文摘
受损的糖尿病患者的伤口愈合是一种严重的并发症,往往会导致截肢甚至死亡与有限的有效的治疗方法。Tuo-Li-Xiao-Du-San (TLXDS),耐火伤口的中药配方,在中国已经规定了近400年,显示了良好的效果在促进愈合。在这项研究中,我们探讨了TLXDS对糖尿病伤口愈合的影响,调查潜在机制。4周静脉注射链脲霉素后,两个全层切除伤口创建与10毫米直径无菌活检穿孔的老鼠。TLXDS得到了每天一次的乙醇提取物口服填喂法。伤口面积、组织学改变、炎症、血管生成和胶原蛋白合成。TLXDS治疗显著加速治愈糖尿病的老鼠和提高治疗质量。这些影响与减少嗜中性粒细胞浸润和巨噬细胞相关积累,增强血管增生和胶原沉积增加。这项研究表明,TLXDS提高diabetes-impaired伤口愈合。
1。介绍
无法愈合的伤口是糖尿病的标志和nontraumatic下肢截肢的主要原因。一个人的终生风险发展一个慢性糖尿病足溃疡可能高达25%1]。然而,治疗它是有限的,成本高2]。因此,开发有效的和经济的疗法纠正糖尿病伤口愈合受损临床需求迫切。糖尿病影响伤口愈合通过放大炎症反应,抑制血管生成,减少细胞外基质(ECM)沉积(3]。理想的治疗依赖于纠正多个赤字同时通过高度集成的治疗方法。中药(TCM)的特点是使用草药配方,通常由两个或两个以上的草药组合,可以有效地产生协同效应的总和要大于个人的影响和减少副作用,为糖尿病溃疡提供新的治疗策略。研究表明,结合中医传统治疗在糖尿病伤口管理收到更好的临床结果4]。
Tuo-Li-Xiao-Du-San (TLXDS)是一种精制中药配方组成的四种草药:Danggui (基数当归),黄芪(黄芪),Baizhi (白芷),和Zaojiaoci (Gleditsia的荆棘的比率),5:5:4:4(15克,前两个和后两个12克)。它来源于“正统手册手术”(“围柯郑宗庆后”)由一个著名的中医医生制定Shigong陈在公元1617年,已被用于治疗各种耐火材料的伤口,包括压力溃疡,下肢静脉溃疡,脓肿,痈。在中医理论中,TLXDS包括“陀”为代表的治疗方法基数当归和黄芪和治疗方法为代表的“石头”白芷和荆棘Gleditsia制成。治疗的方法“陀”意味着提高“气”(生命力)和滋养“血液”(身体循环),尽管治疗方法的“石头”是指环境,消除毒素清洗伤口。每一个草的药理作用在TLXDS,黄芪作为“气“补药5),当归规定是血液循环催化剂(6];白芷被列为sweat-inducing药物能够对抗有害的外部影响皮肤,如冷、热、湿、和干燥7];的荆棘Gleditsia sinensis已被用于治疗炎症性疾病,包括肿胀、化脓,痈,皮肤病(8]。数百年的实践已经证明的伤口愈合效果TLXDS各种耐火材料的伤口(9],草药的药理作用TLXDS表明它可能是一个潜在的治疗糖尿病伤口。然而,TLXDS对糖尿病伤口愈合的影响还没有被探索过。本研究的目的是评估的有效性TLXDS糖尿病伤口上使用一个变形的糖尿病大鼠皮肤伤口的体外实验模型并澄清其活动机制,免疫组织化学,存在,免疫印迹分析。
2。材料和方法
2.1。制备Tuo-Li-Xiao-Du-San乙醇提取
Tuo-Li-Xiao-Du-San由四个草药,黄芪,当归,白芷和荆棘Gleditsia sinensis的比率,5:5:4:4 (15 g为前两个和后两个12克)。草药是获得和认证由助教制药集团有限公司(天津)。四种草本植物的70%乙醇提取物的混合物是由制药科学系的,天津中医药大学(天津)使用标准化的过程10,11]。短暂,原油草药是动力,然后由70%乙醇提取了三遍。收集提取和过滤去除固体片段。冷冻干燥的溶剂被移除。冷凝是储存在-20°C。提取是刚做好的无菌水溶解的适当浓度的草药解决方案后的实验。
2.2。动物
Sprague-Dawley雄性大鼠(,10周大,SPF)重290±10 g是购自北京HFK生物科学有限公司有限公司(中国,北京)。老鼠被安置在无菌条件下在中国医学科学院&北京协和医科大学生物医学工程研究所的SPF动物设施(天津)。老鼠保持在控制温度(22 - 25°C)和相对湿度(50% - -60%)12 h光暗周期和美联储商业颗粒食物,食物和水随意。本研究天津医科大学实验动物伦理委员会批准,所有程序与动物遵守规则指导实验室动物保健和使用的美国国立卫生研究院以及动物福利法案的指导方针。
2.3。诱导的糖尿病
通宵禁食后,糖尿病是由一个单静脉注射STZ诱导(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)的剂量50毫克/公斤体重在0.1 mol / L citrate-phosphate缓冲区,pH值4.5。单独控制老鼠注射柠檬酸缓冲。血糖浓度监测使用Accu-Chek英杰华glucometer(德国罗氏诊断GmbH)从尾静脉血液。动物随机血糖水平≥16.7更易/ L连续三测试被认为是糖尿病。
2.4。伤口模型和TLXDS治疗
像之前描述的那样愈合模型大鼠诱导(12]。4周注射STZ后,控制和糖尿病大鼠麻醉戊巴比妥钠腹腔注射(30毫克/公斤体重)。老鼠的背侧的头发剃和两个10毫米直径全厚度伤口创建无菌活检穿孔。糖尿病老鼠被随机分配给糖尿病治疗TLXDS (DM + TLXDS集团)和糖尿病药物治疗(DM组,),而非糖尿病的老鼠被放置在正常对照组(NC组,)。老鼠的三组被随机分配到四个实验结束点(即。天5、8、11、14日7 - 10动物为每个终点)。老鼠在TLXDS组TLXDS乙醇提取1.1毫升/ 0.2公斤体重每天每天口服填喂法从次0到每一个终点,和老鼠在数控和DM组1.1毫升/ 0.2公斤体重每天口服填喂法水一次。每个草药用于老鼠的剂量为1.5克/公斤体重当归和黄芪1.2克/公斤体重白芷和Gleditsia sinensis荆棘,计算根据病人使用的剂量(0.25克/公斤和0.2克/公斤,职责)。在每个实验终点,安乐死的动物同时被杀。
2.5。宏观分析
每隔一天溃疡拍摄的数码相机。完全封闭的百分比计算溃疡与NIH形象J分析仪通过跟踪伤口边缘和计算像素区域。伤口闭合是按照百分比计算封闭=[(0−天开放地区最后一天)/区域0]天×100。
2.6。免疫组织化学
伤口,加上皮肤完好无损的利润,被切除,用10%甲醛固定,嵌入式和石蜡。部分(4μ米厚的)然后deparaffinized水化。抗原检索进行了微波在95°C的0.01 mol / L柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)。内源性过氧化物酶活性被暴露到3% H淬火2O2。与5% BSA在PBS阻塞后,部分被孵化与anti-CD68(1: 100年,热费希尔科学),anti-MPO(1: 100年,热费希尔科学),anti-CD31(1: 200年,圣克鲁斯生物技术),anti-desmin(1: 100年,热费希尔科学),我anti-collagen(1: 100年,热费希尔科学),分别,其次是孵化与相应HRP-conjugated二级抗体。抗原抗体复合物与Diaminobenzidine可视化工具包(涂)。染色的评价,积极信号密度的概述是半定量的得分为1(缺席),2(低),3(媒介)、4(强)和5(强烈)。中位数的分数从三个观察员,盲目的治疗,用于比较。
2.7。胶原蛋白估计(羟脯氨酸内容)
伤口组织羟脯氨酸含量进行了分析,这是胶原蛋白的基本组成部分。胶原蛋白的氨基酸组成(羟脯氨酸)是细胞外组织的主要组成部分,它给人力量和支持。分解胶原蛋白释放自由羟脯氨酸肽。测定羟脯氨酸因此可以用作生化标记组织胶原蛋白和胶原蛋白营业额的指数。使用羟脯氨酸羟脯氨酸含量进行了分析测定工具包(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示。稀释10µ1毫克/毫升的L羟脯氨酸与90年标准溶液µL水准备0.1毫克/毫升标准的解决方案。添加0、2、4、6、8、10µ0.1毫克/毫升的L羟脯氨酸标准溶液变成一个96孔板,产生0(空白),0.2,0.4,0.6,0.8和1.0µg /标准。100年同质化10毫克组织µL水并把它转移到2.0毫升聚丙烯管。增加100µL(浓盐酸(HCl, ~ 12米),盖紧,水解为3小时在120°C。转移10 - 50µL的上层清液96板。将盘子放在一个60°C烘箱烘干样品。增加100µL的氯胺T /氧化缓冲混合物每个样本和标准。在室温下培养5分钟。增加100µL(每个样本的稀释DMAB试剂和标准以及孵化90分钟60°C。测量吸光度在560 nm (A560)。计算样品的浓度
2.8。实时定量聚合酶链反应
大鼠溃疡的总RNA提取使用试剂盒(表达载体,宏伟的岛,纽约)。RNA纯度和完整性被光度分析评估。总共3µg的RNA reverse-transcribed使用RevertAid工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)都使用了CFX96实时PCR系统(美国Bio-Rad) SYBR绿色PCR试剂盒(豆类,大津,日本)老鼠VEGF-A PDGF-BB, il - 1β和肿瘤坏死因子-α。引物序列如下:VEGF-A 5′柠檬酸AAC CTC ACC AAA GCC 3′, 5′GGT GAG gg TCT AGT苑3′;PDGF-BB 5′公司治理文化CTG CTG CAC AGA广汽3′,5′20 CGA手枪玻纤棉酚CAC 3′;对il - 1β5′AGA AGA AGA TGG AAA AGC 5′和3′CCA TTG CTG TTT有条件现金转移支付3′;肿瘤坏死因子-α5′太极拳CAG GTT CTC TTC亚美大陆煤层气有限公司G 3′, 5′GTA猫GGG CTC ATA CCA G 3′;GAPDH 5′TAC CCA CGG CAA GTT CAA CG 3′, 5′CAC CAG猫CAC CCC攻击力TG 3′。GAPDH基因被定义为参考。数据进行分析方法。
2.9。免疫印迹分析
蛋白质含量VEGF-A PDGF-BB, il - 1β和肿瘤坏死因子-α在溃疡组织匀浆免疫印迹进行评估。总之,匀浆蛋白质浓度的测定采用BCA蛋白质化验(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)。等量的蛋白质样品(30μg)在SDS聚丙烯酰胺凝胶分离和转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(微孔)。在TBS阻塞后含有5%脱脂牛奶在室温下2 h,一夜之间,细胞膜被孵化与1:1000稀释anti-VEGF-A (Abcam), 1: 2000稀释anti-PDGF-BB (Abcam), 1: 200稀释anti-IL-1β(圣克鲁斯生物技术),1:500稀释anti-TNF -α(Abcam), 1: 8000稀释反β肌动蛋白(天津Sungene生物科技有限公司),分别。绑定的主要使用HRP-conjugated二级抗体检测抗体(天津Sungene生物技术有限公司)。积极乐队使用ECL可视化工具包(Bio-Rad),然后在x射线胶片捕获。管家蛋白β肌动蛋白被用作加载控制。每个乐队的密度量化使用数量一个软件(Bio-Rad实验室)和归一化各自的控制。
2.10。统计分析
数据意味着±SEM。使用SPSS 16.0软件进行统计分析。单向方差分析(方差分析)测试是用来确定统计学意义。被认为是表明一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。糖尿病诱导和血糖水平
在四周糖尿病诱导期,90%(72/80)的STZ-injected老鼠成为持续高血糖的纳入本研究。在治疗期间,DM组大鼠的血糖水平和DM + TLXDS组明显高于那些老鼠的NC组(),DM组之间没有显著差异是观察和DM + TLXDS集团(),这表明TLXDS没有对血糖的影响(图1)。
3.2。管理TLXDS加速伤口愈合
如图2年底,观察受伤后(14天),非糖尿病患者的伤口完全愈合,而大多数的糖尿病患者的伤口仍有较低的平均开放关闭率为61.6%。TLXDS开始显著改善糖尿病伤口闭合伤后4天(分别为24%和14%,年底),观察,TLXDS糖尿病伤口的愈合率增加了25.2%(分别为86.8%和61.6%,)。
(一)
(b)
(c)
3.3。管理TLXDS减少炎症细胞浸润和刺激炎症决议
不受控制的糖尿病伤口的炎症是一个主要的特征。我们评估组织学变化,他在第五天(图染色3(一个))和中性粒细胞和巨噬细胞的数量在伤口部位确定持续表达的分子标记MPO(中性粒细胞)和CD68(巨噬细胞)在14天(数字3 (b),3 (c),3 (d))。炎症细胞的浸润和伴随的组织坏死与非糖尿病患者相比,糖尿病伤口是强大得多的伤口在5天(图3(一个))。此外,未经治疗的糖尿病大鼠的炎症分辨率明显推迟,以增加和长期中性粒细胞和巨噬细胞涌入14天(图3 (b))。管理TLXDS导致炎症细胞浸润明显减少和组织坏死5天和加速解决中性粒细胞和巨噬细胞在14天()。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。TLXDS增强新血管形成和肉芽组织沉积增加
新血管形成肉芽组织的发展是一个重要的事件。我们评估了增长和成熟的血管内皮细胞组织化学染色标记CD31和周皮细胞标记肌间线蛋白,分别(图4)。未经治疗的糖尿病伤口的血管密度明显减少与非糖尿病患者相比,伤口(),新船的周皮细胞覆盖率是离散的和不完整的。TLXDS显著提高糖尿病患者的血管新生治疗伤口,证明了增加CD31染色。此外,外膜细胞招聘被TLXDS政府恢复,表明新船在TLXDS治疗伤口更成熟,稳定,和功能。
(一)
(b)
(c)
同时,马森的三色的染色和I型胶原免疫组织化学显示,ECM的沉积在糖尿病伤口伤后第14天明显受损较非糖尿病患者的伤口,由政府恢复TLXDS(图5)。一致,糖尿病伤口中羟脯氨酸含量显著降低与非糖尿病患者相比,伤口在14天(5.42±0.29和12.03±0.24µg /毫克组织,)。管理TLXDS糖尿病溃疡中羟脯氨酸含量增加14天(7.38±0.22和5.42±0.29µg /毫克组织,)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。管理TLXDS增加血管生成因子的表达和减少炎性细胞因子的表达
受损的血管新生因子生产占糖尿病伤口的新血管形成妥协。因此,我们执行实时聚合酶链反应和免疫印迹调查TLXDS是否增加新血管形成通过增加血管新生因子表达式。正如预期的那样,VEGF-A和PDGF-BB糖尿病伤口未能上升5天受伤后启动血管生成反应与非糖尿病患者相比伤口(数字6(一),6 (c),6 (d),6 (g),6 (h))。TLXDS VEGF-A增加和PDGF-BB表情后第五天受伤当活跃的血管生成正经历()。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
TLXDS刺激炎症在糖尿病伤口决议。因此,我们调查了TLXDS对炎性细胞因子表达的影响在两个基因和蛋白质水平。受伤后11天,炎性细胞因子的表达,如il - 1β和肿瘤坏死因子-α在糖尿病伤口,明显高于非糖尿病患者的伤口(),TLXDS显著减少这些炎性细胞因子的表达(数字6 (b),6 (e),6 (f),6(我),6 (j))。
4所示。讨论
伤口愈合受损是糖尿病的严重并发症,导致长期住院,甚至截肢。然而,有有限的有效和安全的治疗方法。在这项研究中,我们证明了中药配方难治性溃疡,名叫Tuo-Li-Xiao-Du-San (TLXDS),显著提高伤口愈合STZ-induced糖尿病大鼠通过减少炎症,增加血管增生和胶原沉积。
伤口经过三个顺序和协调阶段,炎症、组织形成,和组织重构,恢复形态和功能完整性(13]。糖尿病影响伤口愈合通过放大炎症反应,抑制血管生成,减少ECM沉积(3]。炎症是急性皮肤损伤后的第一个和不可或缺的响应,通常在受伤后不到5天(下沉14]。然而,代谢缺陷,高血糖和氧化应激等,诱发过度促炎细胞因子(il - 1β肿瘤坏死因子-α等)的生产(15,16),维持长期大量中性粒细胞和巨噬细胞14,17,18]。如目前的研究(图所示3),糖尿病患者的伤口仍在大量炎症细胞浸润和明显的组织坏死5天受伤后,虽然非糖尿病患者的伤口已经愈合的增殖阶段推进。此外,受伤后14天,中性粒细胞和巨噬细胞在糖尿病伤口仍然充足。持续炎症细胞创建一个蛋白酶(中性粒细胞弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶和白明胶酶)丰富的充满敌意的微环境(19),导致细胞外基质和生长因子退化(20.,21]。因此,糖尿病伤口被禁锢在一个自我维持的慢性炎症和永远不会足够成熟的循环前进到下一个阶段的治疗。目前的研究表明,管理TLXDS显著加速炎症决议通过减少炎性细胞因子的表达,如il - 1β和肿瘤坏死因子-α,从而减少中性粒细胞和巨噬细胞丰度在糖尿病伤口。减少炎症TLXDS治疗可能会为其他修复提供良好的微环境细胞在伤口愈合中发挥应有的作用。
为了应对缺氧损伤后,内皮细胞和周是被从现有船只和增殖形成新的血管生成因子和血管功能提供必要的氧气和血液供应再生新组织,这一过程称为新血管形成(22,23]。新血管形成不足是一个糖尿病伤口愈合的基本特征。这个障碍机制研究很多,现在研究者广泛接受,血管生成生长因子的生产不足,VEGF和PDGF等,是一个根本原因(24- - - - - -26]。在这项研究中,我们观察到TLXDS恢复diabetes-impaired新血管形成通过增加招聘的内皮细胞和周。TLXDS机制在促进血管生成的影响糖尿病患者的伤口可能是相关的,至少部分的校正减少血管生成生长因子的生产,如VEGF-A和PDGF-BB,证明了在这个研究。
此外,马森的三色的染色和I型胶原免疫组织化学显示TLXDS治疗糖尿病伤口显著增加胶原蛋白的生产,这是重要的功能恢复和愈合质量27]。这种效应可能是次要的联合行动减少炎症和血管生成增加,因为ECM的降解是减少和合成燃料。
复合公式,通常称为“FuFang”在中国,是组合在中国中医处方治疗各种疾病。草药的治疗效能添加剂,甚至协同,当用作组合。这是一个很大的优势在中药复合公式。在中医理论中,TLXDS的治疗方法包括“陀”这意味着增加“气”(生命力)和营养的“血液”(身体循环)和治疗方法“石头”这意味着清洗伤口环境和消除毒素。最近的研究显示选民的“TOU方法”,白芷和荆棘Gleditsia sinensis,具有抗菌和抗炎活性28,29日];“陀的成分的方法,”黄芪和当归,促进血管生成和血管生成生长因子的表达30.,31日]。通常,数百甚至数千年的临床实践已经在中医优化公式。目前的研究表明,TLXDS改善糖尿病治疗受伤表示在古代中医理论和现代文学研究。有巨大的可能性,结合“金银铜法”和“陀法”可以产生互补和协同效应。极大的兴趣在未来为我们揭示是否多效性的影响在糖尿病大鼠糖尿病伤口愈合的TLXDS归因于陀法和石头法之间的协同作用。此外,澄清TLXDS中的活性成分具有十分重要的现实意义。
值得注意的是,在糖尿病溃疡和糖尿病足溃疡愈合与许多慢性疾病是复杂的,包括长期控制高血糖,末梢血管疾病,神经病变,感染伤口网站过度压力,二次损害免疫(2]。致病性异常会导致另一个,发展恶性循环的致病性糖尿病慢性溃疡。考虑人类糖尿病足的异质性和复杂性,没有一个动物模型能够全面概括每个临床场景(32]。在目前的研究中,我们采用一种广泛使用的伤口STZ-induced糖尿病动物模型(33,34模拟糖尿病患者的高血糖的状态和其对伤口愈合障碍。结果表明,TLXDS治疗可以纠正不正常的愈合过程诱导高血糖通过减少炎症,血管生成增加,胶原沉积。TLXDS能否改善其他异常导致糖尿病足,如血管疾病和神经病变,将是一个建设性的调查方向进一步研究工作通过使用适当的动物或细胞模型。和这些发现是否可以推断的情况中遇到糖尿病足患者仍需要进一步研究在临床试验中。
总之,本研究表明,TLXDS难治性溃疡的中药配方,对diabetes-impaired伤口有积极影响。改善伤口愈合与减少炎症,血管生成增加,胶原沉积TLXDS治疗后。传统的口服中药可以提供另一种治疗糖尿病足溃疡的有效方法。
利益冲突
所有作者声明没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
马Xiao-na张Ze-jun Cong-qing锅,跟包陈设计研究;yu zhu Xiao-na张Ze-jun Ma Ying Wang,贝太阳,和郭鑫进行研究;Xiao-na张和Ze-jun马写的论文。马Xiao-na张和Ze-jun这项研究同样起到了推波助澜的作用。
承认
这项工作得到了国家自然科学基金(81273916和81273916号)。