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糖尿病研究期刊》的研究
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糖尿病研究期刊》的研究/2018年/文章

研究文章|开放获取

体积 2018年 |文章的ID 4834673 | https://doi.org/10.1155/2018/4834673

伊莱亚斯Blasius, Elke基尔德,休伯特科尔布,克丽丝汀Habich, Volker Burkart, ”的Autoantigenic胰岛素原B-Chain肽B11-23把70 kDa热休克蛋白DnaK在巨噬细胞的刺激”,糖尿病研究期刊》的研究, 卷。2018年, 文章的ID4834673, 8 页面, 2018年。 https://doi.org/10.1155/2018/4834673

的Autoantigenic胰岛素原B-Chain肽B11-23把70 kDa热休克蛋白DnaK在巨噬细胞的刺激

伊莱亚斯Blasius,1 Elke基尔德,1 休伯特科尔布,1,2 克丽丝汀Habich,1 和 Volker Burkart1,3

1临床糖尿病学研究所、德国糖尿病中心、莱布尼茨糖尿病研究中心,德国杜塞尔多夫d - 40225

2西德糖尿病和健康中心,杜塞尔多夫天主教医院集团,d - 40591德国的杜塞尔多夫

3德国糖尿病研究中心(DZD), d - 85764 Munchen-Neuherberg,德国

学术编辑器:力平玉
收到了 2018年7月15日
接受 2018年10月10日
发表 2018年12月09

文摘

背景。热休克蛋白(Hsp)作为细胞内的陪伴,除了作为佐剂的疫苗中肽物质本身与重组。通过与自体肽互动,Hsp可能促进自身免疫反应的诱导。客观的。在这里,我们分析了Hsp在巨噬细胞的影响是否被胰岛素多肽与Hsp交互。结果。组合的70 kDa Hsp DnaK肽B11-23核心区域的胰岛素原B-chain诱导炎症介质的释放白细胞介素- 6、肿瘤坏死因子α,interleukin-1β从人类和小鼠巨噬细胞的细胞。在并行,有高亲和性结合B11-23 DnaK。DnaK混合肽胰岛素分子从其他地区没有刺激细胞因子的分泌。DnaK单独诱导细胞因子的生产,和肽诱导没有。结论。Hsp70家族蛋白的macrophage-stimulating潜力时结合胰岛素原B-chain肽B11-23可能导致该肽的immunodominanceβcell-directed发展的自身免疫在1型糖尿病。

1。介绍

1型糖尿病(近年来免疫介导的破坏产生胰岛素的胰腺β细胞的结果导致胰岛素缺乏影响个人(1]。发病机理的标志是近年来发展的自身免疫反应对β细胞成分。胰岛素是一种占主导地位的β细胞相关自身抗原(2,3]。在胰岛素分子,最强的自身免疫系统T细胞反应性发生向B-chain地区B9-25 [1,3]。

先天免疫细胞,如巨噬细胞和树突细胞,是至关重要的β细胞免疫诱导和发展的过程,因为他们的抗原递呈的属性(4,5]。研究内源性信号控制巨噬细胞活动的特征确定了热休克蛋白(Hsp)的家人与介质明显macrophage-stimulating潜力(6]。

在生理条件下,Hsp作为细胞内的陪伴,是暂时性的绑定(聚)肽来协助他们的生物合成和运输7]。然而,Hsp释放压力或垂死的细胞可以作为有效的内源性危险信号优先目标细胞的先天免疫系统8,9]。此外,细胞外Hsp能够赋予他们陪同多肽免疫原性增加了提高识别抗原递呈,先天免疫细胞(10,11]。这个属性允许Hsp为抗原的激活宿主防御机制,但也可能促进免疫反应的诱导与自体肽(12]。

因此,我们使用一个模型系统分析胰岛素多肽和热休克蛋白的macrophage-stimulating潜力DnaK。细菌70 kDa女伴DnaK是哺乳动物的特征明显模拟Hsp70陪伴,其中peptide-binding特性详细分析了(13]。巨噬细胞刺激评估通过确定代表介质的释放相关的免疫发病机理,近年来,特别是肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)和interleukin-1β(il - 1β),确定为有效的β细胞细胞因子(14)、白细胞介素- 6 (il - 6)、免疫刺激性细胞因子在糖尿病中发挥着日益重要的作用[15,16]。

2。材料和方法

2.1。单核细胞/巨噬细胞细胞系

人类单核细胞线MonoMac 6 (DSMZ,布伦瑞克,德国)培养RPMI 1640中(PAA实验室、林茨、奥地利)包含一个草酰乙酸丙酮酸(OPI)补充胰岛素(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,德国),2毫米谷酰胺,抗生素(青霉素120 mg / l, 200 mg / l链霉素),和10% FCS(生命技术、Eggenstein、德国),在37°C和5%的公司2。J774A老鼠巨噬细胞线。1(ATCC, Manassas, VA, USA) was cultivated in RPMI 1640 medium supplemented as mentioned above, plus 1 mM sodium pyruvate, but without the OPI supplement [8]。

2.2。刺激巨噬细胞的细胞因子的生产

对细胞因子的刺激生产、J774A。1or MonoMac 6 cells were seeded in 96-well, flat-bottom plates (2 × 105细胞/)。细胞仍未经处理的(媒介控制)或被暴露于10 ng / ml脂多糖(LPS) (大肠杆菌O26: B6, Sigma-Aldrich化学GmbH)或不同浓度的重组DnaK (Stressgen,维多利亚,公元前,加拿大),13 mer肽来源于胰岛素原分子(17(水生生物研究所,莱顿大学医学中心,多肽合成设备、莱顿、荷兰)(表1),或者DnaK和肽的混合物。DnaK和肽分析鲎变形细胞溶解产物测定(Lonza AG)、巴塞尔、瑞士)内毒素污染。有限合伙人没有检测到。的长篇DnaK氨基酸序列(638个氨基酸)派生的大肠杆菌模式菌株k - 12 (Uni-Prot ID: P0A6Y8)。
胰岛素原肽 AA序列
起源 肽
链 A8-20 TSICSLYQLENYC
B-chain B11-23 LVEALYLVCGERG
B-chain B18-30 VCGERGFFYTPKT
c -肽 C8-20 GQVELGGGPGAGS
c -肽 C19-31 GSLQPLALEGSLQ
氨基酸序列的选择13 mer肽来源于胰岛素原(或B-chain或c -肽)13,17]。
表1
氨基酸的多肽序列。
2.3。量化通过巨噬细胞细胞因子的生产

有限合伙人、DnaK、肽-或DnaK / peptide-induced由巨噬细胞细胞因子的生产文化上层的决心。基于之前的研究显示不同的巨噬细胞接触后介质的释放动力学Hsp (LPS) (8,18,19),肿瘤坏死因子α水平测量后6 h和il - 6和il - 1β水平测量孵化24小时后没有或试剂的存在。细胞因子浓度被使用具体量化elisa (OptEIA集,BD Pharmingen)或多路复用技术根据制造商的指示20.,21]。

2.4。DnaK之间竞争复杂的形成和减少羧甲基化乳白蛋白(RCMLA)胰岛素多肽

竞争结合化验,70 nM DnaK孵化了40μM RCMLA (Sigma-Aldrich化学GmbH)在缓冲区包含25毫米Tris-HCl, 20毫米玫瑰,氯化钾47.5毫米和2.25毫米毫克(OAc)2在没有或存在竞争肽浓度增加(2 h, 37°C) (22]。DnaK-RCMLA复合物与自由DnaK DnaK-peptide复合物在本机聚丙烯酰胺凝胶电泳(6%)。免疫印迹后,DnaK-RCMLA复合物是由连续的视觉应用鼠标anti-DnaK抗体8 e2/2 (Stressgen),一只兔子anti-mouse IgG-HRP抗体(Stressgen),和一个ECL工具包(皮尔斯生物技术/热费希尔科学Inc .,罗克福德,,美国)在Lumi-Imager工作站(罗氏应用科学,曼海姆,德国)22]。所有实验至少重复三次。

2.5。统计分析

数据被表示为平均数±标准差。统计分析采用方差分析Bonferroni因果分析。被认为具有统计显著性差异 。所有统计分析使用棱镜软件包版本5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。巨噬细胞诱导的促炎介质的组合肽B11-23 DnaK和胰岛素

DnaK组合和胰岛素B-chain-derived肽B11-23刺激促炎介质的释放肿瘤坏死因子α并从细胞的小鼠巨噬细胞il - 6行J774A。1(图1)。1的混合物μ克/毫升DnaK和10μ肽诱导的g / ml 446±143 pg / ml TNF的积累α后6 h(图1(一)35±12 pg / ml)和il - 6在24 h(图1 (b))。巨噬细胞的接触DnaK (1μg / ml)导致只有很小的增加il - 6水平高于背景(8.7±0.5 pg / ml, )。在所有其他情况下,肿瘤坏死因子α或il - 6生产中控制的范围coincubation后巨噬细胞与DnaK或肽B11-23孤单。细菌有限合伙人(10 ng / ml)被用作积极控制和诱导肿瘤坏死因子的大量积累α(889±228 pg / ml后6 h,人物1(一))和il - 6 (1086±149 pg / ml 24 h后,人物1 (b))。

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图1
炎症介质诱导的小鼠巨噬细胞的胰岛素B-chain肽B11-23 DnaK。J774A。1cells were cultivated in the absence (medium) or presence of LPS, peptide B11-23, DnaK, or peptide-DnaK combinations at the indicated concentrations. Levels of TNFα(a)和il - 6 (b)在文化上层清液由ELISA测定。数据显示平均+ SD从3实验在一式三份。 媒介控制相比,肽或DnaK孤单。 而媒介控制。

类似的观察是用人类单核细胞的细胞行MonoMac 6(图2)。DnaK(1的组合μg / ml)和肽B11-23 (10μg / ml)诱导释放757±110 pg / ml TNFα后6 h(图2(一个))和572±42 pg / ml il - 6在24 h(图2 (b))。再次,DnaK或肽本身不产生大量的细胞因子,除了TNF水平低α(16.7±2.5 pg / ml, )和il - 6 (9.8±7.0 pg / ml, )为了应对DnaK浓度越高。孵化有限合伙人的巨噬细胞有强烈的刺激效果(649±257 pg / ml TNFα后6 h;757±365 pg / ml il - 6后24 h)。

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图2
诱导炎症介质从人类单核细胞的胰岛素B-chain肽B11-23 DnaK。MonoMac 6细胞培养在没有(媒介)或有限合伙人,肽B11-23, DnaK或peptide-DnaK表示浓度组合。肿瘤坏死因子的水平α(a)和il - 6 (b)在文化上层清液由ELISA测定。数据显示,意味着从3 + SD实验在一式三份。 , ,和 媒介控制相比,肽或DnaK孤单。 和 而媒介控制。
3.2。相互作用的胰岛素B-Chain肽B11-23 DnaK

胰岛素多肽与DnaK交互的能力在一个竞争结合试验分析,允许评估DnaK-binding肽/蛋白的能力决定其竞争能力与高亲和性结合DnaK配体RCMLA女伴[22]。显示的剂量依赖性降低DnaK-RCMLA复合物(图的信号强度3(一个)(左),13 mer肽B11-23有效干扰伴侣及其配体之间的相互作用。在160年的浓度μ米,肽几乎完全阻止DnaK-RCMLA复杂的形成(图3 (b))。肽的效果是减少剂量依赖性的方式,几乎是失去了浓度为2.5μm .排除干扰肽的新款DnaK-RCMLA交互,我们分析了影响肽B18-30包括13个氨基酸的胰岛素原的c端区域B-chain,部分重叠的序列肽B11-23(表1)。肽B18-30肽B11-23相比,即使在高浓度的160μ米,不干扰DnaK-RCMLA复杂的形成(图3(一个)右),证明了失败的肽取代RCMLA女伴(图3 (b))。

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图3
竞争DnaK之间复杂的形成和RCMLA胰岛素B-chain肽。DnaK孵化了RCMLA缺席或存在增加浓度的缩氨酸B11-23或B18-30。DnaK-RCMLA复合物与自由DnaK DnaK-peptide复合物通过本地页面呈现和吸水后anti-DnaK抗体和ECL的使用。(一)代表污点的结果。(b)的优势产生的信号被发光检测系统和量化显示为相对发光强度设置DnaK-RCMLA样本在缺乏竞争的信号肽100%。数据显示,意味着从3 + SD分离实验。 和 相比DnaK-RCMLA样品的发光强度在缺乏肽。肽在2.5μ米对应3.7μ克/毫升的肽,10μ米对应14.6μ40 g / ml的肽,μ米对应58.6μ克/毫升的肽。
3.3。比较分析的巨噬细胞刺激能力肽B11-23 B18-30结合DnaK

在比较分析,J774A细胞。1line were exposed to mixtures of DnaK and the peptides B11-23 or B18-30. Combinations of DnaK (1 μg / ml)和肽B11-23 (10μg / ml)诱导释放549±236 pg / ml TNFα后6 h(图4(一))或322±17 pg / ml il - 6在24 h(图4 (b)),而组合的伴护蛋白质与多肽B18-30没有影响。的肽仅表现出没有刺激的活动。DnaK独自没有引起显著的肿瘤坏死因子的分泌α但低水平的il - 6,也显示在图1。接触的细胞有限合伙人(10 ng / ml)诱导大量的肿瘤坏死因子的释放α(1527±596 pg / ml后6 h,人物4(一))和il - 6 (4918±1548 pg / ml 24 h后,人物4 (b))。

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(b)
图4
的巨噬细胞刺激能力比较胰岛素B-chain肽B11-23和B18-30结合DnaK。J774A。1cells were incubated in the absence (Medium) or presence of LPS, peptides B11-23 or B18-30, DnaK, or peptide-DnaK combinations at the indicated concentrations. Levels of TNFα(a)和il - 6 (b)在文化上层清液由ELISA测定。数据显示,意味着从3 + SD实验在一式三份。 和 媒介控制相比,肽或DnaK孤单。 而媒介控制。
3.4。巨噬细胞刺激影响胰岛素原的活性肽,B-Chains或c -肽

进行进一步的研究有两个肽(B18-30 C8-20)缺乏认可绑定能力DnaK和两个肽(A8-20 C19-31)温和绑定活动DnaK [17]。肽没有引出一个重要的细胞因子反应时增加巨噬细胞的人类细胞系MonoMac 6。此外,所有的肽和DnaK混合在一起的时候没有引起显著的细胞因子分泌(表2)。相比之下,刺激活性肽的混合物与DnaK B11-23复制和il - 1的也见过β(表2)。
il - 6 (ng / ml) 肿瘤坏死因子α(ng / ml) il - 1β(ng / ml)
媒介 < 0.1 < 0.1 < 0.2
有限合伙人 76.3±9.0 b 45.44±8.14 12.70±1.02
B11-23 < 0.1 < 0.1 < 0.2
B11-23 + DnaK 19.0±4.3 10.9±1.9 5.5±1.0
B18-30 < 0.1 < 0.1 < 0.2
B18-30 + DnaK < 0.1 < 0.1 < 0.2
A8-20 < 0.1 < 0.1 < 0.2
A8-20 + DnaK 5.7±4.9 0.6±0.9 < 0.2
C8-20 < 0.1 < 0.1 < 0.2
C8-20 + DnaK 7.7±5.5 < 0.1 < 0.2
C19-31 < 0.1 < 0.1 < 0.2
C19-31 + DnaK < 0.1 < 0.1 < 0.2
MonoMac 6细胞没有孵化(媒介)或在有限合伙人(10 ng / ml)或DnaK (1μg / ml)在缺乏或胰岛素原肽(10μg / ml)。肿瘤坏死因子的浓度α测定6 h后的孵化和il - 6和il - 1的浓度β确定24 h后的孵化文化上层清液。结果peptide-DnaK组合是由刺激引起的细胞因子水平与纠正DnaK孤单。 从三个实验数据给出意味着±SD在一式三份。这里使用的多路复用系统的细胞因子测量比ELISA(图产生了较低的结果2),但有限合伙人之间的相对差异,B11-23肽,肽B11-23 + DnaK没有影响。 不同的媒介。 多肽和肽+ DnaK之间的差异。 多肽和肽+ DnaK之间的差异。
表2
释放il - 6、TNFα,il - 1β从MonoMac 6细胞暴露于proinsulin-derived 13 mer肽单独或结合DnaK。

4所示。讨论

我们报告在一个合作的Hsp70模拟DnaK和胰岛素原B-chain肽B11-23在巨噬细胞激活促炎细胞因子的生产。这里描述的研究进行与DnaK特征,因为它是最好的hsp70家族的成员。因为伴侣蛋白hsp70的函数,只有有限的空间不同物种之间的结合特异性变化,记录的非凡的保护氨基酸序列之间的细菌,老鼠,和男人23]。这是进一步说明了比较完整的氨基酸相似性大肠杆菌人(74.1%)和较高的氨基酸序列的相似性substrate-binding域两种(86.1%)。substrate-binding域之间的相似性小鼠和人甚至是99.1% (24- - - - - -26]。B11-23序列包括一个强有力的约束力的主题DnaK [13),四到五个氨基酸的疏水核心主导作用的亮氨酸(LYLV肽B11-23)经常在基本两侧地区丰富残留物(只有一个地区E的肽B11-23)。衬底绑定的一般特征是守恒的hsp70家族(27]。

Hsp孤独,比如发生在细胞外室,可以作为“危险抗原”,刺激巨噬细胞功能,这个属性是独立于他们的女伴活动(6,8]。这里描述的实验中,低浓度DnaK被选为了满足Hsp70血清水平的健康的人的范围(28]。在此浓度范围,DnaK诱导没有或最小的细胞因子生产的小鼠和人类单核细胞/巨噬细胞行J774A。1和MonoMac 6日与LPS引起的高细胞因子水平。两个细胞系成立于先前的研究探讨巨噬细胞反应性对炎症信号(29日]。使用单核细胞/巨噬细胞行允许使用标准化和可再生的试验条件。为了避免的结果不能代表,但特性独特的细胞系,我们包含了两个不同的单核细胞/巨噬细胞两种相当遥远的台词,老鼠和人。

大小的缩氨酸用于当前实验选择符合peptide-binding裂hsp70家族的陪伴的23]。这种规模的肽通常不能激活巨噬细胞或其他先天免疫细胞。事实上,没有一个五肽被发现从巨噬细胞诱导细胞因子分泌,即使添加的浓度为10μ克/毫升。然而,刺激效应观察胰岛素原肽B11-23和DnaK加在一起时,巨噬细胞线。肽的混合物和DnaK诱导肿瘤坏死因子的释放α和il - 1β,确认为β细胞介质(14细胞因子il - 6的)以及免疫刺激性(15,16]。发现DnaK / B11-23混合物刺激细胞的小鼠和人类巨噬细胞行意味着这个响应不同的胰岛素原肽/ Hsp组合代表了一个一般的巨噬细胞的功能属性。

我们假设肽B11-23之间的合作和DnaK结果从一个协会的胰岛素与女伴肽。评估DnaK之间可能的相互作用和使用的肽B11-23竞争结合试验与RCMLA高亲和性配体(22]事实上揭示了配位体的位移由肽B11-23 DnaK,但不是通过肽B18-30源于胰岛素原的c端区域B-chain。这些研究结果支持先前的研究结果之间的交互DnaK和胰岛素B-chain肽(17]。随后比较分析确诊的潜在的巨噬细胞活化肽肽B11-23之间的合作和DnaK但揭示了肽的无能B18-30提高巨噬细胞反应的女伴。

另一个胰岛素与小肽DnaK绑定,C8-20,和两个肽DnaK温和的绑定,A8-20和C19-3117),没有把DnaK诱导细胞因子分泌。这表明,肽B11-23是独特的在这方面,可能是因为它的高亲和性结合DnaK。

在高浓度时,因为它们可能发生在炎症组织,细胞外Hsp是强大的巨噬细胞和树突细胞活化剂和这个adjuvant-like属性被用于肿瘤疫苗组成的重组Hsp +孤立的肿瘤细胞肽(11,30.]。我们发现在低,nonstimulatory DnaK浓度、掺合料的高亲和性肽B11-23结果有力的巨噬细胞刺激复杂。

这个结果是否与发现的肽B11-23是一个占主导地位的目标胰岛autoreactivity在动物和人类在近年仍有待确定。我们比较B11-23与肽代表二级autoantigenic胰岛素分子的抗原表位肽A8-20和C19-3131日- - - - - -33]。尽管他们moderate-affinity绑定DnaK (17),诱导细胞因子分泌的合作并没有观察到。可想而知,其他强大DnaK-binding肽也可能刺激巨噬细胞活动。肽等有效的抗原表达,可能必须出席当地的高浓度,必须表现出适当的约束力主要组织相容性抗原的特征。

5。结论

综上所述,我们的研究结果表明,胰岛素多肽B11-23强化的能力70 kDa女伴DnaK刺激炎性巨噬细胞的活动。我们的结果可能是相关的Hsp 70表达的增加胰岛暴露于患者炎症条件和近年来(34,35]。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

资助者没有作用的设计研究和收集、分析和解释数据,撰写的手稿。部分工作提出了抽象的第53届欧洲糖尿病研究协会(2017)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Waltraud Fingberg和任何人Bruggemann优秀的技术援助。这项工作是由文化部和科学的北莱茵-威斯特法伦州(MKW北威州)和德国联邦卫生部(BMG)。这项研究也支持部分由联邦资助研究糖尿病研究中心(BMBF)德国(DZD汽车集团)和亥姆霍兹联盟与大学(成像和养护环境代谢疾病(ICEMED))。

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