文摘

的目的我们的研究旨在分析免疫异常在慢性感染患者糖尿病足溃疡(dfu)特别是感染耐药微生物。方法。68在我们脚的诊所治疗的患者感染慢性dfu 34与糖尿病控制进行了研究。患者感染dfu分成两个子组根据因果病原体的抗生素敏感性:子群感染敏感( 由耐药病原体(R)和子群 )。选择免疫标记研究团体和子组之间的比较。结果。患者感染慢性dfu,与糖尿病控制相比,显著降低百分比( )和淋巴细胞总数( )涉及B淋巴细胞( )、CD4 + ( ),而CD8 + T细胞( )和他们的天真和记忆效应细胞。高水平的免疫球蛋白( )包括IgG1 ( )和IgG3 ( )被发现在患者dfu相比,糖尿病控制。血清免疫球蛋白水平的子类IgG2 IgG3相关负面和代谢控制( )。IgG2的频率增加的趋势缺乏患者被发现dfu相比,糖尿病控制(分别为22%和15%;NS)。子群R显示低水平的免疫球蛋白,尤其是IgG4 ( )与病人由敏感细菌感染。先天免疫学习小组之间没有显著差异。结论。适应性免疫系统的研究显示的变化主要是由低水平的淋巴细胞亚群及其记忆效应细胞,而且dfu患者体液免疫的变化,即使是那些感染耐药病原体,相比,糖尿病控制。

1。介绍

订婚后的过程中感染,先天免疫防御系统,激活适应性免疫。这种类型的细胞和体液免疫的免疫包括双分支。细胞免疫的主要效应物T淋巴细胞,而体液免疫的原理效应器B淋巴细胞(1]。适应性免疫的激活是由抗体的产生可以通过B淋巴细胞,例如,阻止病原体在粘膜表面的粘合,粘合细菌,或中和病原体在随后血液循环,激活补体2]。然后消除抗原T细胞或符合特定抗体进一步由B细胞(1]。

异常细胞介导免疫性,包括主要的免疫球蛋白的变化以及他们的子类,在免疫反应中扮演特定的角色,可能会进一步降低免疫功能(3,4]。即免疫球蛋白子类IgG1和IgG3补充催化剂通过绑定蛋白抗原的病原体。通常IgG2介导免疫反应多糖(细菌)抗原和opsonisation封装细菌(3]。子类IgG4结合蛋白质抗原的革兰氏阳性细菌和激活吞噬细胞。免疫球蛋白子类不足导致免疫防御微生物病原体的变更,从而增加重复感染的风险(5,6]。改变免疫球蛋白的子类在免疫功能低下的患者(具体描述7]。

免疫系统在糖尿病患者研究,但冲突的结果(8- - - - - -11]。面对慢性高血糖症(主要是超过10更易/ L),改变几个步骤的吞噬作用[12- - - - - -14)包括氧化破裂(15,16),偶尔选择的淋巴细胞亚群异常(17)以及免疫球蛋白(18)被描述在体内和体外研究。

因此,我们可以假设,免疫系统功能障碍的患者也可以出现糖尿病足溃疡(dfu),在他经常感染相关并发症发生并可能导致下肢截肢(19,20.]。在我们之前的研究中,我们调查了可能的变化在慢性dfu患者免疫系统的。这项研究的结果显示轻微的免疫学变化特征是炎症反应的激活增加白细胞和中性粒细胞计数、c反应蛋白、IgA的水平。然而,更严重的免疫缺陷的适应性和先天免疫没有观察到这种风险组糖尿病患者日期(21,22]。

我们当前研究的目的是分析详细的存在可能的免疫异常体液和细胞免疫在更严重的患者,慢性感染dfu和潜在的免疫改变和血糖控制之间的关系。此外,我们分析选定的溃疡患者免疫参数之间的差异被敏感的病原体感染和耐药菌株感染的招募了大概从反复慢性感染和抗生素治疗23,24在我们提出一个immunocompromisation。

2。主题、材料和方法

2.1。主题

68名1型和2型糖尿病患者年龄在30到70年,感染dfu连续列入我们的横断面研究。对照组由34个病人的年龄,性别,和类型的糖尿病但没有糖尿病足病的历史。

我们包括那些dfu患者治疗根据IWGDF[当前指导25]在我们脚门诊诊所的dfu至少六个星期,被归类为德州ii iii /罪犯,有轻度或中度感染足系统定义的(26]。感染的存在证实了临床结果和/或实验室炎症标志物升高(25];临床上骨髓炎的定义,通过x射线,积极的微生物的发现,和/或实验室感染的迹象(25]。

dfu患者在加入之前,必须至少有两个积极的文化从伤口拭子从深层组织局部清创后(27]。拭子是由标准的微生物培养方法。对抗生素的耐药性测试集的抗生素在前面分析的基础上由电阻在临床和实验医学研究所和国家参考实验室的建议抗生素,国家卫生研究所,布拉格,捷克共和国。微生物耐药性不同类型的抗生素是由阀瓣扩散试验(28,29日]。最低抑制浓度(MIC)评估只有在特殊情况下由汤对微型板块采用测试或使用梯度法( 以及)[30.]。耐药病原体被定义为那些对口服抗生素或产生酶导致微生物耐药性等ESBL(广谱beta-lactamase) AMPC (beta-lactamase C),和Mec将军敏感微生物被认为可接受的敏感性测试抗生素。我们部门的临床微生物学与EUCAST灵敏度方法解释结果根据当前版本使用临床断点。确定抗性表型(测定耐药/敏感的病原体)我们也使用方法国家参考实验室开发的抗生素,国家卫生研究所,布拉格,捷克共和国。危重肢体缺血患者(多普勒踝/肱指数< 0.6和/或多普勒脚趾压力< 50毫米汞柱和/或经皮的氧气压力(TcPO2)< 30毫米汞柱和/或先进的动脉狭窄或闭塞需要基于入侵动脉血管内/外科血管评估、血管造影、CT、或MR-angiography),没有选择危重肢体缺血,先进的肾功能不全(基于慢性肾脏疾病分类的第四和第五阶段),活跃的癌症、急性感染的迹象,与糖皮质激素或其他免疫抑制药物治疗,post-organ移植,与已知的免疫功能紊乱,肝衰竭,或营养不良被排除在外。

所有患者感染慢性dfu列入我们的研究进一步分成两个子组:患者(他们敏感的微生物菌株子群, )和那些从耐药性细菌(子群R, )被孤立的至少一次。这些子组年龄之间没有显著性差异,TcPO2类型和dfu期间,骨髓炎的发病率或dfu特征(深度、面积)。

当地伦理委员会批准了我们的研究。报名进入研究之前,每个患者签署知情同意书。

2.2。方法
2.2.1。生化分析

下面的测量在所有参与者:血糖水平(分光光度法;美国雅培建筑师),肌酐(检测到酶学;美国雅培建筑师)、糖化血红蛋白(糖化血红蛋白:正常价值20-42更易与摩尔;采用高效液相色谱法;Tosoh八国集团、日本)。

2.2.2。炎症标记物

从实验室感染标志物评估CRP (turbidimetrically决定;美国雅培建筑师),原降钙素(电化学发光;ECLIA Cobac 6000、罗氏、瑞士),和血液细胞计数(分光光度法;SYSMEX、日本)。

2.2.3。先天免疫的措施

补充由C3, C4 (immunonephelometry;美国雅培建筑师),NK细胞的绝对数量和百分比(CD16/56 +细胞)和CD14 + HLA-DR细胞(单核细胞,作为一个重要的预后因素的恶化感染,特别是在感染性阶段)测量。NK细胞和CD14 + HLA-DR细胞测定淋巴细胞各亚群一起通过流式细胞术(见下文)。

吞噬细胞吞噬作用被定义的百分比和FAGSI(白细胞刺激指数)。吞噬作用被FagoFlowEx评估®工具(Exbio布拉格,捷克共和国)。粒细胞的吞噬功能测试通过测量呼吸(氧化)刺激后破裂大肠杆菌使用流式细胞仪细菌在人类肝素化全血。

2.2.4。措施的适应性免疫

CD3 +、CD4 +、CD8 +、天真的不活跃(CD4 + CD45RA + CD62L +),内存不活跃(CD4 + CD45RA−CD62L +),天真的效应(CD4 + CD45RA + CD62L−)和记忆效应CD4 + T淋巴细胞(CD4 + CD45RA−CD62L−)和幼稚的不活跃(CD8 + CD45RA + CD62L +),内存不活跃(CD8 + CD45RA−CD62L +),天真的效应(CD8 + CD45RA + CD62L−),和记忆效应CD8 + T淋巴细胞(CD8 + CD45RA−CD62L−)通过流式细胞术进行评估。我们也评估他们的索引算作天真/记忆细胞。

流式细胞术中静脉血样采集到无菌试管中EDTA。从外周血淋巴细胞(100µL;约1×106细胞)与一种单克隆抗体标记面板CYTO-STAT tetraChrome CD45-FITC(克隆:B3821F4A) / CD56-RD1(克隆:N901 / NKH1) / CD19-ECD(:克隆:j3 - 119) / CD3-PC5(克隆:UCHT1) + CD16-PE(克隆:3八国集团)和CD45-FITC(克隆:B3821F4A) / CD4-RD1(克隆:SFCI12T4D11) / CD8-ECD(克隆:SFCI21Thy2D3) / CD3(克隆:UCHT1)(贝克曼库尔特,沥青,CA)。特定的抗体面板用于T效应细胞由anti-CD4-PE(克隆:13 b8.2), anti-CD8-PC7(克隆:SFCI21Thy2D3) anti-CD62L-PC5(克隆:DREG56)和anti-CD45RA-FITC(克隆:ALB11)(贝克曼库尔特,沥青,CA)。的特定抗体面板用于激活CD14 +细胞由anti-CD14(克隆:RM052)和anti-HLA-DR-PE(克隆:Immu357)(贝克曼库尔特,沥青,CA)。染色后,样本分析使用一个FC 500流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)级和Kaluza软件(贝克曼库尔特)。流仪分析至少有100的事件。

血清免疫球蛋白水平(IgM、IgA免疫球蛋白,由immunoturbidimetry诊断;美国雅培建筑师)和免疫球蛋白子类(由immunonephelometry;美国贝克曼库尔特“/“800)也被测量。除此之外,我们还赤字患者的数量相比,尤其是在免疫球蛋白子类。缺陷被定义为血清水平的某些immunoglo-bulin或其子类低于生理范围,由几项研究[31日和生产者贝克曼库尔特。

2.3。统计数据

病人的特点,实验室感染的标记,和选择的天然免疫与适应性免疫的措施,包括淋巴细胞亚群和免疫球蛋白子类,学习小组和子组之间的比较。数据分析使用BMDP软件90 (PC)。描述性数据提出了意味着±SD;所有学习小组确定使用之间的区别 以及,Mann-Whitney测试,克鲁斯卡尔-沃利斯检验和多重比较。被认为与统计显著差异 。斯皮尔曼等级相关系数是用于确定任何评估数据之间显著相关。

3所示。结果

患者感染dfu糖尿病的基本特征没有显著差异控制除了更高的血清肌酐水平(表1)。研究DFU患者平均的DFU持续时间7.5个月(范围1.5 -48个月),中间的溃疡面积1厘米2(范围0.04 - -43.4厘米2)。66.2%的患者有德州dfu IIB分类/ D和33.8%的德州分类希望/ D。有慢性骨髓炎dfu患者的41.2%。

表1
比较的基本特征和某些炎症标记物之间的学习小组。

白细胞总数(7.7±1.9和8.5±2.4×109/ L;NS)、中性粒细胞(5.1±1.5和5.3±1.8×109/ L;NS),和其他实验室感染的标记,而不是CRP(表1)之间没有显著差异dfu患者和糖尿病控制。没有先天免疫指标的变化,除了降低NK细胞的绝对数字之间的两个研究小组(表2)。

表2
选择参数的差异之间的先天免疫学习小组。

差异主要出现在措施的适应性免疫细胞体液的分支部门。总淋巴细胞减少的百分比和绝对值和减少绝对数字几乎所有类型的亚种群包括B淋巴细胞,淋巴细胞CD4 +, CD8 + T淋巴细胞及其效应和记忆细胞(表3)以及体液免疫的变化被发现感染患者dfu(表4)。从评估免疫措施只有IgG2 ( ; )和IgG3 ( ; )与糖化血红蛋白显著负相关。

表3
选择参数的差异之间的细胞介导免疫学习小组。
表4
选择参数的差异之间的体液免疫学习小组。

患者感染耐药病原体的不同显著与敏感的微生物感染的嗜碱粒细胞的百分比(0.43±0.24和0.66±0.38×109/ L; )。其他措施炎症研究子组之间没有显著差异除了组NK细胞的比例明显高于R(16.6±7.5和12.3±5.7; )相比,子群s .此外,子群R没有达到高水平的IgA(3.07±1.15和3.74±1.35 g / L;NS)、免疫球蛋白(11.01±3.01和12.69±3.16 g / L; )和IgG1(6.49±2.13和6.98±2.22 g / L;NS)与子群在提到参数相比,糖尿病控制(图1)。子群R是显著的特点是低水平的IgG4相比,子群和糖尿病控制(0.29±0.25和0.54±0.43,0.43±0.38 g / L; )。


图1
血清免疫球蛋白水平的比较,包括免疫球蛋白子类中慢性dfu被敏感和耐药病原体感染患者和糖尿病控制。数据提出了意味着±SD;dfu患者(糖尿病足溃疡)感染敏感(子群; R)或耐药病原体(子群; )。年龄、性别、糖尿病和糖尿病类型匹配控制( );搞笑:免疫球蛋白; 患者之间的价值意义dfu感染敏感(子群S)或耐药病原体(R组)和糖尿病控制决定利用克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析测试。 :是指血清水平的IgA、免疫球蛋白和IgG1在子群年代与糖尿病控制。 :意味着血清免疫球蛋白水平子群与子群R。 :意味着血清水平的IgG4子群与子群R。

没有明显差异的赤字每个学习小组之间的免疫子类(表4),除了高趋势IgG2子类缺乏症患者感染所示dfu相比,糖尿病控制(22和15%)。

4所示。讨论

在我们的研究中,我们关注系统性免疫变化的评估来确定水平的免疫缺陷的发生适应性免疫与生俱来的。我们旨在澄清一些任何免疫缺陷患者是否存在治疗伤口愈合的慢性感染。它可以帮助在一些情况下可能解释长期dfu治疗局部感染和炎症反应不足。我们没有评估免疫参数或介质浓度在地方层面,因为他们可以修改由多种因素,包括,例如,温和形式的外周动脉疾病或前当地生物活性敷料的应用程序。

主要发现在慢性感染患者dfu是淋巴细胞的百分比和绝对数量显著降低没有dfu与糖尿病控制。我们可以解释以前描述的血清水平较低的淋巴细胞损伤的免疫系统淋巴干细胞和间充质细胞的水平(32)或其他因素包括压力(33)、年龄(34,可能是糖尿病。这些因素可能诱导细胞因子生产的失调35)和糖化的特定的蛋白质可能在控制生产和淋巴细胞的分化32]。此外,慢性感染患者的淋巴细胞数量减少dfu可能与细菌感染的免疫压力导致生产相对抑制多形核细胞的可能导致或增加细胞凋亡的淋巴细胞被Arya et al。36]。然而,我们并没有发现高水平的dfu患者中性粒细胞。

淋巴细胞的数量在我们的研究患者的dfu与下降几乎所有的淋巴细胞各亚群的绝对数字,包括辅助,细胞毒性淋巴细胞、B淋巴细胞和幼稚,内存不活跃和效应细胞像ofCD8 + CD4 + T淋巴细胞。这个发现的原因仍然不清楚。类似的发现证实了实验动物模型(37在健康个体中也38敏锐地诱导高血糖症的条件下,不仅导致淋巴细胞减少,而且减少的淋巴细胞各亚群包括CD3 +、CD4 +、CD8 + T淋巴细胞。在我们的研究中,然而,血糖水平之间的相关性或糖化血红蛋白和淋巴细胞各亚群都没有看到。

幼稚细胞是由CD45RA抗原的表达,这是目前大约50%的T淋巴细胞表面。T淋巴细胞表达表面CD45RO抗原的抗原激活细胞(记忆细胞)。CD45RO表面通常是目前大约40%的T细胞(CD4 +)。在T淋巴细胞的激活(即。,due to infection), the expression of CD45RA decreases simultaneously with the increase of the expression of CD45RO isoforms. The rise of effector cells, particularly CD8+ effector memory cells [3),加上较低的索引的天真/记忆细胞应该在感染。然而,我们观察到的效应细胞计数增加和减少索引在糖尿病患者和慢性感染在糖尿病足。我们可以推测,适当的选择类型的淋巴细胞激活不发生由于长期损耗的免疫系统通过重复和/或慢性感染。

其他重要的变化,在我们的研究中被发现在体液的变化适应性免疫系统,免疫球蛋白水平。除了总IgA的血清水平升高和免疫球蛋白,dfu患者相比,糖尿病控制显著差异在免疫球蛋白子类,特别是IgG1水平上升和IgG3暗示激活免疫系统的炎症。两个分子作为补充催化剂通过绑定蛋白抗原的病原体。因此,他们的价值观并不奇怪的海拔感染(3),尽管它没有以前dfu描述患者的慢性感染。

由于反应在dfu患者细菌感染可能会改变,尤其是在免疫球蛋白缺陷的存在尤其是免疫球蛋白(子类1),我们还关注他们的检测。大量的病人从学习小组显示IgG2缺陷(定义为血清水平低于2.42 g / L),超过15 - 20%。在普通人群中,尽管最常见的选择性赤字的子类是一个免疫球蛋白IgG2赤字,然而真正的发病率数据不可用。免疫球蛋白子类的缺陷的发生糖尿病人群中,即使在dfu患者,没有先前描述。自IgG2扮演着一个重要的角色在炎症级联由于opsonise细菌的能力,其缺陷可能导致感染的风险增加(5,6]。检测到的赤字IgG2子类可能继发于糖尿病,因为血清的IgG2水平也IgG3在我们的研究中与血糖控制负相关。我们可以因此推断,减少生产或大退化的免疫球蛋白糖蛋白可能与他们的糖化(B淋巴细胞减少,但他们的绝对数量不与糖尿病控制)。相反,某些免疫球蛋白的赤字子类也可以造成持久的消费在慢性细菌负荷。发现这个理论支持的减少水平的免疫球蛋白和主要IgG4子类的患者反复感染主要由耐药病原体。

看的可能改变免疫系统被耐药病原体感染的病人,我们并没有发现免疫系统,我们最初的标志赤字应该在这种队列与病人感染敏感的微生物。差异主要出现在患者体液免疫在抗病原体,在个体的血清免疫球蛋白和免疫球蛋白子类没有达到美国的水平检测的病人感染敏感的微生物。事实上,IgG4值显著降低,不到一半的那些子群中发现敏感病原体和糖尿病控制。我们推测,患者dfu感染耐药病原体有倾向的长期持久性这些细菌可能由于不够激活体液免疫,进而导致减少opsonisation,激活细胞介导免疫性,消除和减少病原体的免疫系统。

我们的研究并没有显示出显著的改变免疫系统的先天免疫系统包括吞噬作用的措施。在C3的值没有改变被发现,通常降低感染期间由于其消费(39)或高血糖症(40]。降低NK细胞的绝对数字在我们的研究中患者的dfu总淋巴细胞可能是由低价值的。这一发现也证明在其他的研究(1,41]。

显著增加感染患者感染的实验室标记dfu密切相关的生理刺激炎症免疫反应。这证实了其他研究的结果(42,43],它并未表现出显著增加患者的炎症的dfu尽管存在传染性并发症包括骨髓炎。在我们的研究中,我们发现类似Weigelt et al。44)仅略CRP水平升高达10 mg / L(在33/68,发现49%的患者dfu与5/34,15%,糖尿病的控制; ),超过一半的患者有CRP水平在正常范围内。升高血清原降钙素被认为是一个更好的预测存在的感染(45)或骨髓炎(43)比其他实验室炎症标记物,除了c反应蛋白(46]。然而,我们没有发现重大异常原降钙素的水平。从其他实验室感染的标记,中性粒细胞的数量并没有显著增加在我们的dfu患者,这个发现是按照其他研究[43,46]。根据以上数据,我们可以推测,一个重要的系统性炎症免疫反应的激活并不发生在患者感染慢性dfu有望在炎症的情况下包括骨髓炎。

我们得出这样的结论:在这组患者感染慢性dfu温和的系统性炎症反应的激活和显著降低淋巴细胞的数量,包括几乎所有的亚种群,被发现。然而,没有证据表明他们的激活,尤其是增加效应细胞,减少适当的亚种群指数(天真/记忆细胞)可能是预期。患者感染dfu我们进一步证明异常体液免疫成分特别是在免疫球蛋白水平的子类结合财政赤字的发生率相对较高,尤其是IgG2的。免疫球蛋白的变化在病人的dfu子类更普遍被耐药病原体感染。

我们不包括进入我们的研究未感染患者糖尿病足溃疡,因为他们只是一个少数群体的复杂的糖尿病足患者脚诊所提供一个全面的照顾病人在整个共和国,其他中心,移植和免疫功能不全的患者,等等47]。在我们之前的研究集中在可能先天或获得性免疫和比较这些结果的变化在糖尿病足溃疡患者(无临床相关的感染),糖尿病控制,刻意与小腿溃疡,很大程度上和健康志愿者没有显著差异(21,48,49]。因此,我们试图选择一组慢性感染患者nonhealed糖尿病足溃疡,在潜在的免疫系统将会更加显著变化与匹配的对照组糖尿病患者。我们的研究结果显示,没有系统性免疫的主要异常,和只有特定的赤字主要在淋巴细胞亚群和免疫球蛋白子类。其有效性可能进一步降低在地方层面由于许多因素,包括可能共存的温和的毛细血管缺血导致的发展dfu [50),可能导致更糟糕的效应细胞迁移到目标目的地。

我们建议进行更详细的免疫学调查dfu患者复发性或慢性感染性并发症尤其是耐药病原体所致。这些测试应该专注于细胞和体液免疫的决心,具体对淋巴细胞亚群和免疫球蛋白子类。

相互竞争的利益

所有参与本研究的作者没有利益冲突。

确认

伟大的确认属于Jindřiška茱莉亚、阿勒娜Střibrska Zdeněk Hunal,伊娃Faberova,阿德拉Sajdlova期间的实践和理论支持我们的研究的性能。本研究支持的项目(卫生部,捷克共和国)的发展研究机构00023001 (IKEM,布拉格,捷克共和国),机构的支持。