文摘

β通过移植是唯一的治疗细胞替代治疗在糖尿病患者建立长期稳定正常。由于缺乏捐赠的组织,正尝试开发替代体内细胞的来源。干细胞分化和重组以及分离胰腺祖细胞从不同来源是一些例子;然而,目前还没有方法产生一个临床相关的解决方案。胰岛细胞分离培养的细胞数量在体外再分化向扩散提供了一个有前途的平台β肽表现型。在这项研究中,我们培养islet-derived细胞在体外和检查的表达β在增殖细胞的基因。从猪胰脏胰岛细胞和酶消化分离组件。在组织培养细胞扩散板和亚文化不超过5通道。只有10%的胰岛素表达,以PCR,保存在每个通道。高葡萄糖媒体增强胰岛素表达4-18褶皱,暗示glucose-dependent效应的扩散islet-derived细胞。islet-derived细胞也表达了其他胰腺癌基因如Pdx1 NeuroD,胰高血糖素、生长激素抑制素。总的来说,这些结果表明,胰腺islet-derived细胞扩散在体外,保留了表达能力关键胰腺癌基因,从而表明细胞可能redifferentiated进入体内β例如细胞。

1。介绍

糖尿病是一种复杂的慢性疾病,影响全世界超过3.8亿人和消费至少6120亿美元美元在2014年卫生支出,根据国际糖尿病联合会(http://www.idf.org/)。大约10%的病例都是1型糖尿病(近年来)、自体免疫反应的结果,身体的防御系统攻击和破坏产生胰岛素β在胰腺胰岛的肽。然而,大多数患者2型糖尿病(T2D),从外周组织胰岛素抵抗和结果β细胞功能障碍(1,2]。由于难以维持葡萄糖稳态,糖尿病患者的风险增加发展中存在的一系列严重的健康问题一直很高的血糖水平。这些并发症包括心血管疾病(3,4],失明[5)、肾功能衰竭和下肢截肢(6,7]。胰岛移植是一种有效的策略可能治愈内转和消除需要每天注射胰岛素(8]。患者移植人类尸体的小岛可以保持胰岛素独立通过这种疗法(5年甚至更长时间1,9,10]。然而,这种方法大大限制由于缺乏捐赠的小岛。在胰岛细胞分离,很大一部分的小岛丢失和2 - 3人捐献器官接受者必须获得所需的胰岛质量,从而加剧了当前缺乏捐赠的胰脏和否认成千上万的病人移植的好处(2]。在发育生物学领域的最新进展和再生医学的概念生成无限供应β的肽在体外已经成为一个潜在来源将胰岛移植扩展到成千上万的病人患有内转。

有许多不同的细胞来源,β可以生成的肽(11,12]。人类β肽有相当低的复制,它已经表明,净化人类β肽未能复制在体外不管使用的基础或生长因子(13]。Lineage-tracing实验证明损失的β细胞是由于质量β肉瘤细胞去分化而去β肽回归progenitor-like细胞(14]。事实上,一些组织已经建议β肽的人工小岛可以肉瘤和扩大在数字在体外扩散,然后指向redifferentiate回到β肽(11,15]。纤维母细胞Gershengorn等人也表示,来自成人胰岛数目激增在体外和接受epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)文化。翻译后的胰岛祖细胞和间充质细胞是有潜力成为redifferentiated insulin-expressing胰岛细胞总量(16]。尽管EMT过程是有争议的,许多研究已经提供了证据,上皮细胞和间充质干细胞(msc)从小岛/胰腺组织有能力区分β细胞表型(17,18]。nonpancreatic来源,大多数研究表明,分化的细胞产生胰岛素的能力有限或缺乏葡萄糖刺激的胰岛素分泌在体外。

它也表明,一些转基因细胞未能表达适当的细胞标记如NKX6-1 PDX-1或异常coexpress胰高血糖素等激素(1,2,19]。最近,梅尔顿集团glucose-responsive生成β肽从人类多能干细胞(hPSC)使用一个可伸缩的差异化协议。这些stem-cell-derivedβ肽表达标记中成熟β肽和分泌大量的胰岛素与成年人β肽在应对多个连续的葡萄糖挑战1]。这种方法最初似乎有望临床试验;然而缺点畸胎瘤的形成和自身免疫等尚未解决(20.]。

在目前的研究中,我们选择从成人胰岛细胞成熟猪胰腺的细胞来源β细胞生成。胰岛包含大量的内分泌细胞,如α肽,β肽,δ肽,除了祖细胞来自美国东部时间或初始msc。我们假设这些内分泌细胞和祖细胞更有可能向hormone-producing重新编程β从nonpancreas肽比其他细胞组织因为后者可能保留一些他们的胚胎发育的特点21]。产生数以百万计的功能β肽是具有挑战性的,重大的研究集中在再分化的细胞来完成这一目标。各种影响因素β细胞无血清培养系统更新已检查,如媒体,betacellulin, exendin-4,成分,肝细胞生长因子,细胞和聚合22]。然而,在大多数研究胰岛素mRNA水平已被证明是远低于在人类β肽。再分化之前,islet-derived细胞或其他祖细胞需要基本的数量增加了在体外扩散为了产生足够数量的小岛临床应用。

然而,islet-derived细胞或祖细胞容易失去它们的属性在体外,因为它是很难找到一个利基类似于自己的微环境在活的有机体内生存的必要条件。细胞失去在文化属性越多,越困难人员满足要求redifferentiating细胞回到他们的原生状态。在目前的研究中,我们专注于胰岛细胞数量的增多,他们的胰岛素生产能力在细胞增殖过程中,和培养条件对基因表达的影响,包括胰岛素,PDX-1,生长激素抑制素,胰高糖素和NeroD。我们发现所有基因表达在文化和大幅减少,细胞在媒体高葡萄糖胰岛素表达高于低葡萄糖媒体暗示β细胞去分化可以有效地减缓在一个合适的高葡萄糖条件下,虽然可以生成高质量的肉瘤与这些noncompletely胰岛总量β肽。

2。材料和方法

2.1。从猪胰脏胰岛的分离

胰腺组织是从女猪(),25 - 30公斤体重范围。组织通过脾动脉插管和刷新15毫升的冰冷的无菌威斯康星大学(uw)的解决方案。分离纯化胰岛进行按照修改后的程序前面描述的(23]。总之,胰腺是注入了100毫升新鲜酶解决方案,包括1.5毫克/毫升胶原酶P(11213873001,罗氏应用科学,印第安纳波利斯,IA)和100 U /毫升DNAse(σ)。20分钟后,酶消化在37°C水浴,胰腺受到1分钟轻微的机械破坏,然后透过450年μ米网过滤器。随后,小岛被OptiPrep纯化(Cosmo美国生物公司,卡尔斯巴德,CA)密度梯度分离。

2.2。细胞分裂

后立即隔离,猪小岛与冷洗两次磷酸缓冲盐(PBS),如上所述,悬浮在新鲜的酶解和孵化20分钟在37°C。小岛被分离成单个细胞通过上下移液5毫升移液管3 - 5分钟,然后透过40μm细胞尼龙过滤器。细胞计数和生存能力被台盼蓝排斥试验评估。

2.3。细胞培养

分离细胞被播种在细胞培养板(TCP)的密度200 - 300细胞/毫米²和培养在湿润的气氛中含5%二氧化碳。在这项研究中,两种类型的基底媒体应用,即百诺医学研究实验室中(cmrl - 1066)(σ)和杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM) (HyClone实验室),提供10%胎牛血清(的边后卫)(σ)或20%猪血清(PS)(σ),1% penicillin-streptomycin (HyClone实验室)和4.0μ谷酰胺(如表所示1)。中首次改变了3天,然后每隔一天后,当细胞达到融合和被治疗亚文化板块有0.05% trypsin-EDTA (GIBCO)。细胞的密度受移植者50 - 100细胞/毫米²在TCP和扩展。细胞培养的五个段落。population-doubling时间(根据(表示为小时)计算1),和细胞数量在时间吗和分别。

2.4。疣状

分裂的细胞在一个旋转的载玻片制作的速度1000转3分钟。培养细胞,他们被播种well-chamber 8日下滑。细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA)和PBS稀释15分钟。猪胰腺组织标本在福尔马林固定过夜,然后脱水,石蜡包埋组织处理器(瑞士徕卡ASP300S,徕卡Microsystems,阿弟克公司);6μ米部分削减在切片机(徕卡RM2255)。部分在二甲苯脱蜡、水化在下行系列乙醇溶液(99%,95%,90%,80%,70%,和水)抗原的性能之前检索在柠檬酸缓冲0.01 pH值6.0。疣状,细胞幻灯片/部分permeabilized Triton X100 2.0% 3分钟和阻塞与蛋白质在室温下15分钟块(X0909 Dako)的解决方案。细胞幻灯片/部分第一抗体孵育1小时45分钟的第二抗体室温。细胞核的细胞与DAPI染色安装解决方案(h - 1200、向量实验室)。主要使用单克隆抗体anti-insulin (I2018σ)和二级抗体是马anti-mouse免疫球蛋白德克萨斯红(向量实验室)。细胞幻灯片/部分使用徕卡荧光显微镜检查,模型与打印大师DMI54000B retiga - 2000房车相机。

2.5。定量实时聚合酶链反应(qTR-PCR)

qTR-PCR分析中,我们使用小岛汇集来自不同猪胰脏器官,细胞消化分离。基因表达的分析是进行细胞从不同的猪和代表性的结果。总RNA分离使用PerfectPure RNA从细胞培养细胞工具包(美国马里兰州盖瑟斯堡5 ' Inc .,)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸制备使用高容量cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。在执行中存在20μL反应96 -孔板使用互补脱氧核糖核酸样本12.5 ng的总RNA。PCR引物是GAPDH (F: gtcggttgtggatctgacct R: gtcctcagtgtagcccagga), 18 srrna (F: gtaacccgttgaaccccatt R: ccatccaatcggtagtagcg)、胰岛素(F: cttcgtgaaccagcacctg R: cttgggcgtgtagaagaagc) PDX-1 (F: tcccgtggatgaagtctacc R: cttgttctcctcgggctct)、生长抑素(F: gctctctgaacccaaccaga R: gaaattcttgcagccagctt),胰高糖素(F: gatcattcccagctccccag R: gtgttcatcagccactgcac)和NeuroD (F: gagagccccctgactgattg R: gcccgagaagattgatccgt)。rt - PCR进行与这些引物在权力面前SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)ABI 7300实时PCR系统。分析了生物复制一式三份与GAPDH基因表达规范化或18 srna和褶皱变化决定使用方法。为了清楚地显示的相对差异基因表达,变化相对于GAPDH或18 srna)被用来设在数据;除了相对折叠变化达到列上标记的数字。察觉的荧光被设定为一个循环阈值(35)。

3所示。结果

3.1。胰岛分离和细胞培养

猪小岛被有效地消化分离成单个细胞悬液与可行性很高(超过85%可行的细胞由台盼蓝排斥染料)。我们测试的影响葡萄糖和血清来源(牛和猪)细胞增殖和形态。islet-derived细胞在组织培养盘子,连线速度缓慢和扩散是播种后观察到的只有2天。细胞的大小和形态变化从一个小型cobblestone-like形状大,纤维母细胞(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5807876)在连续的段落(P)。两个核心媒体,DMEM和CMRL islet-derived细胞,进行文化没有显著差异对细胞表型和增殖的影响。然而,有一个不同的细胞增殖与20%相比,媒体包含10%的边后卫猪血清(PS)(图1)。的仍然相当恒定在细胞培养的边后卫,在5通道,大约60个小时。相比之下,在媒体包含PS值急剧增加,从65到186小时在P1和P5,分别。高葡萄糖水平(4.5 g / L和1 g / L) (P5)对细胞倍增时间没有显著影响。

3.2。胰腺内分泌基因的表达在培养Islet-Derived细胞

分离胰岛细胞代表混合物,包括α肽,β肽,δ肽,间质细胞。疣状胰岛素的细胞培养细胞显示几个insulin-positive几天之后立即postcell播种和更低的数字3和6的文化(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。然而,insulin-positive细胞无法观察到P1和P2(数字2 (e)和2 (f))。血清来源和血糖水平在媒体上对这些结果有任何影响。

分析基因表达(mRNA)使用中存在进行细胞分离不同猪,和代表结果(数据3和4和补充图2)。胰岛素mRNA表达显示减少与增加细胞使。一般来说,水平下降了约50 - 100倍P0 P1,进一步减少了约10倍P1, P2,约5 - 20从P2、P3和P3, P4(图2 - 33(一个))。这些结果表明一个戏剧性的减少胰岛素mRNA当细胞第一次通过和更进步的减少与随后的段落。我们没有观察到显著不同胰岛素mRNA在猪血清和细胞生长之间的边后卫。另一方面,细胞在DMEM培养核心媒体显示高胰岛素信使rna与细胞培养在CMRL核心媒体。我们还没有确定这种差异的原因。类似的结果在分析胰岛素mRNA表达的规范化对细胞的表达GAPDH和18 srrna(补充图2 (A))。测试如果islet-derived细胞可以调节胰岛素基因表达增加血糖水平,分析胰岛素mRNA在媒体包含低和高葡萄糖,分别为1和4.5 g / L(图3 (b))。我们观察到适度增加胰岛素mRNA的血糖水平越高,但胰岛素使mRNA水平大大降低。这些结果表明,相对的部分β在使肽islet-derived文化大大减少在体外,但是他们可能保留glucose-dependent胰岛素表达能力。

自从islet-derived细胞包含一个混合的文化代表着不同的细胞类型的胰腺,我们分析了胰高糖素的表达(α肽)和生长抑素(δ肽)。胰高血糖素和生长激素抑制素mRNA水平下降了约10倍,每个通道P0从P1 P1和P2(数字3 (c)和3 (d))。但是,与胰岛素的反应媒体葡萄糖,葡萄糖水平并没有产生重大影响,低和高胰高血糖素和生长激素抑制素mRNA的表达。

3.3。胰腺Islet-Derived培养细胞中转录因子的表达

PDX-1被认为是一个“主调节器”胰腺细胞分化的基因,表达的α肽和β肽(2]。我们检查Pdx-1 mRNA水平在不同文化条件下,在多个通道(数字4(一)和4 (b)),所述胰岛素mRNA。Pdx-1 mRNA水平下降只有约2倍P0 P1,相比更戏剧性的减少胰岛素mRNA(图3)。减少Pdx1 mRNA之间更大的P2和P3和P3和P4之间,分别为4和5(图4(一))。类似于胰岛素mRNA,只有血清来源的边际影响,PS的边后卫,但与胰岛素,只有边际效应的核心媒体类型,DMEM和CMRL,以及血糖水平,低和高。当Pdx1 mRNA表达规范化也获得了类似的调查结果对细胞的表达18 srrna(补充图2 (A))。

NeuroD是另一个胰腺转录因子参与分化内分泌胰腺祖细胞的祖细胞(8]。NeuroD mRNA表达islet-derived细胞与细胞通道数量逐渐减少,由P0 3-10-fold P1和3-4-fold从P1, P2,和血糖水平并没有产生重大影响,低和高(图4 (c))。

4所示。讨论和结论

正在尝试生成代理glucose-responsive,分泌胰岛细胞为目的的实现细胞治疗近年来和晚期T2D多个在体外方法已经磨练提高效率和功能成熟的glucose-responsive分泌胰岛细胞(24- - - - - -30.]。ES和iPS细胞,而经常被用作最受欢迎的细胞群开始,有一些关键的缺陷。例如,需要有效的差异化协议引起永久性的β细胞表型在活的有机体内,避免形成减少了这种方法对临床翻译的效率。Trans-differentiation不同体细胞类型,如肝细胞和外分泌胰腺细胞,有概念和务实的优势。两个细胞类型发育接近胰岛内分泌组织,因此不太可能需要大量分化的努力(21]。此外,因为它们是终末分化细胞形成畸胎瘤是不可能的。因此,我们选择使用islet-derived细胞由于胰岛内分泌细胞的比例很高。我们检查了2细胞增殖的重要方面,作为体内胰岛意味着开发替代能源在体外细胞增殖率和胰腺癌基因的表达包括胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素,以及胰腺转录因子Pdx1 NeuroD。

我们选择crml - 1066和DMEM基底媒体,提供10%的边后卫或者20% PS。使细胞增加,符合的结果当et al。15]。尽管我们发现媒体补充20% PS更兼容猪细胞,我们的研究结果还表明,细胞培养在媒体补充的边后卫较低为10%。观察的确切原因还不清楚,但可能由于过度生长因子水平在胎儿血清。我们观察到的数量的急剧减少insulin-positive细胞和胰岛素mRNA表达在次文化,类似于为人类胰岛细胞[结果报告31日和当et al。15]。此外,我们的结果也显示类似的胰高血糖素和生长激素抑制素mRNA表达下降。另一方面,Pdx1和NeuroD mRNA表达的下降是慢于胰岛素,即使2连续的段落。在一起,这些结果表明,尽管我们观察到的快速分散的胰岛细胞功能的缺失在文化、islet-derived细胞可能维持胰腺“身份”扩展胰腺转录因子的表达。

葡萄糖在哺乳动物体内平衡需要适当的调节胰岛素分泌胰岛细胞(32]。β通过钙信号肽对血糖水平增加,导致膜去极化和钙离子的流入,这引发胰岛素胞外分泌[1]。高葡萄糖浓度导致trans-location核外围的Pdx1核浆与随之而来的胰岛素基因转录(32,33]。β肽通常保持在一个非常狭窄的范围内的葡萄糖浓度大约0.65 g / L,但当被迫的环境甚至轻度高血糖表型和功能改变(34]。一些先前的研究使用高葡萄糖水平诱导细胞分化β细胞,刺激表达和释放胰岛素。例如肝细胞可以有效的内分泌细胞表型分化成高葡萄糖在无血清培养基(4.5 g / L)和苯丙酸诺龙,和分化细胞被证明含有c -肽和释放胰岛素生理血糖水平(35]。Racanicchi等人也为新生儿猪liver-derived祖细胞和评估其trans-differentiation能力为胰腺endocrine-like细胞,表明高葡萄糖浓度在媒体上(2.7 g / L)改善了分化过程(36]。同样,拉斯等人证明肉瘤β肽可以通过刺激redifferentiated高葡萄糖水平(4.5 g / L) 2天中胰岛素的表达媒介,Pdx1, MAFA随时间显著增加(37]。在目前的研究中,只有胰岛素表达显著影响葡萄糖水平。我们发现胰岛素表达高出4 - 18倍高葡萄糖媒体相比低葡萄糖在连续3通道,表明细胞维持的能力“感觉”葡萄糖和胰岛素表达上调。

在目前的研究中我们假设肉瘤islet-derived细胞可能生成分泌细胞的一个好来源,因为他们可能会更容易redifferentiate回β肽表现型。我们的研究结果表明,虽然功能基因的表达,如胰岛素胰高血糖素和生长抑素细胞使大幅减少,胰腺转录因子的表达,如Pdx1和NeuroD期间保持长期的文化。这些结果表明,islet-derived细胞可能适合再分化协议重新获取β细胞表型。虽然还需要更多的研究,但这些对未来初步结果是令人鼓舞的β细胞治疗糖尿病。

相互竞争的利益

没有利益冲突有关。

补充材料