文摘

人类胰岛淀粉样多肽的异常颤动(hIAPP)与II型糖尿病的发展。铝是触发许多淀粉样蛋白的结构转变和诱导有毒总物种的形成。(−)儿茶素酸酯(EGCG)被认为是能够结合金属离子和淀粉样蛋白抑制作用对淀粉样蛋白的颤动。然而,铝的影响(3)/ EGCG复杂hIAPP颤尚不清楚。在目前的工作,我们试图把洞察Al (III)的结构和性质和复杂EGCG通过使用光谱实验和量子化学计算和研究基地的影响(3)和EGCG hIAPP颤和聚合以及他们的组合干扰这个过程。我们的研究表明,艾尔(III)可以促进hIAPP颤和聚合,尽管EGCG可能抑制hIAPP的颤动并导致hIAPP非晶聚合物的形成而不是命令纤维。此外,我们证明了艾尔(III) / EGCG复杂的摩尔比率1:1作为Al (EGCG) (H2O)2比EGCG能更有效地抑制hIAPP颤。结果为新药开发提供宝贵的参考治疗II型糖尿病。

1。介绍

各种退行性疾病,包括阿尔茨海默氏症,帕金森氏症和II型糖尿病病理特点是淀粉样变(1- - - - - -4]。人类胰岛淀粉样多肽(hIAPP) 37-amino残酸多肽(图1(一)),有倾向形成低聚物和纤维(5,6),这被认为是有毒物质,对胰岛β肽(7)和病理作用在II型糖尿病的发展8]。因此,抑制有毒hIAPP寡聚物和纤维的形成可能是一个潜在的治疗II型糖尿病的治疗策略。

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图1
(一)hIAPP序列。(b) EGCG的结构。

早期的研究表明,金属离子如铝、锌、铜、铁、锰、钙的颤动和聚合与amyloidogenic蛋白(9- - - - - -15]。这些金属离子会导致淀粉样肽快速沉淀和改变最终聚集的形态(10]。铝浓度血清中被发现 μ在糖尿病患者g / L,明显高于 μg / L在健康受试者16]。更重要的是,铝被证明影响的形成率和形态proislet淀粉样多肽(hIAPP前体肽)纤维(17]。然而,如何将这些金属离子影响的颤动和聚合hIAPP尚未阐明清楚。因此,调查这些金属离子促进蛋白质折叠和他们潜在的抑制剂对更好的理解将是重要胰岛hIAPP颤动β肽和发展小说使用治疗二型糖尿病治疗药物。Thioflavin T(阻)荧光是一种使用最广泛的实验方法来探测的动力学β与高灵敏度(表丰富颤18]在核磁共振光谱学可以监视聚合的蛋白质,蛋白质的凝固使共振峰扩大甚至掩盖的噪声背景中原子水平上的特定氨基酸残基(19]。

到目前为止,一些hIAPP颤抑制剂如芳香族化合物、短肽,ligand-metal-chelate复合物研究了在体外和在活的有机体内(3,20.- - - - - -26]。那些潜在的抑制剂,(−)儿茶素没食子酸盐(EGCG,图1 (b)),一个与许多羟基芳族化合物,大量存在于绿茶,可以抑制淀粉样纤维性颤动β肽,α病毒感染-核蛋白,semen-derived增强剂,hIAPP [27- - - - - -31日)甚至改造形成淀粉样原纤维(32,33]。之前的研究表明,EGCG可以绑定hIAPP单体,导致非晶聚合物的形成,而不是命令淀粉样原纤维(34,35]。此外,EGCG也抑制效力metal-induced淀粉样变(36,37]。

在这项工作中,我们试图研究基地的螯合(III)和EGCG通过使用各种光谱实验和量子化学计算和调查的影响Al (III)和单独EGCG hIAPP颤和聚合及其络合过程通过使用光谱和显微技术。结果可能会提供有意义的参考糖尿病治疗的新药物开发。

2。材料和方法

2.1。材料

人类胰岛淀粉样多肽(hIAPP)被中国肽合成,中国。EGCG是购自TCI,日本。氯化铝(AlCl3购自国药控股,中国。从阿拉丁Hexafluoroisopropyl酒精(HFIP)购买,中国。氘水(D2从J&K O)购买,中国。hIAPP的纯度大于95%,电喷雾质谱证实了分子量和MALDI-TOF-MS。

2.2。准备样品
2.2.1。制备肽股票的解决方案

hIAPP股票的解决方案被溶解在HFIP hIAPP准备。解决方案是在室温下用3分钟,然后透过0.45μ过滤除去不溶性材料。股票的解决方案(800μ米)被储存在4°C。

2.2.2。制备铝(III) / EGCG样本

50μM EGCG水溶液混合0,1.7,4.2,6.7,8.3,12.5,16.7,25日,33.3,41.7,,58.3,66.7,75,100,125,133.3,150μM AlCl3紫外可见光谱研究。150年μM EGCG水溶液混合0 5,12.5,20日,25日,37.5,50岁,75,100,125,150,175,200,225,300,375,400,450μM AlCl3荧光光谱研究。10毫米EGCG水溶液混合有或没有10毫米间变性大细胞淋巴瘤引起3电喷雾质量光谱研究。10毫米EGCG是混合0、0.5、1、2、3、4、6、7、8、10、12、14、16、18、20、25、30毫米间变性大细胞淋巴瘤引起3在D2O为1H NMR光谱。

2.2.3。制备铝(III) / hIAPP样本

hIAPP股票的解决方案添加到D2有或没有100 O的解决方案μM AlCl3给hIAPP浓度100μ米为1H NMR光谱。

2.2.4。EGCG的准备/ hIAPP样本

hIAPP股票的解决方案添加到D2O为0、1和5毫米EGCG给hIAPP的最终浓度为100μ研究M EGCG hIAPP使用的影响1H NMR光谱。此外,hIAPP股票的解决方案添加到D2O与1毫米EGCG给hIAPP的最终浓度(0),20日和100年μ研究M hIAPP影响EGCG使用1H NMR光谱。

2.2.5。样本的准备动力学研究

颤的动力学研究,hIAPP股票解决方案与等效阻水混合解决方案,1毫米间变性大细胞淋巴瘤引起的各种卷3水解决方案,以及各种卷15毫米EGCG新鲜水解决方案,然后用PBS稀释溶液(20毫米, )。的最终浓度hIAPP和年中都是16岁μ这荧光研究M。三个复制的样品准备在96孔板与成交量为200 (NUNC编号237108)μL /。

聚合动力学研究hIAPP股票的解决方案添加到6毫米PBS D2有或没有12.5 O的解决方案μM AlCl3或12.5μM EGCG给hIAPP浓度100μ米为1H NMR研究。

成核动力学研究16μM hIAPP孵化在6毫米PBS有或没有2μM EGCG, 2μM AlCl3或2的混合物μM EGCG和2μ米艾尔(III)。通过0.45样本过滤μm过滤除尘动态光散射研究。

2.2.6款。TEM观察样品的准备

16μM hIAPP孵化在20毫米PBS有或没有2μM EGCG, 2μM AlCl3或2的混合物μM EGCG和2μ米艾尔(III) 37°C 2 h。10μL孵化解决方案放在300网formvar-coated铜网格为10分钟,在室温下干燥2 h。样本用水轻轻冲洗去除PBS盐样品,然后沾2%新鲜醋酸双氧铀为另一个2分钟。网格被涂抹在滤纸和真空干燥过夜。

2.3。方法
2.3.1。紫外可见光谱

紫外可见光谱被记录λ35紫外可见光谱仪(优秀的,美国)在25°C路径长度1.0厘米石英电池在从250年到375纳米波长分辨率1海里。所有常用的实验重复三次,平均和标准偏差(平均数±标准差)。

2.3.2。荧光光谱

EGCG的螯合与Al (III)研究了荧光光谱使用QM 40荧光光谱仪(美国PTI) 25°C与路径长度1.0厘米石英电池在324 nm的激发波长和发射波长从250到375纳米的分辨率1海里。实验重复三次,平均和标准偏差(平均数±标准差)。

的颤动hIAPP被阻氢荧光监控使用荧光板读者(美国ThermoFisher) 37°C 450海里的激发波长和发射波长480 nm的1分钟的间隔,和样品的荧光强度是指相应的免费的解决方案。实验重复三次,取平均值。

2.3.3。电喷雾电离质谱法

记录了电喷雾电离质谱质谱(质)使用LTQ离子阱光谱仪(美国ThermoFisher)在正离子模式下毛细管温度为250°C和喷雾2千伏的电压。样本注入离子源,使用氮气作为干燥气体。

2.3.4。1H核磁共振光谱学

1H NMR光谱记录使用力量皇冠三世HD 400 MHz光谱仪(力量BioSpin国际(德国)在25°C 48瞬变和3.0秒脉冲各瞬态之间的延迟。在艾尔(III) / hIAPP交互研究中,1H NMR光谱记录样本孵化后0分钟,40分钟,17个小时。hIAPP聚合研究,动态测量监控6分钟间隔。

2.3.5。透射电子显微镜法

hIAPP骨料的图片记录下Tecnai G2 20双透射电子显微镜(美国范)200 kV真空。示踪点分辨率为0.27 nm,分辨率为0.14 nm。

图像J软件被用来衡量淀粉样原纤维的直径和无定形聚合物TEM图像。纤维平均直径和无定形的聚集计算从40每组随机选择纤维或聚集。结果表示为平均数±标准差[38]。

2.3.6。动态光散射

成核监控hIAPP的动态光散射(DLS)使用Zeta-Sizer(英国莫尔文仪器)在37°C路径长度1.0厘米石英电池。 身高是大小的粒子被监控 海里有30秒的时间间隔(狭缝宽度= 1海里)。数据与PDI > 0.4被废弃的可靠性。

2.3.7。逻辑斯蒂方程

ThT基金会荧光,1H NMR综合强度hIAPP孵化时间被安装在逻辑斯蒂方程如下10,35]: 在哪里 最大荧光值或最大值集成的值1H NMR共振; 是达到一半所需要的时间 ;和 是一个明显的一阶速率常数增加hIAPP形成纤维。象征“−”“±”被选中的阻氢荧光测定与增加信号强度和“+”1H NMR分析与信号强度下降。报道[10),滞后时间 ,聚合成核依赖理论预测的时间可检测淀粉样蛋白聚合发生之前,被 。

2.3.8。Kolmogorov-Johnson-Mehl-Avrami方程

身高是大小的hIAPP孵化时间是安装在Kolmogorov-Johnson-Mehl-Avrami (KJMA)方程如下39]: 在哪里 是 身高是骨料的直径, 是初始 身高是骨料的直径, 是最后的 身高是骨料的直径, 有关总量的增长率, 叫做阿夫拉米指数。

2.3.9。量子化学计算的(III) / EGCG复杂

量子化学的计算都是在密度泛函理论水平上使用混合meta-GGA M06-2x功能(40),已被证明为结构提供可靠的结果和充满活力的属性和绑定共价的系统的自由能41]。基于1H核磁共振的结果,一个戒指是EGCG的主要结合位点(III)。因此,为了降低计算成本,一个“碎屑EGCG”没有b环和d形环被用作模型6-31 + G (d, p)基组。完整的几何优化进行了水溶液中被极化连续模型溶解模型(IEFPCM) [42)半径和nonelectrostatic条款Truhlar和同事的SMD溶解模型(43]。这种溶解模型是一种最可靠的模型在预测溶剂化自由能。用于水的介电常数为78.3553。几何优化的收敛标准4.50×10−4a.u。渐变为1.80×10−3a.u。位移。谐波振动分析进行了验证,如果优化结构是一个局部最小值或一阶过渡态,并提供零点振动能修正和热修正各种热力学性质。所有的计算都是通过使用高斯09年项目执行的。

3所示。结果与讨论

3.1。螯合的研究儿茶素与Al (3)

之前的研究的影响Al (III)和hIAPP EGCG,我们首先研究了铝的结构复杂(III) / EGCG通过使用光谱方法包括紫外可见吸收光谱、荧光发射光谱,电喷雾质谱法1H NMR。紫外可见光谱的50μM EGCG的滴定Al (III)水溶液记录,发现了一个吸收峰红移的摩尔比率从273年到307海里Al (III) EGCG从0增加到3(数据2(一个)和2 (b)),这表明Al (III)与EGCG互动。此外,150年的荧光光谱μM EGCG的滴定(III)的水溶液都被记录下来。发现一个新的广泛的峰值出现在425海里,峰的强度增加了艾尔摩尔比率的增加(III) EGCG从0到3(数据2 (c)和2 (d)),这表明Al (III)螯合EGCG,并成立了一个新的复杂。

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图2
艾尔(III)和EGCG的螯合物。50 (a)紫外光谱μM EGCG的艾尔。(3)在不同浓度从0到150μ吸光度50 m (b)的依赖关系μEGCG在273 nm(红色)和307海里(黑)的摩尔比率Al (III) EGCG从0到3。的值表示平均数±标准差( )。150 (c)荧光光谱μM EGCG Al (III)浓度从0增加到450μ150 m (d)μM EGCG的荧光强度在425 nm Al (III) EGCG的摩尔比率。强度值归一化到150μEGCG在450μ米艾尔(III)。的值表示平均数±标准差( )。

紫外光谱(图2 (b)(图)和荧光光谱2 (d)EGCG的滴定与Al (III)表明,艾尔(III) / EGCG复杂的摩尔比率1:1。澄清Al (III) / EGCG的结构复杂,EGCG和艾尔(III) / EGCG的混合物的摩尔比率1:1分析了谱图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1867059。质谱的作业表S1所示。结果还表明,铝的主要摩尔比率(III) / EGCG复杂是1:1 结果,这是相同的紫外吸收和荧光光谱。

描述协调网站EGCG Al (III),1H NMR EGCG的滴定Al (III)的D2O测量图3(一个)和图S2。核磁共振光谱的作业表所示S2 (44,45]。如图3(一个)、弱芳香质子信号被观察到 ppm接近b环质子信号 ppm和 以及6.80 ppm接近d形环质子信号 ppm的EGCG的Al (III)后,建议没食子酸盐之间的交互发生群EGCG和艾尔(III)。信号在 ppm分配给C9EGCG的显著降低铝的摩尔比率(3)EGCG增加前1:1,后来慢慢减少(图3 (b)),这表明,C9EGCG是主要的结合位点与Al (III)和Al (III) / EGCG复杂是主导性的比例1:1。电喷雾质谱结合的结果,我们建议一个铝阳离子最有可能一EGCG分子螯合C9和网站连同两个O原子从两个水分子形成新的复杂的Al (EGCG) (H2O)2。

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图3
(一)1H NMR光谱10毫米EGCG没有与(上)(下)和4毫米(3)。(b)1H共振集成在δ= 6.04 ppm的C-9 10毫米EGCG (Al (III)) / (EGCG)比例的滴定Al (III)从0到30毫米。被归一化的值1在2.77到2.95 ppm的c - 4 H集成。(c)的说明(EGCG) (H2O)2复杂的1 (AE-1)。红色、灰色、粉红色和白色球代表氧、碳、铝、分别和氢原子。C9和O8EGCG的戒指和两个O原子从H2O协调铝。

进一步澄清Al (III) / EGCG的结构复杂,使用了量子化学计算。基于1质结果和核磁共振谱,我们推测,可能有两个半岛(III) / EGCG结构复杂。一个结构被任命为与Al (III)协调AE-1 C9原子和O8在从一个EGCG分子环以及两个氧原子从两个水分子如图3 (c)和图S3。被任命为其他结构与Al (III)协调ae 2 C9原子在一个环和c - r - o -原子从一个EGCG以及两个氧原子从两个水分子如图S4和图S5。这些复合物的结合自由能计算根据以下方程:

是显示在表S3 AE-1的结合自由能和ae 2 0 K是0.43和0.39−−a.u。分别表示的结构AE-1 ae 2的比这更有利。美联(III) / EGCG复杂铝(EGCG) (H2O)2AE-1结构成立于债券距离Al-O的1.824和1.9098和Al-C9和债券分别为77.6°角O8-Al-C9。美联(III) / EGCG复杂铝(EGCG) (H2O)2在ae 2结构成立于债券距离1.895和1.926 Al-O c - r和Al-C9EGCG的一个环,分别和债券O-Al-C 74.7°角9。

3.2。Self-Fibrillation Self-Aggregation hIAPP

评估EGCG的影响和艾尔(III) hIAPP颤和聚合,我们调查了这些过程的阻氢荧光光谱,显微镜,1H NMR。16μM hIAPP孵化在20毫米PBS pH值7.4 37°C下3 h。图4(一)显示hIAPP的颤动在典型的s形时间的方式,由年中荧光光谱监测,显示的self-fibrillation hIAPP之后成核机制(46]。

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图4
Self-aggregation hIAPP。(一)颤动力学16μ在20毫米PBS pH值在7.4 M hIAPP 37°C进行荧光。的值表示的意思是( )。实线表示曲线拟合的使用(1)。(b)的TEM图像16μM在20毫米PBS hIAPP孵化2 h。等高线图(c)1H NMR谱化学位移内100年从7.13到7.3 ppmμM hIAPP孵化在6毫米PBS pH值7.4和25°C。(d)聚合动力学集成共振的强度1从7.13到7.3 H NMR光谱为100 ppmμM hIAPP。实线表示曲线拟合的使用(1)。集成标准化单独初始hIAPP数据值。

16的聚集形态μM hIAPP孵化2 h透射电镜的观察(图4 (b))。一些单纤维平均直径 纳米和一些原纤维束的平均直径 纳米hIAPP样本观察。结果表明,自组装成纤维hIAPP占优势。

此外,肽聚集也调查了实时核磁共振如图4 (c)。100年μM hIAPP孵化在6毫米PBS pH值7.4下25°C。这是在图中找到4 (d)的归一化1H NMR集成芳香残留在化学位移hIAPP强度从7.13到7.30 ppm是典型的s形的方式减少甚至没有观察到信号3 H后孵化,因为大聚合形成。这种现象也观察到其他作者的研究淀粉样纤维性颤动(47,48)和非晶聚合(49]。原因是蛋白质的凝固使共振峰扩大,甚至在背景噪音掩盖。我们的结果与文献报道吻合较好,(50]。

3.3。铝的影响(III) hIAPP的颤动和聚合

图5(一个)显示了颤与滴定hIAPP Al (III)的时间方式,进行荧光光谱。发现在表S4和图S6的滞后时间 减少从 分钟, 最小值与浓度的增加(III)从0到64μ米(1),这表明Al (III)促进了hIAPP的原纤维成核。

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图5
艾尔(III)的影响hIAPP的颤动和聚合。(一)动力学16μM hIAPP颤与0(■),2(●)8(▲)和64年(▼)μ米艾尔(III)在20毫米PBS pH值7.4 37°C下,进行荧光。的值表示的意思是( )。实线表示曲线拟合的使用(1)。(b)的TEM图像16μ在20毫米PBS和2 M hIAPP孵化μM Al (III) 2 h。等高线图(c)1H NMR谱化学位移内100年从7.13到7.3 ppmμM hIAPP孵化在6毫米PBS pH值7.4和25°C孵化时间为12.5μ米艾尔(III)。(d)聚合动力学综合共振的强度1从7.13到7.3 H NMR光谱100 ppmμM hIAPP没有(■)和(●)12.5μ米艾尔(III)。实线表示曲线拟合的使用(1)。集成标准化单独初始hIAPP数据值。

16的聚集形态μ与2 M hIAPP孵化μM Al (III) 2 h透射电镜的观察(图5 (b))。这是在图中找到5 (b)Al (III)治疗的主要纤维样品被扭曲的平均直径 nm。Al (III)处理样品的纤维分布更加密集比未经处理的示例(图4 (b))。结果表明,铝(III)刺激hIAPP原纤维的成核。

此外,肽聚集干扰由半岛(III)也研究了实时1H NMR如图5 (c)。100年μ12.5 M hIAPP孵化了μ米艾尔(III)在6毫米PBS pH值7.4下25°C。也在图中找到5 (d)和表S5的滞后时间 是下降的 来 分钟(1)与Al (III),这表明,艾尔(III)稍微加速hIAPP原纤维成核和聚合的过程。

据报道(15,26]Al (III)全身颤动和聚合涉及到八面体Al-O和Al-N铝和amyloidogenic蛋白质之间的结合,形成了O (N)过程(III) - O (N)之间的交叉连接蛋白单体,导致淀粉样成核和聚合。

为了探索hIAPP之间的交互和艾尔(III)的细节,1100 H NMR光谱μM hIAPP孵化有或没有高浓度的Al (III) 100μ米测量0分钟,40分钟,17 h如图6。只有信号对应的芳香残留hIAPP改变和其他残留几乎不变。的作业1H NMR谱的芳香共振hIAPP表S6中列出。我们发现共振 组氨酸的咪唑环18 (His18) hIAPP [51]没有Al (III)现在几乎不变(图6(一)),而添加Al (III)的峰值逐渐分成紧身上衣,孵化时间(图6 (b))。以前的研究已经表明His18 hIAPP的颤动中发挥着关键作用,尤其是在锌(II) coincubated颤过程(52- - - - - -54]。锌(II)优先结合六hIAPP单体形成hIAPP六聚体集群的形成,从而抑制成熟纤维,因其强烈的亲和力hIAPP单体。Al (III),其亲和力大大低于锌(II)、可能逐步结合咪唑环上的氮在hIAPP His18 Al-N形成配位键,进一步的交联His18-Al (III) -His18两hIAPP单体(15,26),这可能促进hIAPP的原纤维成核。

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图6
hIAPP和艾尔(3)之间的交互。(a)和(b)1100 H NMR光谱μ没有和100 M hIAPPμ米艾尔(III),分别在0分钟(黑),40分钟(红色),17个h(蓝色)孵化。星号显示 His18共振。
3.4。EGCG对hIAPP的颤动和聚合的影响

检查的抑制作用EGCG hIAPP颤,16岁μM hIAPP孵化与不同浓度的EGCG从0到32μm . hIAPP也被监控的颤动力学荧光。这是在图中找到7(一)都颤hIAPP过程有或没有EGCG在时间反曲的方式,但最大荧光强度 减少从 来 (1)增加EGCG浓度(表S7和图S7),这表明,淀粉样纤维的数量明显减少,EGCG的干扰。

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图7
EGCG对hIAPP的颤动和聚合。(一)动力学16μM hIAPP颤与0 (■),2 (●)8 (▲),16 (▼),32 (◂)μM EGCG在20毫米PBS pH值7.4年中荧光监测到了37°C以下。的值表示的意思是( )。实线表示曲线拟合的使用(1)。(b)的TEM图像16μ在20毫米PBS和2 M hIAPP孵化μM EGCG 2 h。等高线图(c)1H NMR谱化学位移内100年从7.13到7.3 ppmμM hIAPP孵化在6毫米PBS pH值7.4和25°C孵化时间为12.5μM EGCG。(b)聚合动力学综合共振的强度1从7.13到7.3 H NMR光谱100 ppmμM hIAPP没有(■)和(●)12.5μM EGCG。实线表示曲线拟合的使用(1)。集成标准化单独初始hIAPP数据值。

16的聚集形态μM hIAPP孵化有或没有2μM EGCG对TEM观察到图2 h7 (b)。发现大多数hIAPP骨料对EGCG目前的平均直径的球面 海里有一些纤维平均直径 纳米,而那些没有EGCG是典型的纤维,如图4 (b),这表明,EGCG促进了hIAPP形成无定形聚合物,而不是典型的纤维。

此外,EGCG对hIAPP实时聚合也调查了1H NMR。的1100 H核磁共振的结果μ用12.5 M hIAPP孵化μM EGCG在6毫米PBS pH值7.4 25°C以下如图7 (c)在化学位移从7.13到7.30 ppm的芳香共振hIAPP在场,但不是EGCG的共鸣。发现芳香的集成共振强度地区减少时间反曲的方式有或没有EGCG(图7 (d)),这表明,芳香残留在hIAPP得到固定的或刚性,但滞后时间 的 最小值对应的成核率与EGCG小比 分钟没有EGCG;与此同时,延伸率 对应于刚性状态的形成率降低 最小值−1没有EGCG 最小值−1与儿茶素(1)(表S8)。这些结果表明,EGCG hIAPP也可以抑制聚合物的形成。

此外,为了更详细地揭示了hIAPP之间的交互和EGCG在分子水平上,1当100 H NMR测定μM hIAPP孵化有或没有高浓度的EGCG如图1毫米8(一个)。发现添加EGCG显著改变的峰值特性,从6.68到7.31 ppm分配给hIAPP芳香残留的共鸣。单线态 共振(的象征 从7.17到7.21 ppm) His18残留51)是分成紧身上衣;四方 共振(的象征 23)15苯丙氨酸和苯丙氨酸(Phe15 / Phe23)残留物从7.24到7.28 ppm (55]改为紧身上衣;和紧身上衣 共振(的象征 )Phe15 / Phe23残留物从7.11到7.17 ppm (55)与字段改为三联体的转变,而化学变化和线宽的共振 从7.21到7.24 ppm Phe15 / Phe23残留物(55),以及 从6.71到6.73 ppm 从7.00到7.02 ppm的酪氨酸残37 (Tyr37) (51]几乎不变。与此同时,EGCG的共鸣 和6.50 ppm成为扩大增加峰值谱线宽度的一半最大高度( 从0.60和1.28赫兹)2.32和2.60赫兹,分别作为hIAPP EGCG比从0增加到0.02到0.1,如图8 (b)和表S9。结果表明直接的存在π- - - - - -π相互作用残留Phe15 / Phe23以及His18 hIAPP EGCG,导致谱线宽度扩大。实验和理论研究表明,Phe23可以形成π- - - - - -π互动与相邻hIAPP Phe23残留单体(56),导致淀粉样蛋白的形成。根据我们以前的工作和文献π- - - - - -π叠加EGCG和hIAPP之间可能会阻止竞争,两个hIAPP单体(57),从而抑制hIAPP纤维的形成。

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图8
互动hIAPP EGCG。(一)芳香的区域1100 H NMR光谱μM hIAPP(上)和(底部)1毫米EGCG。一个( ),两个( )和三( 星号表示 His18, , 分别Phe15 / Phe23残留。(b)1H NMR光谱比率1毫米EGCG的[hIAPP]: (EGCG)(0)(底部),0.02(内侧)和0.1(上)μ从6.47到6.95 M hIAPP内化学位移在D ppm2O在25°C。
3.5。艾尔(III) / EGCG的影响复杂hIAPP的颤动和聚合

此外,上述结果的影响EGCG hIAPP颤和聚合,艾尔的影响(III)使用16 EGCG-interfered过程调查μ与2 M hIAPP孵化μM EGCG然后受到添加Al (III)从0到64μM,进行荧光(图9(一个))。图的详细分析9(一个)发现颤动力学显示类似的v型趋势Al (III)浓度在成核、伸长和稳定如图9 (b)- - - - - -9 (d),分别。它是发现在表S10 (1)的滞后时间 ,成核时间,提高Al (III)的浓度增加时,从0到2μM;即,当铝的摩尔比率EGCG是1:1,成核时间是最长的,而开始减少当Al (III)的浓度高于2μM(图9 (b)),这表明,铝的浓度(III)相当于EGCG可以最有效地延迟hIAPP原纤维的成核。然而,相反的趋势被发现在美国的伸长(图9 (c))和稳定(图9 (d))作为Al (III)的浓度变化,这意味着伸长速率 是最慢的,最大的须根数量 时最小的摩尔比率Al EGCG达到1:1,和他们两个都增加了艾尔(III)的浓度较低时比2或更高μM。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图9
铝的影响(III) EGCG-interfered hIAPP颤。(一)动力学16μM hIAPP颤没有(■)或2μM EGCG干扰添加0(●),1(▲),2(▼),4(◂),16(▸)和64年(◆)μ米艾尔(III)进行荧光。的值表示的意思是( )。实线表示曲线拟合的使用(1)。(b)延迟时间,(c)伸长速率,(d)规范化的最大阻氢荧光hIAPP聚合与2μEGCG在Al (III)的浓度。独自hIAPP强度值归一化数据。

艾尔(III) / EGCG的影响复杂的摩尔比率1:1的颤hIAPP被TEM(图研究10 ())。纤维的平均直径 nm和无定形聚合物的平均直径 纳米hIAPP中观察到的样本被艾尔(III) / EGCG复杂,而只有纤维被发现仅在hIAPP样本,这表明Al (III) / EGCG复杂可以显著抑制hIAPP颤动。

(一)
(一)
(b)
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图10
艾尔(III) / EGCG的影响复杂的hIAPP颤和成核。(一)16 TEM图像μ与2 M hIAPP孵化μM Al (III)和2μM EGCG 2 h。(b)的依赖关系 身高是规模上的成核时间16μM hIAPP没有孵化(■),2μM EGCG (●), 2μ米艾尔(III) (▲), 2μ米铝/ EGCG的摩尔配给1:1(▼)由DLS化验。实线表示曲线拟合的使用(2)。

此外,16岁的成核μM hIAPP孵化有或没有2μM EGCG, 2μM Al (III), 2μ米艾尔(III) / EGCG复杂的pH值在0.7毫米PBS 37°C下7.4监控由DLS技术(图10 (b))。的参数 , , 从安装DLS曲线中提取(2)和表S11中列出。发现在表S11 hIAPP样本被EGCG和艾尔(III) / EGCG复杂的有类似的 值约为1.1,表明这两个EGCG-involved成核模型样本相似。有人指出hIAPP孤独和艾尔(III)治疗hIAPP还有另一个类似的样品 值约为1.5。结果表明,成核模型EGCG-interfered hIAPP不同hIAPP和艾尔(III)治疗。growth-rate-related参数 核是为了hIAPP被艾尔(III) / EGCG复杂的由EGCG > 系统和治疗(III)仅靠hIAPP > 系统。结合的形态hIAPP TEM观察到,我们表明,EGCG和艾尔(III) / EGCG复杂可以诱导hIAPP形成无毒非晶态核或聚合,而Al (III)可以促进hIAPP形成有毒的纤维。

据报道,hIAPP有几个正电荷在中性pH值和强烈吸引了疏水表面。hIAPP支持绑定通过疏水作用超过表面静电相互作用在盐溶液(58]。EGCG分子有许多疏水性苯戒指,我们认为hIAPP具有良好亲和力Al (III) / EGCG复杂π- - - - - -π互动,和一些正电荷hIAPP不能阻止这个绑定过程在PBS溶液。艾尔(III) /可能带来更多的正电荷hIAPP EGCG复杂,从而导致正电荷之间的静电斥力Phe23残留在邻近单体堆叠沿纤维轴,然后更有效地抑制了自组装,颤动,hIAPP和聚合。

4所示。结论

我们的研究结果表明,艾尔(3)可以通过His18-Al刺激hIAPP的成核和纤维性颤动(III) -His18 hIAPP单体之间的交叉连接。EGCG可能抑制这一过程通过hIAPP非晶聚合物的形成π- - - - - -π之间的叠加hIAPP EGCG和芳香的残留物。艾尔(III)可以配合O8和C9EGCG形成Al (III) / EGCG复杂的摩尔比率1:1作为Al (EGCG) (H2O)2。艾尔(III) / EGCG的复杂结合,积极充电Phe23残留,因此可以更有效地阻止hIAPP颤比单独EGCG通过相邻hIAPP单体之间的静电排斥作用,甚至改变了有毒无毒非晶态聚合物纤维。我们的发现可能为未来的发展提供宝贵的参考小说抑制剂的有毒hIAPP纤维管理糖尿病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持的工作是由中国自然科学基金会(21374022号,21273042,21573044,81374032),复旦大学高级访问学者重点实验室的基础(没有。15 fgj03),建设项目的关键疾病上海结合中国传统和西方医学:代谢综合征(没有。zxbz2012-01)。

补充材料

主要形式的EGCG单体、二聚体和三聚物中EGCG的水溶液,和主要的摩尔比率的EGCG Al (III) 1、2和3在Al (III) / EGCG克分子数相等的混合解决方案。

  1. 补充材料