富集。基于GSEA KEGG途径,我们确定了氨酰生物合成的基因集合在糖尿病HDFs大大丰富。然而,REACTOME pathway-based GSEA发现54基因集,主要是参与途径的基因转录和翻译,膜贩运,无处不在的退化,展开蛋白质反应,抗原表达,以及WNT NF -κB、活跃和ATF4信号,大大丰富了。
(一)
(b)
在正常HDFs, 3蜂窝组件的内容丰富,包括初级溶酶体,钾,阳离子通道复杂。25的分子功能丰富,参与离子通道活动和受体信号的活动。随着生物过程相关条款,14个基因集富集,与代谢过程,化学反应和抗原刺激,和G protein-coupled受体信号通路。GSEA KEGG通路的11个基因集,涉及代谢(营养、类固醇、维生素a和药物),ABC转运蛋白,刺激神经组织的中的互动,和哮喘,大大丰富了在正常的HDFs。3 REACTOME基因集大大丰富了生物氧化反应途径,第一阶段功能化的化合物(物质代谢密切相关),和PIP2水解的影响。
总的来说,丰富的功能基因在糖尿病HDFs主要是归因于膜运输、拓扑错误的蛋白质,转录和翻译。然而,丰富的功能基因在正常HDFs主要是归因于物质代谢,离子通道活动,和G protein-coupled受体信号通路。
3.3。基因相关网络分析表明,mir - 181 - 5 - p度中起着关键作用
可视化的整个关系度,度的基因关联网络是由合并PPI网络加权coexpression基因网络,miRNA-mRNA目标监管网络。如图5(一个),网络由68基因和基因基因相关性。基因的关联网络,mir - 181 - 5 - p度最大的节点,这表明mir - 181 a - 5 - p与度的最大数量。结合平均秩方法和12种不同的内置的评分方法,CytoHubba POSTN, mir - 181 a - 5 - p,和作为前三中心CDH11基因(图5 (b))。使用MCODE程序,此外,通过分析我们发现一群彼此是最相关的基因,包括POSTN CDH11, EDIL3, PLXNC1 CH25H, RUNX3。这个结果表明,中心基因POSTN和CDH11可能工作在HDFs官能团。如数据所示5(一个)和5 (c),mir - 181 - 5 - p是预测控制POSTN的表达。因此,我们可以推断出从基因相关的网络分析,作为一个microrna POSTN / CDH11函数,mir - 181 - 5 - p可能起着关键作用的调制HDF行为在糖尿病状态。
(一)
(b)
(c)
3.4。验证微分microrna的表达和mrna在高Glucose-Cultured HDFs
核实差异表达基因的表达模式,我们执行中存在分析来确定差异表达microrna的水平(mir - 181 a - 5 - p, mir - 143 - 3 - p,和miR-21-5p)和蛋白编码基因的mrna水平中心(POSTN CDH11)在不同浓度的glucose-cultured HDFs的人物6。与正常的葡萄糖(5.5毫米)相比,在HDFs high-glucose治疗显著调节mir - 181 a的水平- 5 - p(25毫米增加到3.18折的葡萄糖, ,16.10折在60毫米的葡萄糖, ),mir - 143 - 3 - p(25毫米增加到3.04折的葡萄糖, ,6.66折在60毫米的葡萄糖, ),和miR-21-5p(增加到2.96折在25毫米的葡萄糖, ,5.41折在60毫米的葡萄糖, )。尽管high-glucose水平25毫米,无显著影响POSTN mRNA表达已经达到,60毫米的葡萄糖治疗可以显著提高POSTN mRNA水平1.36折( )。此外,60毫米和25毫米的葡萄糖治疗显著调节CDH11 mRNA水平1.61折( )和2.50折( ),相比正常葡萄糖治疗。所有的差异表达microrna的表达趋势和中心基因高glucose-cultured HDFs与我们的微分表达式分析结果是一致的。因此,体外分析中存在的实验验证了微分表达式。
(一)
(b)
4所示。讨论
作为一个主要的细胞,维持结缔组织内稳态,真皮成纤维细胞是深入参与伤口愈合过程。他们迁移和增殖形成肉芽组织,分化成myofibroblasts伤口收缩,产生和降解细胞外基质重构。真皮成纤维细胞功能受损的糖尿病伤口愈合期间一直是公认的。然而,很少有研究关注的发现和解释遗传基础是真皮成纤维细胞功能障碍。因此,基于多种生物信息学分析方法和体外实验,本研究进行进一步挖掘和解读microrna的出版和mRNA分析数据。
根据我们的分析,分析数据,在糖尿病HDFs,翻译的基因如POSTN CDH11, EDIL3, IL7R, COL11A1, HAPLN1, MAPK6调节,和像BMP2基因,STMN2, SFRP1表达下调。大多数这些基因编码的蛋白质参与细胞外基质的形成,细胞迁移、增殖,血管生成,需要正常的伤口愈合。例如,POSTN和CDH11编码细胞粘附分子和诱导细胞吸附和扩散,所需细胞增殖、迁移、分化、和ECM重塑。COL11A1 HAPLN1,分别编码ξ1α链和透明质酸型胶原和蛋白聚糖连接蛋白1,ECM成分和组织发展发挥了重要的作用。此外,STMN2和SFRP1编码蛋白质的表达下调的基因可以影响细胞生长和血管生成在缺血性损伤。
我们还发现3差异表达microrna, mir - 181 a - 5 - p, mir - 143 - 3 - p,和miR-21-5p。虽然很少有研究关注糖尿病HDFs 3 microrna的表达和功能,他们都已报告与糖尿病有关。关于mir - 181 a - 5 - p,发现抗,antifibrotic,抗炎作用在许多细胞类型(11- - - - - -14),以及在糖尿病状态(11,12]。根据刘2进行独立研究et al。15和魏et al。16),mir - 181 - 5 - p有能力减轻内质网(ER)的压力通过glucose-regulated蛋白质,78 kDa (GRP78),这是一个主要的ER伴侣蛋白和信号调节器和已被确定为一个目标mir - 181 - 5 - p。mir - 143 - 3 - p,超表达的相关性和糖尿病已经证明了马萨罗et al。17和Dahlman et al . .18]。根据先前的研究,mir - 143 - 3 - p可以抑制肿瘤细胞增殖,迁移和入侵在许多不同的恶性肿瘤,如黑色素瘤(19),骨肉瘤(20.),和肺癌21]。问题是否mir - 143 - 3 - p在糖尿病HDFs以类似的方式工作仍然需要进一步调查。miR-21-5p,很少有研究报道,其超表达是与糖尿病相关的并发症,尤其是糖尿病肾病。miR-21-5p的抗血管和抗效应可能是负责其参与糖尿病并发症。因此,我们发现3 microrna重叠功能,抑制细胞增殖,在伤口愈合是一个重要的过程。考虑上述的差异表达基因的功能和在体外验证的结果,它是合理的推断的增殖能力HDF受损状况high-glucose在糖尿病。
能看到我们应用度富集分析,microrna的目标富集分析,GSEA,我们试图总结3的结果分析。总的来说,当所有的浓缩结果考虑,丰富途径与丰富密切相关的方面去。类似的丰富的途径,例如,细胞外基质组织、内吞作用、细胞粘附、代谢、转录,翻译,也发生在富集分析。然而,丰富的3分析是完全不同。中涉及从3方面分析,ECM的形成,细胞粘附、增殖、分化、和缺氧反应可以看作是影响膜运输、拓扑错误的蛋白质反应(包括ubiquitylation和内吞作用)、物质代谢、转录和翻译。这表明我们的更改ECM的形成,细胞粘附、增殖、分化、和缺氧反应显著的功能变化在糖尿病HDFs。放松管制的膜运输、拓扑错误的蛋白质反应,物质代谢、转录和翻译的基本机制是这些变化的基础。事实上,糖尿病皮肤成纤维细胞显示胶原合成减少(22和MMP的增产23与正常皮肤成纤维细胞相比)。这些蛋白质的合成和分泌过程需要转录、翻译、膜运输、和物质代谢,毫无疑问,他们是糖尿病HDFs中特异表达。响应拓扑错误的蛋白质包括ubiquitylation和ER应激(24]。此外,ER应激可以减少蛋白质合成,促进蛋白质的降解,并进一步诱导自噬(25真皮成纤维细胞。最近的一项研究[15)报道,mir - 181 - 5 - p降低ER应激,这可能解决的关键作用mir - 181 - 5 - p在维护物质和能量在糖尿病HDFs体内平衡。
我们的研究已经确定了3个中心的基因包括POSTN, mir - 181 - 5 - p和CDH11。Periostin, POSTN编码蛋白质,已经被认为是一个重要的监管机构在糖尿病伤口愈合(26]。它诱导成纤维细胞的增殖,参与了TGF -β引起诱导myofibroblasts在伤口愈合。CDH11编码蛋白质,钙粘着蛋白11日也报道称,监管机构的伤口愈合和组织再生27]。我们在体外实验中验证了超表达POSTN和CDH11高葡萄糖(60毫米)培养HDFs。因此,毫不奇怪,POSTN和CDH11中心基因在糖尿病HDFs的规定。根据我们的分析,POSTN预测目标的mir - 181 - 5 - p。相应地,在体外实验中进一步证实了超表达mir - 181 - 5 - p POSTN的差别以及轻微的对这些高葡萄糖(25毫米)培养HDFs。高葡萄糖(60毫米)增加mir - 181 - 5 - p和POSTN表达,这可能是由于POSTN其他监管机构的全面监管。先前的研究已经报道了海拔mir - 181 - 5 - p在糖尿病患者的血清28)在糖尿病大鼠分离HUVECs (29日]。此外,抑制内源性mir - 181 - 5 - p可以改善胰岛素敏感性(28]。因此,mir - 181 - 5 - p与糖尿病密切相关。考虑到mir - 181 - 5 - p还参与细胞迁移的调制(13],纤维化[12),ER应激(24),深入参与伤口愈合过程,它是合理的推测mir - 181 a - 5 - p作为糖尿病HDFs的重要调节器。
本研究的限制是,我们没有进一步的实验来探讨这些基因参与调控网络中心糖尿病HDFs。我们未来的工作将集中在探索的效果和机制mir - 181 a - 5 - p, POSTN, CDH11高glucose-cultured HDFs。
5。结论
在目前的研究中,我们确定了3个microrna和30 mrna在糖尿病皮肤取出HDFs差异表达。这些基因参与ECM组织、血管生成、细胞增殖、迁移,与伤口愈合密切相关。富集分析显示,放松管制的ECM组织、细胞粘附、增殖、分化、缺氧反应,膜运输、拓扑错误的蛋白质反应,物质代谢、转录和翻译。基于基因关联网络,我们确定了前三中心基因:mir - 181 a - 5 - p, POSTN, CDH11。其中,POSTN预测的目标mir - 181 - 5 - p和应该与CDH11官能团。因此,mir - 181 - 5 - p可能起着关键作用的调制HDF行为在糖尿病状态。虽然中心基因的表达模式是体外量化实验验证了高glucose-cultured HDFs,需要更多的实验研究来进一步证实我们目前发现。我们未来的工作将集中在探索的效果和机制mir - 181 - 5 - p glucose-cultured HDFs,从而奠定理论和实验基础治疗糖尿病伤口有针对性的治疗策略。
数据可用性
在我们的研究中使用的原始数据是免费的从地理数据集GSE68185 GSE84971 GSE49566, GSE78891。
的利益冲突
我们对这篇文章宣布无利益冲突。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81571910和81571910),中国国家重点研究发展计划(2017 yfc1103301),和中国的广东省医学科学研究基金会(B2018026)。
补充材料
在我们的研究中使用的引物序列提供(见“底漆Sequences-Supplementary表”)。(补充材料)