文摘
急性暴露于高葡萄糖水平的影响在餐后经历了由肾小球系膜细胞等条件和国家在使用蛋白质组学方法研究了前驱糖尿病。二维凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法用于识别蛋白表达模式的永生化大鼠系膜细胞改变2 h葡萄糖(HG)高速增长条件相对于等渗的/正常血糖控制()条件。独特的蛋白表达变化2 h HG 51治疗测定蛋白质斑点。这些蛋白质可以大致分为两类:(1)蛋白参与细胞生存/细胞信号和(2)蛋白质参与应激反应。属于两个类别的蛋白质免疫印迹实验,prohibitin (PHB),支持趋势增加总表达式以及大幅增加在酸性PHB同种型。额外的研究证实蛋白酶体亚基的规定alpha-type 2和内质网伴侣和氧化还原酶PDI(蛋白二硫化物异构酶),建议改变ER蛋白质折叠能力和蛋白酶体功能,以应对急性HG。我们认为短期高葡萄糖诱导蛋白质丰度细微变化表明转译后的修改和调节通路参与proteostasis。
1。介绍
肾肾小球系膜细胞(gmc)功能改变在糖尿病肾病慢性暴露于高先进糖葡萄糖(HG)或暴露于糖化白蛋白(1- - - - - -4]。早期的高血糖的影响被认为是由血流动力学因素包括肾小球反渗透法和剪切应力导致的损害由微蛋白尿或蛋白尿(5- - - - - -10]。糖尿病肾病的早期组织病理学特点是肾小球基底膜(GBM)的增厚和积累在肾小球系膜细胞外基质(ECM)。慢性高血糖的危害在各种肾脏肾小球系膜细胞等细胞类型,足细胞和内皮细胞有强烈的研究。的理论解决包括增加衬底引导多元醇通路和己醣胺途径和增加产量的活性氧(ROS)和激活的蛋白激酶C(通过晚期糖化终产物(年龄),甘油二酯(DAG),和/或活性氧(ROS)) (11- - - - - -13]。这些进步在我们了解慢性高血糖对肾的影响生理却丝毫没有理解的影响急性(2 h)高血糖的偶然条件所经历过的细胞像GMC前驱糖尿病等州。我们假设理解这些急性高血糖引起的变化可能产生深入的机制慢性高血糖破坏机制用于维护正常肾小球功能。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
河鼠GMC线crl - 2573(写明ATCC)维持正常生长媒体(的边后卫DMEM: 5毫米葡萄糖,15%)低于5%股份有限公司2在37°C。细胞(段落10 - 15)镀在康宁T25烧瓶和培养直到融合了70 - 80%。正常的媒体被移除细胞,取而代之的是DMEM补充0.5%葡萄糖的边后卫/ 5毫米。24小时后,媒体被拆除,代之以isoosmotic-normal葡萄糖()媒体(DMEM-5 mM葡萄糖、甘露醇20毫米,和0.5%的边后卫)或高葡萄糖(HG)媒体(DMEM: 25毫米葡萄糖,0毫米甘露醇,和0.5%的边后卫),2 h。2 de分析,收集2 h治疗后,血清总蛋白(如前所述)(14使用蛋白酶抑制剂的IPG补液缓冲补充。
2.2。细胞生存能力
细胞生存能力2 h HG和后确定治疗使用MTT测定[15按照制造商的描述(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.3。二维电泳(2 de)和图像采集
2 de实验报道之前(14]。小鼠GMC蛋白质(75μg)在一夜之间,患者为IPG (pH值3 - 10;7厘米;英杰公司)条。加沙地带集中总共1200 - 1300 Vh与最后一个30分钟集中在2000 V期不变。蛋白质分离在第二维度在4 - 12% Bis-Tris迷你凝胶(8厘米×8厘米)。这种凝胶板固定在10%甲醇和7%乙酸,然后转移到SYPRO-Ruby蛋白质凝胶染色(美国俄勒冈州分子探针)18个小时。凝胶进行扫描使用PerkinElmer ProXpress CCD-based数码成像仪在50岁μm分辨率。凝胶/污点暴露和发射采集时间不同探测器响应最大化,同时避免探测器饱和。图像文件匹配,参考创建凝胶和现货成交量决定使用初期发育发现软件(非线性动力学、纽卡斯尔、英国)。一个学生的以及用于评估所有匹配点对。蛋白质斑点,发现变量相比,在样本统计量的地方发现均值和SEM。
2.4。蛋白质组学分析
蛋白质凝胶斑点消化如前所述[14]。MALDI-TOF和TOF / TOF MS数据获得的胰蛋白酶的消化使用AB4700蛋白质组学分析仪(应用生物系统公司,培育城市,CA)和分析科学吉祥物(版本使用矩阵。2.0)如前所述16]。数据分析假设(一)单一同位素的肽质量,(b)半胱氨酸carbamidomethylation,蛋氨酸氧化(c)变量,(d)最大的错过了胰蛋白酶劈理,和(e)大于150 ppm的质量精度为0.3 MS数据和Da MS-MS数据对SwissProt(版本52.0,20070307)蛋白质数据库(261513序列;95638062残基)限制哺乳动物(50870序列)的类群。限制原始蛋白质的质量没有吉祥物搜索中使用。蛋白质识别被接受为标识,包括使用吉祥物MS + MS / MS分析重大MOWSE评分(;女士MOWSE得分60等于意义和MS / MS MOWSE肽离子得分仅40 =意义)。
2.5。共焦显微镜
共焦显微镜图像得到如前所述[17]。短暂,多室盖玻片井(Nunc Naperville, CT)与GMC细胞被播种。细胞被挨饿FBS-NG 0.5%血清培养基2 h葡萄糖治疗前24小时。细胞与PBS冲洗三次,含有钙、镁和固定在3.7%多聚甲醛在PBS 10分钟,其次是透化作用有0.025%在PBS NP-40了15分钟。细胞被孵化与主要抗体(1:250 anti-PHB NP-40 PBS / 0.025%)在20°C, NP-40冲洗5次与PBS / 0.025%,孵化Alexa萤石488共轭二次抗体(1:1000)在20°C。这些细胞被冲洗5次NP-40 PBS / 0.025%,孵化300 nM DAPI 5分钟,冲洗三次PBS。使用蔡司共焦显微镜图像获取和分析使用LSM510软件。Z扫描分析是由扫描1μ米的间隔和荧光图像的三维重建。图像的PHB和PHB DAPI被合并在一个单一的形象阐明细胞分布。荧光强度测量(平均荧光强度/μ米2)计算每个细胞(细胞每治疗复制治疗条件)和用于估计PHB核和胞质分布的差异。
2.6。蛋白质免疫印迹(IB)
1德和2 de蛋白质免疫印迹(IB)进行了如前所述[14]。总细胞溶解产物样本隔开2 de (汞、)。2 de IB分析、能源论坛后合作的系膜蛋白质,塑料的支持的条被修剪掉。酸性最带的是一致的的好Bis-Tris迷你凝胶毗邻MW标准minigel的车道。这个过程被保险人统一排列组条MW标准,为了比较的PHB实验条件之间的迁移模式。1德或2 de电泳和转让后,膜PHB在免疫印迹(圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯,CA)在1:1000稀释5%的白蛋白Tris-Tween-20缓冲盐水(ttb)。PHB斑点成像与鲁米诺电影图像对齐和量化微密度分析比较酸性第三的手段和基本的PHB三分之一的电荷列车总测密度术训练。额外的抗体用于1 de免疫印迹反PDI (Stressgen;圣地亚哥,CA)的浓度1:10000和PSMA2(细胞信号;丹弗斯,MA)的浓度1:1000。
2.7。分析的蛋白质表现的网络
独创性通路分析生物信息学工具(智慧系统,山景,CA)使用一个策划数据库(智慧系统知识库)先前发表的发现哺乳动物生物学从公众的文学评价蛋白质列表包含蛋白质的表达率表现模式。评价的目的是建立提供了表现的数据关系的列表内的蛋白质相互作用网络(例如,直接和转录控制蛋白质间交互作用)。分析蛋白质列表提交使用创造力知识库与表现的比率是用来识别直接哺乳动物之间的相互作用直接同源。
小鼠GMC蛋白质展示统计上显著的表达式2 h HG和2 h知识库是独创性的分析结果以及路径分析工具。数据输出识别节点描述单个蛋白质和边缘特征生物关系。假定的蛋白质网络命令根据排名值(),值是衡量随机协会列出的蛋白质。
2.8。统计分析
统计分析的相对位置像素从二维凝胶强度(每组2 h)和PHB的分析,PDI或PSMA2 HG和IB表达式是使用双尾执行,未配对以及。值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。蛋白表达的改变急性高葡萄糖
基于MTT测定结果(数据未显示),GMC可行性2 h HG之间没有统计学差异治疗方法。确定蛋白质由2 h HG治疗,蛋白质点体积列表是策划首先估计intergel变化与蛋白质现货量(平均为简历20匹配点= 0.17)。接下来,所有intraglucose治疗与凝胶点卷有简历大于0.35 (2×CV)被丢弃。51蛋白质斑点有现货体积小于0.35的简历和未修正的以及值≤0.05。35蛋白质点增加了表达和16个蛋白质点表达下降了2 h HG治疗和所有使用蛋白质组学方法分析了基于吉祥物MOWSE得分包括MALDI TOF / TOF肽碎片(序列标签)数据与意义值≤0.05的所有报道蛋白质的身份。代表2 de凝胶图像(带注释)和列表信息51(图提供了监管的蛋白质斑点1;表1)。一般来说,蛋白质鉴定都观察到在凝胶迁移正确分子量正负10%除了凝胶点5。Cofilin-1被迁移的分子量约9000 Da和π为5.3。Cofilin-1名义上的翻译分子量为18749 Da和π为8.2。两个额外的cofilin-1含有凝胶点以及一个HSP10含有凝胶点观察关注等电点pH值低于0.5单位,比预期的更酸。23蛋白质观察关注等电点pH值大于0.5单位,比预期的更基本。剩下的凝胶点确定蛋白质pH值在0.5单位的预期π。
3.2。分析的蛋白质表现的网络
生物信息学分析蛋白表达2 h和2 h HG是通过使用创新知识库和路径分析工具。排名前三的规范化途径决心被激活从2 h急性高葡萄糖暴露被ρactin-based能动性,RhoA信号,蛋白质泛素化途径。分析的蛋白质表现的网络从小鼠GMC 2 h和2 h HG蛋白质表现的数据显示三个主要表达网络。网络1(得分49)解决癌症、生殖系统疾病、血液疾病,包括25识别蛋白质的总网络组件(图352(一个))。网络2(19分)解决细胞死亡和生存,药物代谢,脂质代谢和包括9确定蛋白质的蛋白质节点(图352 (b))。网络3(得分14)解决细胞运动、细胞妥协,细胞功能和维护,并由7确定蛋白质的29种不同网络的蛋白质。著名网络内节点1是集中在信号包括蛋白质与蛋白质泛素化,细胞周期素D, ERK1 / ERK2 MAPKinase,一半,岩石,组蛋白h3和h4。著名的节点在网络2以VEGF, TNF, TGFβ1、肿瘤蛋白质53 (TP53)和泛素化。
(一)
(b)
3.3。免疫化学分析高葡萄糖的影响蛋白质的表达
免疫印迹(IB)分析选定的蛋白质被用来证实2 de发现。Prohibitin (PHB)被选为确认它是坚持最久的一个蛋白质斑点和监管也是一个组件IPA网络2直接与TNF的著名的网络节点。1德(数据的表达式3(一个)和3 (b))支持的PHB总丰度增加的趋势,但2 de IB分析HG 2 h GMC细胞培养的显示HG响应和统计学意义(PHB)增加酸性的火车(图4)。共焦显微镜(数据5(一个)和5 (b))表明,高葡萄糖导致统计学意义(值< 0.0001)增加部分大量的PHB在GMC的核心。
(一)
(b)
(一)
(b)
基于生物信息学分析定义规定的蛋白质泛素化途径的三大规范途径监管,以及著名的蛋白表达网络中节点1和2,我们接下来分析蛋白质的表达参与蛋白质体内平衡,发现它们是由2 de分析。蛋白酶体亚基alpha-type 2 (PSMA2)被证实在系膜细胞暴露于高葡萄糖浓度增加2 h(图6)。比较2 de分析还定义ER的表达下降伴护蛋白质如PDI GRP58,这可能会导致增加的负载在系膜细胞和诱导蛋白质的蛋白酶体降解过程。系膜蛋白免疫印迹分析PDI证实2 de PDI(图表达降低的结果6)。
4所示。讨论
gmc参与肾小球生长和分化以及调节肾小球血流量(3,4]。证实慢性高血糖,如在一个不受控制的糖尿病状态不利地影响肾小球和产生病理GMC表型(18- - - - - -22]。另一方面,存在知识差距GMC功能和蛋白质表达模式的变化发生在个体经验再餐后血浆葡萄糖水平升高(23]。因此确定短期的影响高葡萄糖条件下遇到的GMC subpathologic /前驱糖尿病的州,我们进行了蛋白质组学研究比较系膜蛋白表达2 h后HG 2 h后条件对系膜蛋白表达经济增长的条件。细胞生存能力的分析2 h治疗条件确定,系膜细胞生存能力不是减少了治疗条件和时间。观察到的蛋白表达差异之间的生长条件并不因此归因于变量程度的细胞增殖。表现的监管51确定蛋白质斑点的条件下观察2 h HG。这些蛋白质可以分组如下:细胞骨架蛋白,钙/磷脂结合蛋白,陪伴,扩散和signaling-related蛋白质。
增加血糖水平,刺激多种反应在GMC包括重塑的细胞骨架肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白等元素24]。两个调节点确定为cofilin-1 cofilin-2和演示了一个55 - 60%增加表达式。Cofilins肌动蛋白结合蛋白,肌动蛋白单体的流动影响的积极增长的肌动蛋白丝和肌动蛋白丝营业额增加。Cofilins绑定和切断指出肌动蛋白结束,增加肌动蛋白单体池。在压力条件下,cofilins参与核进口肌动蛋白(24]。两个蛋白质斑点展示表达减少了汞、确定为肌动蛋白限制蛋白质,蛋白质构成的限制β亚基,actin-like蛋白质3。这些蛋白质在预期的迁移和π。这些蛋白质分别演示了一个减少30%和50%在2 de凝胶。此外,中间丝蛋白的酸性对碘氧基苯甲醚波形蛋白表达下调。
Calpactin轻链(也称为S100A10或侯)功能的配体膜联蛋白II(膜联蛋白II2赛2)[25- - - - - -27]。Calpactin和膜联蛋白ⅱ所示是调节了约37%和23%,分别由急性高血糖的条件。Calpactin包裹膜联蛋白II是已知的与糖基的胞质磷脂酶A2和抑制cPLA2活动从而减少炎症反应从花生四烯酸的释放28]。Upregulation reticulocalbindin 3对于增加Ca的削减是必要的2 +。Ca的增加2 +反过来需要由其他蛋白质中发现reticuloplasm GRP78和PDIA3 [29日]。这些观察的调节肌动蛋白细胞骨架蛋白和钙结合蛋白表达的变化,当结合在一起,符合已知的系膜细胞反应HG慢性条件下(30.,31日]。
分子伴侣’都形容在文献中蛋白质质量控制经理,协助维护细胞功能在面对压力条件像热应力,渗透压力,或氧化剂应激。具体的陪伴是空间组织在整个细胞通过organellar本地化(32,33]。所有线粒体蛋白质合成的大部分细胞核转录的指导下在细胞质中34]。高分子量的蛋白质被贩卖,线粒体膜和线粒体基质和需要之间的蛋白质折叠女伴的PHB和HSP10等有效的蛋白质折叠(35]。包含的PHB的蛋白质点,可能造成酸性转译后的修改形式转变的PHBπ,2 de展览表现的监管,发现2 de IB和核本地化增加了共焦显微镜分析、急性(2 h)葡萄糖后暴露在gmc。PHB报道存在膜居民伴侣蛋白,参与蛋白质折叠途径的膜蛋白COX2p和COX3p mitochondrial-derived积分。此外,运动的PHB线粒体和细胞核之间可以发挥重要作用线粒体氧化压力和调节细胞凋亡信号和转录压力期间,强调这种蛋白质mitochondrial-nuclear沟通的重要性(36,37]。在当前的研究中,观察PHB酸性的增加,增加的PHB核本地化,HSP10增加和减少GRP75 2 h HG刺激表明急性高血糖的条件可以促进protein-structural线粒体基质内压力促进易位的PHB的原子核在gmc的决定的原因。此外,生物信息学分析分组的PHB和额外的蛋白质网络中由2 h HG包括已知介质参与糖尿病肾病的发病机制和纤维化,比如TGFβ、VEGF与肿瘤坏死因子(1,38),突出一个潜在的小说角色的PHB在GMC对汞的反应。
细胞周期控制的一个方面是polyubiquitination细胞质或核的蛋白质(39]。Polyubiquitination触发器的贩卖修改蛋白质的蛋白酶体降解。细胞周期控制的第二个方面是通过行使monoubiquitination核蛋白质如组蛋白(40- - - - - -42]。我们的观察与表达增加PSMA2特定于急性照射的细胞中含有高葡萄糖等渗的相比低葡萄糖中并建议蛋白酶体活动增加的可能性。这些发现支持的部分观测减少ubiquitinated系膜细胞胞质蛋白2 h高葡萄糖浓度(数据没有显示)。PSMA2表达的增加和减少的表达PDI显示急性暴露在高葡萄糖浓度调节通路参与proteostasis和/或细胞应激反应。呃,PDI是一个氧化还原酶女伴调节二硫键(43)及其活动是减少糖尿病小鼠的肝细胞(44]。此外,糖尿病小鼠的肾脏和肝脏也有减少的表达PDI (45,46]。在应对高葡萄糖PDI的表达下降可能改变蛋白质的成熟,引起应激反应,包括增加蛋白质被蛋白酶体降解。PDI系膜细胞中表达降低的机制急性暴露于高葡萄糖还有待定义。
总之,蛋白质组学数据和科学数据分析表明,小鼠gmc应对急性汞通过表达的蛋白质相关通路调节蛋白质转译后的修改和蛋白质的稳定性。这些严重的差异也可能是重要的细胞功能作为gmc的报道处理长更多的慢性高血糖的时间点的差异在特定蛋白质丰度如烯醇酶、肌动蛋白和膜联蛋白的蛋白质(30.]。
利益冲突
作者没有利益冲突披露。
承认
作者要感谢的支持资金来自美国国立卫生研究院K01-DK080951米歇尔·t·巴拉狄。