文摘
历史降糖药二甲双胍(METF),药物,是一个可能的候选人寿命延长,治疗和预防久坐,胰岛素抵抗和肥胖。骨骼肌是一个高度灵活的组织,肥大的能力应对阻力训练和损伤后的再生。这项工作的目的是探讨METF防止久坐损害的能力,增强骨骼肌功能。久坐不动的12个C57BL / 6小鼠接受METF(250毫克/公斤/天,饮用水中)为60天。METF作用于骨骼肌分化进行了研究在体外使用小鼠C2C12成肌细胞。肌肉性能评价表明,METF增强小鼠物理性能(估计)。肝脏和肌肉组织的生化分析表明,在肝METF增加AMPK和CAMKII信号。相比之下,METF灭活的兵,校长激酶参与肝压力。在骨骼肌、METF AKT激活关键激酶骨骼肌质量维护。在在体外研究,METF没有修改C2C12扩散能力,虽然积极影响和肌管成熟分化过程。总之,我们的小说的结果表明,METF有积极的行动不仅在促进健康老龄化,而且防止久坐赔偿。
1。介绍
2型糖尿病是一种代谢紊乱,其特征是慢性高血糖与胰岛素抵抗,胰岛素相对或绝对受损生产,改变了胰高糖素分泌的功能障碍(1,2]。糖尿病发病的两个主要过程是参与其发病机理:进步的胰岛细胞功能和降低胰岛素敏感性下降在外围组织3]。特别是,胰岛素抵抗(IR)发生在肌肉和脂肪组织胰岛素影响葡萄糖的吸收是有缺陷的,不能够抑制内源性葡萄糖生产由肝脏(4]。因为骨骼肌负责总刺激葡萄糖摄取的70% - -80%,骨骼肌IR是2型糖尿病的主要决定因素5]。
遗传和环境因素之间的相互作用、营养过剩和久坐行为促进红外的进展和发病机理。特别是发生在全球粮食系统的修改在过去3 - 4年里创建了一个“肥”的环境导致肥胖症的增加和顺向红外发病率增加。不健康饮食和缺乏身体活动被认为是主要原因相同的红外特征的疾病。目前,减轻这种情况仍然是一个关键的治疗策略(2,6]。
METF,普遍规定在2型糖尿病药物,越来越被认为是久坐损害的治疗和预防,以及健康寿命的延长(7]。最近的数据显示,长期饮食补充METF延长健康寿命秀丽隐杆线虫和老鼠在中年男性8,9]。此外,我们演示了如何治疗急性METF可能诱导生成neohypertrophic肌管,通过使用一个在体外模型的卫星细胞C2C12细胞线)(10]。
定期体育锻炼实践中起着非常重要的作用在维持良好的健康状况和身体健康11]。特别是最近的出版物显示的积极功能锻炼的减少和反动机制相关的肌肉萎缩和退化的周边红外(12,13]。
在锻炼肌肉,提高能量代谢和ATP生产是通过增加葡萄糖的利用率。最相关的代谢影响的运动之一是增强胰岛素的行动14]。许多因素可能导致增加胰岛素敏感性引起运动:减少脂肪,增加肌肉质量,增加membrane-bond葡萄糖转运蛋白(GLUT4)在肌肉细胞(15]。
体育锻炼的影响可能产生相关影响代谢疾病的预防和治疗。事实上,增加胰岛素敏感性,体育活动可以减少风险的病理条件下,如2型糖尿病和代谢综合征(16]。
理解复杂的机制,调节胰岛素反应和外周胰岛素抵抗的发病是一个主要目标治疗糖尿病和肥胖并发症,尤其是针对骨骼肌。鉴于日益流行的疾病和条件相对sarcopenia相关,新的治疗措施,不仅可以减少骨骼肌肉的损失还要刺激肌肉再生,同时保留可行的肌肉卫星细胞的生理学成为必要。
为了确定如果二甲双胍能缓解久坐赔偿,我们在久坐不动的成人学习METF影响年轻的老鼠,我们的注意力关注METF保持轻快鼠标物理性能在高频的增量的能力测试。
2。研究设计和方法
2.1。材料
鼠标C2C12成肌细胞从欧洲购买动物细胞培养(ECACC)的集合。试剂购买从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。主要抗体一种蛋白激酶(C-20), CAMKII (m - 176), calnexin (h - 70), ERK1 (K-23) ERK2(碳14),GAPDH (fl - 335), MyoD (C-20) Myogenin(十佳)MyHC (h - 300), Myf5 (C-20) N-cadherin (h - 63), p70S6 (C-18) SOD2 (fl - 222), pERK1/2 (E-4-4) pp70S6 (sc - 7984), peroxidase-conjugated二级抗体进行免疫印迹分析,和rhodamine-conjugated抗体免疫荧光分析购买的圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。主要抗体phospho-AKT (Ser473) (D9E) XP和phospho-AMPKα(Thr172) (40 h9)从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国)。抗体Phalloidin (Alexa萤石488 Phalloidin、分子probes-Invitrogen)。
2.2。动物研究
2.2.1。动物
雄性C57BL / 6小鼠(),从查尔斯河实验室购买(美国波士顿),用于研究在12周的年龄。所有的动物都在12 h / 12 h光/暗周期无限制地标准啮齿动物食物食物和水。老鼠分成两组:配对一个METF处理,另不治疗(来讲)。每周体重和血糖水平测定。血液中血糖测量收集从尾巴的尖端便携式葡萄糖测量装置(拜耳、巴塞尔、瑞士)。
2.2.2。METF治疗
METF(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到饮用水的剂量250毫克/公斤体重/天,60天。控制老鼠收到没有METF水。在文献[报道17),我们的初步研究证实,C57BL / 6小鼠每天消耗7毫升水;METF之外没有影响耗水量。水和METF改变每日剂量调整每周体重增加(数据1(一)和1 (b))。
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2.2.3。肌肉运动性能测试
肌肉运动性能是评价轻快的高频增量测试之前和在完成这项研究。短暂,老鼠被放置在适应跑步机(哥伦布仪器)5分钟在0°斜面,然后跑步机速度增加根据方案如图1(一)1.5分钟间隔15°斜面(图1(一))。动物运行,直到疲惫,这是定义为剩余的出乎意料,板超过5秒。食物和水是不可用的老鼠在任何运行的会话(18]。在实验结束时,老鼠牺牲和组织是收获,在液态氮冷冻,储存在−80°C进行进一步的分析。
本研究是符合批准的机构进行动物保健米兰大学的。
2.3。细胞培养实验程序
C2C12细胞维持在37°C湿润有限公司5%2大气中包含DMEM培养基(GM)(杜尔贝科修改鹰介质)补充20% (v / v)胎牛血清(的边后卫),1%的青霉素,链霉素和1%的谷酰胺70%汇合。细胞分化是由将70%的融合性的细胞培养分化培养基(DM),包含DMEM补充1%马血清(HS),抗生素,和1%的谷酰胺。在我们的在体外分化模型,早期肌管出现24 - 48小时(h)后血清饥饿和neomyotubes形成72 h后完成19]。增殖细胞,成肌细胞分化过程中,neomyotubes处理400人μm METF。在控制细胞METF没有添加到媒体。图2解释了实验研究设计中每个阶段的协议,与细胞融合比例,治疗开始时间,持续时间。
2.3.1。生长曲线和细胞生存能力测试
研究METF行动C2C12成肌细胞增殖,我们所描述的生长曲线进行测定20.]。短暂,C2C12成肌细胞被镀在60毫米×15毫米文化菜融合在40%,生长在通用汽车有或没有METF DM。每24 h和实验中改变了一直持续到控制细胞达到70%的融合(3天)。每一天,使胰蛋白酶化细胞,用台盼蓝染色,计算使用血细胞计数器和每一天的平均值是用来绘制生长曲线。细胞生存能力计算nonstained除以总细胞计数活细胞计数。此外,形态变化每天检查。
2.4。免疫印迹分析
蛋白质提取,执行所述其他地方(21),从老鼠组织或细胞培养获得了使用以下裂解缓冲包含:50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.4,150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1毫米原钒酸钠(Na3签证官4PMSF), 1毫米EDTA, 1毫米,1毫克/毫升抑肽酶,1毫克/毫升亮抑酶肽,1毫克/毫升抑肽素。
整除的30μg浮在表面的蛋白质,量化使用布拉德福德方法,解决在sds - page凝胶和转移到硝化纤维素膜(Protran,绘画纸Schleicher & Schuell)。膜是孵化与特定主要抗体,然后合共轭anti-species-specific二级抗体。确认平等蛋白质加载/样品,我们使用抗体anti-calnexin或anti-GADPH。定量测量免疫反应性的乐队强度,可视化增强化学发光法(Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西,美国),是由光密度分析使用接穗图像软件(Scion公司,弗雷德里克,医学博士,美国)。数据被转换成fold-changes (FC)的控制21]。
2.5。免疫荧光分析
对于组织分析,7μ米冷冻cryosections固定在一夜之间甲醛4% 4 c。之后,幻灯片在PBS和孵化洗1小时在室温下以10%马血清在PBS 0.05% Triton x - 100块非特异性结合位点,而C2C12细胞、固定和permeabilized描述(22),包含1%牛血清白蛋白与PBS被封锁。幻灯片或者细胞被应用与特定的抗体rhodamine-conjugated和核与DAPI染色法显示。幻灯片和Moviol安装。细胞观察使用尼康Eclipse 50我显微镜和图像捕获使用Nis-Elements D 4.00软件(尼康仪器欧洲BV、荷兰)。使用Adobe Photoshop CS4数据显示和分析。住C2C12细胞检查和图像获得的相衬显微镜使用相同的显微镜和上面描述数字系统。
2.6。统计分析
所有实验进行三次。数据均值±SD。统计意义计算使用测试。结果被认为是重要的时候。
3所示。结果
3.1。METF预防久坐引起的损害赔偿在活的有机体内METF实验
以前的数据8,9]建议的能力METF延长线虫寿命秀丽隐杆线虫在中年男性C57BL / 6小鼠,改善健寿老鼠。
我们旨在调查的可能作用METF预防久坐引起的损失。为了实现这一范围,选择12个月大的雄性C57BL / 6小鼠,保持总缺乏锻炼的一个条件,并与METF接受60天,在水中添加的剂量250毫克/公斤体重/天(图1(一))。
我们没有观察到显著的修改在小鼠体重随机接受METF和那些没有收到METF(图1 (b))。减肥是观察两组,比较实验的开始和结束。相比之下,我们没有观察到显著影响血糖水平(图1 (b))。
METF对肌肉的影响绩效评估显示,METF治疗增加速度,时间,工作,估计最大耗氧量(签证官2马克斯轻快)急性高频增量运动METF组相比其基线值(图1 (c))。总的来说,肌肉性能容量因此增加METF组对预处理条件下,尽管衰老和尽管缺乏执行之前的运动训练。
我们评估METF对AKT的影响。AKT / mTOR通路,骨骼肌质量的关键调节器,调节肥大和表达下调期间在肌肉萎缩(23,24]。在腓肠肌METF治疗动物的肌肉,AKT激活改善与控制(图1 (d))。此外,这一趋势中,检测出一种AKT激活METF治疗小鼠股四头肌肌肉(图1 (d))。
接下来,我们检查METF行动肝脏(图1 (e))。正如前面描述的文献[25),METF AMPK活化增加肝脏。肝脏erk活化与氧化应激和代谢障碍有关,肥胖和糖尿病的主要特点(26]。有趣的是,erk激活显著减少METF治疗小鼠的肝脏(图1 (e))。
免疫荧光分析(图1 (f))表明METF积极调节Ca2 +/钙调素依赖的蛋白激酶(CAMKII)蛋白质含量在肝脏组织控制,建议METF的一个重要的角色在细胞钙稳态。
我们在一起,在活的有机体内数据表明METF不仅可以改善年龄诱导损伤也久坐引起的损伤。
3.2。METF积极作用增殖,分化,并在骨骼肌成肌细胞肥大
我们还测试了METF行动在骨骼肌细胞增殖,分化,并使用C2C12细胞肥厚性过程中,线(图2)。C2C12小鼠永生化细胞系提供了一个很好的在体外研究模型的成肌细胞增殖和分化的主要步骤27,28]。在C2C12肌原性的表现型的成就,肌原性的监管机构因素(mrf)表示在一个定义的序列;MyoD和Myf5主要是表达,而Myogenin表达式只是诱导后肌肉分化(27,28]。
400年μM METF没有改变C2C12增殖潜力,不诱导细胞毒性效应,如图3(一个)和确认阶段在图对比图像3 (b)。我们还测量了MyoD蛋白质水平。METF导致MyoD含量显著上升,与DM,而控制(图3 (b))。
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免疫荧光分析在扩散阶段显示METF的两个关键标记的蛋白表达增加早期分化:Myf5和MyoD,表明一个重要的角色的分化诱导和促进成肌细胞肌管的承诺(图3 (d))。为了证实这一点,Phalloidin化验(图3 (e))表明,细胞失去了圆形特征,典型的活跃增殖阶段,达到一个新的细长的形态。
我们探讨了METF对肌管形成的影响。我们分析了METF行动差异化(图2),从第一阶段的分化诱导(24小时),中间阶段(48小时),和结束的过程(72 h),当所有fusion-competent细胞可以形成多核肌管(28]。如图4 (b),METF治疗细胞的特点是一个重要的肌管成熟的主要标志,肌凝蛋白重链(MyHC)蛋白质含量对控制细胞。类似METF N-cadherin观察积极行动,中央细胞骨架蛋白参与细胞骨架重排,需要融合成肌细胞的肌管(29日]。证实了我们的结果,这表明METF在差异化发展的积极作用,我们分析了Myogenin蛋白质水平。METF增强Myogenin蛋白质含量,特别是在48 h(图表达的峰值4 (b))。
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蛋白质水平的超氧化物歧化酶(SOD2),一种高效的酶超氧化物转化为过氧化氢活性越少,在METF显著增加细胞相比,控制细胞(图4 (b))。这一结果表明,METF可能抵消久坐不动的生活方式引起的损害加强抗氧化剂线粒体功能。
最后,我们研究了METF行动的主要信号级联参与骨骼肌形成:erk和p70S6激酶通路(23]。通过erk激活METF增强分化过程,而减少p70S6激酶途径(图4 (b))。
从分化诱导48 h后,免疫荧光分析显示,CAMKII neoformed蛋白表达增加肌管处理METF(图4 (d))。
基于我们之前的数据在短时间METF刺激对肥厚性过程的影响(10),我们研究了长时间的影响METF治疗neoformed肌管(图4 (c))。24 h METF刺激显著增加MyHC蛋白质水平(图4 (e))。观察到所有的分化阶段,METF效应是由erk信号通路激活(图4 (e))。
在免疫荧光图像,我们观察到一个重要MyHC和N-cadherin蛋白质含量neoformed METF治疗后肌管。此外,METF治疗引起的重要形态变化的形态学参数(肌管的长度和直径,如图4 (f))。
4所示。讨论
体育锻炼的影响产生相关影响引起的损害的预防和治疗“肥环境”的特征是一种积极的能量摄入与能量消耗之间的平衡。此外,体育活动代表一个主要目标治疗糖尿病和肥胖并发症,特别是骨骼肌系统。证实了体育活动的基本作用,世界卫生组织已经确定缺乏身体活动作为至今全球死亡率的危险因素(30.]。
我们调查的潜在影响在活的有机体内METF治疗,目前候选药物延长寿命,防止久坐引起的损失。具体来说,我们分析了METF能力提高小鼠肌肉物理性能。
研究运动训练对小鼠的协议(图1 (c))表明,METF可以对肌肉性能有积极的影响。我们的结果,从久坐不动的健康小鼠的研究模型,获得确认之前获得的积极的METF行动对骨骼肌功能在老年小鼠模型(8]。
一些最近的工作表明这双胍药物可用于预防老化引起的损失(8,9,31日]。在这个角度看,我们研究的关键分子监管机构共同参与衰老途径(32]。AKT信号是中央在肌肉功能的规定,特别是一种蛋白激酶失活与肌肉老化引起的损失(23,33]。我们发现METF增加了一种蛋白激酶的激活在腓肠肌和股四头肌肌肉(图1 (d)),这表明一个假想的小说不仅使用这种药物在体内条件下,而且在sedentary-related受损肌肉条件。准确地说,第一次,我们的工作显示出的有利影响METF不仅发生在组织已经以病理条件(如肥胖,糖尿病,和老龄化带来的障碍)也在健康久坐的人群。
额外的积极行动在METF治疗小鼠肝脏;METF失效ERK和促进CAMKII信号。ERK激活支持的发展是至关重要的几个肝障碍,如肝纤维化和肝细胞癌(34),而CAMKII通路的激活是保护肝脏功能的基础(35]。从这些数据,它是合理的得出METF补充可以用来保持肝脏健康。我们人类在健康证明常数有氧体育锻炼是避免脂脂肪变性的线索(36]。
进一步澄清METF细胞机制获得的小鼠模型的影响,我们研究了METF操作使用在体外模型的成肌细胞C2C12细胞线(27,28]。这个细胞株代表永生化细胞研究的金标准不仅肌发生而且肥大过程和它的使用使我们调查METF行动细胞通路参与肌肉训练,特色健康主题的过程。
首先,我们观察到METF没有修改C2C12增殖率和活力(图3(一个)),确认可能使用这双胍药没有副作用的骨骼肌(37]。这些结果具有重要意义因为几个肿瘤与sarcopenia和恶病质(38),这可能得益于METF治疗。
METF加速肌原性的表现型收购和肌管的形成(图3和4)。neomyotubes METF刺激24 h后,我们观察到的增量(图形态参数4 (f)),类似于我们以前的工作在急性METF治疗管理(10]。这种效果是由ERK激活(图4 (e))。我们的数据表明,METF不仅不应被视为一种药物能够灭活细胞机制相关的肌肉损伤,但也能够激活细胞过程的药物相关肌肉加强和肥大。我们推测这METF能力增强肌管的形成和肥大可以代表一个可能的解释获得的数据,在活的有机体内在老鼠身上。
最后,我们的结果在分化阶段表明SOD2 METF刺激(图后蛋白质含量增加4 (b))。的胞内酶SOD家庭作为主要的防线应付ROS的有害影响,从而导致整体减少氧化损伤。降低SOD活性与久坐不动的生活方式有关,表现为胰岛素抵抗,这表明抗氧化酶能力降低导致氧化应激在糖尿病和肥胖39]。所以,我们假设METF也可以作为一种抗氧化剂代理。这种潜在的影响需要进一步的调查。
5。结论
总之,我们的研究报告相关的一些小说发现使用METF缺乏身体活动和特别的一个条件:(1)能提高小鼠身体有氧性能;(2)改善肌管的形成,调节骨骼肌肥大的主要分子介质和萎缩;(3)防止氧化应激损伤,调节ERK和SOD的信号。
我们的结果的相关性驻留在一个潜在的使用METF(或药物具有类似生物礼节)来抵消损失随之定居直接(作用于分子目标参与应力状态)或间接地通过提高已知的有益的体育活动的影响。在这个框架中,进一步的研究是必要的,也在人类,METF测试联合治疗的使用,锻炼,饮食,防止损害久坐。
利益冲突
没有报告潜在的利益冲突。
作者的贡献
帕梅拉Senesi贡献和安娜·蒙特沙诺同样这项工作。帕梅拉·Senesi,安娜·蒙特沙诺和罗伯特·Codella设计并进行实验,分析数据,写论文。利维奥西郊鹭鹚和斯特凡诺Benedini促成了讨论和审查。罗丝Terruzzi监督、设计实验和写论文。罗丝Terruzzi是担保人的工作,负责数据的完整性和数据分析的准确性。所有作者阅读和批准了期末论文。