文摘

客观的。糖尿病肾病是一种危及生命的并发症患者长期糖尿病。血流动力学、炎症和代谢因素被认为是糖尿病肾病的发展因素。在这项研究中,我们评估是否与水杨酸药理干预,吡哆胺相比,可以防止糖尿病肾病小鼠。方法。雄性老鼠overexpressing诱导一氧化氮合酶在胰腺β肽被作为糖尿病模型。水杨酸(3 g / kg饮食)或维生素b6 (1 g / L的饮用水;~ 200毫克/公斤/天)给出16周评估糖尿病肾病的发展。长效胰岛素治疗(Levemir 2单位/千克一天两次)被用作控制。结果。尽管较高的血糖水平没有显著影响维生素b6,早晚期肾病的指数衰减,包括肾脏肿大,蛋白尿,并增加血清肌酐,肾小球硬化症,炎症和profibrotic基因表达式。水杨酸显示有益对糖尿病肾病的影响类似于维生素b6,其中包括降低血糖水平,抑制巨噬细胞浸润到肾脏。衰减的巨噬细胞浸润的肾脏和upregulation antiglycating酶乙二醛酶1基因表达被发现只有在水杨酸治疗组。结论。水杨酸治疗和维生素b6可以预防糖尿病肾病的发展在老鼠身上,因此,可能会是有用的治疗策略对糖尿病患者肾脏问题。

1。介绍

糖尿病肾病是一种危及生命的并发症,发生在20 - 40%的病人患有糖尿病和慢性肾脏疾病的主要原因是(1]。有许多因素影响糖尿病肾病的发展,包括遗传、环境、血流动力学及代谢因素(2]。糖尿病肾病的发展特点是肾小球反渗透法,尿白蛋白排泄增加,肾小球基底膜增厚其次是扩张血管系膜细胞外基质的区域。最终发展到肾小球硬化与肾脏功能障碍(3]。

高血糖本身是发病的主要原因,糖尿病并发症的发展。高葡萄糖浓度导致血管紊乱通过多种分子机制包括糖化、多元醇通路,己醣胺通路,氧化应激,激活的蛋白激酶C [4]。这些因素相互作用,从而促进宿主反应,包括炎症反应和应激反应,导致糖尿病条件下肾小球硬化症。,我们组和其他关注糖化反应和晚期糖化终产物(AGE)与糖尿病肾病的发病机制5,6]。年龄(愤怒)的受体与配体引发这种疾病的加速度(7]。例如,RAGE-overexpressing糖尿病小鼠显示进步的肾小球硬化症与肾脏功能障碍,糖尿病的同胞相比缺乏愤怒转基因(8]。此外,纯合子RAGE-null糖尿病小鼠系膜增殖并没有继续扩张或肾小球硬化症9]。胞内愤怒信号包括激活转录因子NFκ活动,从而提高促炎反应(10,11]。

预防和治疗糖尿病肾病,我们检查了吡哆胺的影响,一个antiglycating药物水杨酸、抗炎药物,糖尿病肾病的发展使用我们独特的动物模型。吡哆胺是维生素B6的自然形式之一,众所周知,作为活性羰基的亲核的陷阱中间体形成年龄(12]。据报道,吡哆胺预防早期肾病的发展在糖尿病大鼠模型13,14]。有效性等晚期糖尿病肾病肾小球硬化症尚未完全阐明在糖尿病大鼠模型13]。水杨酸是一个著名的抗炎化合物抑制了我κB激酶-β(IKKβ),是NF的下游κB (15]。最近的临床研究表明,双水杨酸酯、水杨酸nonacetylated,降低空腹血糖和糖化血红蛋白以及炎症的标志(16,17),但没有减少形成晚期糖化产物(18]。

在这项研究中,我们研究了水杨酸的影响,吡哆胺相比,糖尿病肾病的早期到晚期原来糖尿病肾脏损伤的小鼠模型胰岛素治疗组作为对照。

2。材料和方法

2.1。动物

1型糖尿病的雄性老鼠鼠标线过多表达诱导胰腺没有合酶(间接宾语)β肽和控制CD1 (ICR), cd -背景(查尔斯河、日本),被用于这项研究[8,19]。他们被喂以高热量饮食(非饱和H标准;Nosan、Yokohma、日本),含有31.1%的蛋白质,8.2%的脂质,纤维3.3%,灰分6.3%,水8.1%。转基因小鼠持续发展明显的糖尿病早在出生后1周由于NO-mediated选择性破坏生产胰腺的胰岛素β肽,从而导致先进的糖尿病肾病(8,19,20.]。动物治疗按照基本指导方针,适当的进行动物实验和相关活动的学术研究机构管辖教育部,文化,体育,科学,和日本的技术。动物实验委员会批准的金泽大学的动物实验。

2.2。动物组织与不同的治疗

Pyridoxamine-dihydrochloride-monohydrate (4-aminomethyl-3-hydroxy-2-methyl-5-oxymethylpyridinedihydrochloride)从东京购买化工有限公司、日本。吡哆胺盐酸盐是1 g / L(~ 200毫克/公斤/天)的饮用水从4到20周的年龄为16周,导致血清浓度为0.42μ米(< 0.03μ在参与小鼠)。水杨酸(水杨酸钠、Sigma-Aldrich、日本)鉴于他们的饮食在3 g / kg,产生血清浓度为102.6μ米(不参与小鼠中发现)。胰岛素治疗组,地特胰岛素发生的长效胰岛素类似物(Levemir,诺和诺德)皮下注射剂量的一天两次2单位/公斤体重。

以下5个动物群体受到表型分析:(1)非糖尿病患者控制(),(2)糖尿病小鼠没有治疗(),(3)糖尿病小鼠胰岛素治疗(),(4)与水杨酸治疗糖尿病小鼠(),(5)糖尿病小鼠吡哆胺治疗()。

2.3。生化检测

尿收集的样本手册操作然后保存在埃普多夫管−80°C。血糖测定使用Glucocard (Arkray、日本)。体重(BW)和nonfasting血糖检查在4、8、12、16、20周的年龄。血清和尿肌酐水平监测在12日,16日和20周的年龄。尿albumin-creatinine比率(ACR)计算在20周的年龄。血清和尿肌酐测定使用肌酐指标(Wako,大阪,日本)。尿白蛋白和beta 2微球蛋白水平衡量一只老鼠白蛋白ELISA定量工具(AlbuWell 2 M, Exocell、费城、PA)和一只老鼠BMG /β2 mg酶联免疫试剂盒(Elabscience、日本),分别。

2.4。组织病理学

牺牲动物后20周的年龄、左肾是和固定在Carnoy获得的解决方案(10%乙酸,60%甲醇,氯仿和3%)或4%多聚甲醛。48小时固定、多聚甲醛和Carnoy的解决方案取而代之的是磷酸缓冲盐(PBS)和70%甲醇,分别。肾脏标本切片在1μ米厚度,其次是周期性acid-Schiff (PAS),周期性acid-methenamine银(PAM),或苏木精和伊红())染色,用光学显微镜成像(蔡司显微镜与富士数码相机HC 300 z)。定量的考试是在至少50每鼠肾小球。肾硬化的严重程度被多个任意规模的分析师得分从0到48,9]。平均肾小球面积是决定如前所述8,9]。

2.5。流式细胞术(流式细胞仪)

评价巨噬细胞浸润,细胞从整个右肾每个动物组在20周的年龄进行流式细胞仪分析。肾脏被剪刀剪成小块,与胶原酶消化酝酿II (1μg / mL)。在染色细胞然后洗resuspended缓冲区(PBS 2% FCS)包含FcBlock (BD生物科学)。细胞被染色的孵化15分钟在4°C在黑暗中以下抗体:CD45-PE (eBioscience) CD11b-APC-Cy7 (BD生物科学)和F4/80-PE-Cy7 (BD生物科学)。细胞被resuspended在200年μ包含0.2 L的染色缓冲区μg / mL propidium碘(Sigma-Aldrich),透过100μm网格,分析FACSAria II (BD生物科学)。量化可行的细胞数量,液体计数的珠子被BD细胞生存工具包(BD生物科学)。数据传输和分析与FlowJo软件(树明星)。

2.6。RNA提取和实时聚合酶链反应(PCR)

信使rna的表达是通过测量定量实时聚合酶链反应(存在)。肾组织snap-frozen在液氮和保存−RNA提取前80°C。总RNA提取使用试剂盒试剂和纯化RNeasy +工具包(试剂盒)根据制造商的指示。互补DNA合成利用低聚糖(dT)底漆AffinityScript QPCR互补脱氧核糖核酸合成装备(美国安捷伦科技)根据制造商的指示。SYBR绿色中存在与特定DNA引物(表执行1)。放大和实时荧光检测进行了使用模型Mx3005P实时QPCR系统(Stratagene产品部,安捷伦科技)和以下协议:最初的变性和聚合酶的激活步骤在95°C 2分钟紧随其后40周期在95°C 5 s和60°C 20年代。信使rna表达水平正常化tata结合蛋白(真沸点)。

2.7。测定小鼠血清中水杨酸和吡哆胺浓度

血清样本(40μL)和5μL 2μ米西咪替丁(内部标准),5μL的水,和150年μL 200年μ乙腈,其次是在22000×g离心10分钟。一个3μL整除的上层清液注入质/ MS系统,组成的Nexera高效液相色谱系统(日本岛津公司,日本京都)耦合到一个三重四极质谱仪(lcms - 8040,日本岛津公司)。色谱法,水杨酸是由梯度洗脱的方法(流量、0.4 mL / min)如下:0 - 1.0分钟,99% / 1% B;1.0 - -4.0分钟,99% / 1%至5% / 95% B;4.0 - -5.0分钟,5% / 95% B;5.0 - -5.1分钟,5% / 95%至99% / 1% B;5.1 - -7.0分钟,99% / 1% B (A,水含有0.1%甲酸;B,甲醇含0.1%甲酸)使用ACQUITY UPLC本·C₁₈(2.1×100毫米,1.7μm;水域,米尔福德,MA)在50°C。色谱法对吡哆胺是由梯度洗脱的方法(流量、0.4 mL / min)如下:0 - 1.0分钟,5% / 95% B;1.0 - -6.0分钟,5% / 95%至50% / 50% B;6.0 - -6.5分钟,50% / 50%至65% / 35% B;6.5 - -7.5分钟,65% / 35% B;7.5 - -7.7分钟,65% / 35%至5% / 95% B;7.7 - -14.5分钟,5% / 95% B (A,水含有0.1%甲酸;B,包含0.1%甲酸)使用乙腈SeQuant ZIC-cHILIC列(2.1×150毫米,3μm;默克密理博,达姆施塔特,德国)50°C。多反应监测对吡哆胺是设定在169.1到134.1,137.1到93.0水杨酸,并为西咪替丁253.1到159.1。数据分析使用LabSolutions(版本。5.80,日本岛津公司),并使用示例峰高定量。

2.8。统计分析

使用双尾学生的计算值t以及成对比较和单向方差分析(方差分析),其次是Bonferroni为多个比较,测试,除非另有说明。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。数据表示为±SEM。

3所示。结果

3.1。糖尿病条件

nonfasting血糖水平是500 ~ 600 mg / dL在糖尿病小鼠年龄(图4 - 16周1(一)),表示持续的高血糖。一天两次胰岛素治疗后显著降低高血糖长效胰岛素的注射模拟(图1(一))。严重的低血糖症的问题,包括死亡的老鼠,在本研究中未见。水杨酸和吡哆胺治疗在糖尿病小鼠并没有导致nonfasting血糖水平显著降低,但有一个倾向降低血糖水平的水杨酸治疗组(图1(一))。糖尿病组的体重(BW)显著低于非糖尿病的控制,但没有统计上显著的差异观察糖尿病人群有或没有治疗在任何时间点观察期间(表2和数据未显示)。食物摄入量明显增加糖尿病小鼠相比,非糖尿病患者控制(表2)。胰岛素治疗否定糖尿病小鼠食物摄入增加;水杨酸治疗也有部分抑制摄食行为的影响(表2)。吡哆胺并没有导致食物摄入量的变化(表2)。同样的趋势在观察期间水喝:非糖尿病的控制,毫升/鼠标/天;如果不治疗,糖尿病毫升/鼠标/天;糖尿病与胰岛素治疗,毫升/鼠标/天;糖尿病与水杨酸治疗,毫升/鼠标/天;糖尿病与吡哆胺治疗,毫升/鼠标/天。

3.2。肾脏功能和组织学研究

经过16周的治疗,肾脏的功能和宏观和微观分析被执行。肾脏增大,表示为肾脏重量/ BW,指出在糖尿病小鼠(图1 (b))。胰岛素治疗显著改善肾大小改变,但是水杨酸治疗或吡哆胺没有(图1 (b))。相比之下,心脏重量是不同的在所有组(表并非如此2)。蛋白尿是评估尿albumin-creatinine比率(ACR)动物20周的年龄。糖尿病小鼠没有治疗显示重要的海拔ACR与非糖尿病患者相比,控制老鼠(图2(一个))。治疗组给予胰岛素,水杨酸,或吡哆胺被发现显著减少蛋白尿在糖尿病小鼠(图2(一个))。在这项研究中,水杨酸(3 g / kg饮食)并没有引起管损害如高排泄的尿β2微球蛋白。我们下一个评估小鼠的血清肌酐水平反映肾脏滤过率。鼠标血清肌酐水平在糖尿病治疗明显高于非糖尿病患者控制在16周的年龄(图2 (b))。用胰岛素治疗、水杨酸或吡哆胺显著衰减增加血清肌酐水平在糖尿病小鼠(图2 (b))。

接下来,进行组织病理学分析。周期性acid-Schiff (PAS)肾组织的染色部分如图3。PAS-positive积累材料在糖尿病大鼠肾脏的肾小球是著名的如果不治疗,与非糖尿病患者相比,控制。胰岛素、水杨酸或吡哆胺治疗减毒PAS-positive材料的沉积在肾小球(图3)。定量评价的组织学指标执行。没有明显差异在肾小球面积组(图中4(一))。然而,糖尿病组的簇区域没有治疗明显比非糖尿病的控制和增加簇区域明显减弱胰岛素治疗,水杨酸或维生素b6在糖尿病小鼠(图4 (b))。肾小球细胞数量统计,肾小球细胞数量每簇面积确定。这个索引被发现增加糖尿病条件下(图4 (c))这upregulation阻止通过与胰岛素治疗,水杨酸,或维生素b6(图4 (c))。肾小球硬化症在20周的年龄是评价和表达为硬化指数。硬化和显著预防糖尿病条件下增加了胰岛素的治疗,水杨酸,或维生素b6(图4 (d))。

3.3。巨噬细胞浸润在肾脏

我们接下来关注巨噬细胞浸润和积累通过流式细胞术评估。巨噬细胞被定义为π^{- - - - - -}CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺细胞(图5(一个))。虽然在整个肾脏活细胞数目是不变的每组中(数据未显示),肾脏巨噬细胞%和巨噬细胞的总数显著增加糖尿病条件下增加明显是被水杨酸治疗(数据5 (b)和5 (c))。在差别的趋势对这些巨噬细胞中可观察到积累与胰岛素或吡哆胺治疗组(数字5 (b)和5 (c))。

3.4。基因表达分析肾脏

下检查炎症和纤维化的基因表达。乙二醛酶1(的表达Glo1)mRNA催化细胞毒性甲基乙二醛,高活性glycating代理,明显糖尿病大鼠肾脏中表达下调(图6)。只有水杨酸治疗轻微,但值得注意的是,调节Glo1信使rna(图6)。toll样受体4 (Tlr4)基因表达组(图中没有改变6)。白介素基因表达模式相似(伊尔)1β,Il10血管细胞粘附分子(Vcam -)1,单核细胞化学引诱物蛋白(Mcp -)1,Mcp-2碳碳趋化因子受体2型(Ccr2),胶原蛋白1 a1 (Col1a1)(图6)。糖尿病条件下不受监管这些mRNA水平与非糖尿病患者相比坐下来水杨酸和吡哆胺治疗的增加使之抑制高血糖的条件(图6)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现水杨酸和吡哆胺预防效应的早期糖尿病肾病的指标,包括蛋白尿和扩大簇区域,以及晚期肾损伤,增加血清肌酐和肾小球硬化症等。水杨酸发现抑制巨噬细胞浸润到肾脏和表达下调基因的表达Il1β,Mcp-1,Ccr2,Col1a1,显示抗炎和antifibrotic行动糖尿病肾损伤。同时,水杨酸能显著上调antiglycating酶Glo1信使rna水平。抗炎基因Il10在糖尿病大鼠调节由于补偿和吡哆胺或水杨酸治疗后表达下调。另一方面,吡哆胺没有显著的差别抑制巨噬细胞浸润,但行动证明对这些炎症和纤维化的基因表达式,如Il1β,Mcp-1,Mcp-2,Ccr2,Col1a1。在目前的研究中,我们分离总rna从鼠标整个肾脏各种基因的分析表达式。然而,由于提取的rna和合成数据来自超过90%的管状/间质成分,很有可能现在的发现可能是有限的和混淆解释肾小球的变化。组织学检查可能有助于进一步理解这些分子的表达在特定的细胞类型的肾脏。

水杨酸盐是最常用的非甾体类抗炎药和nonacetylated(如水杨酸钠、双水杨酸酯和trilisate)和乙酰化水杨酸(阿司匹林)的形式被广泛使用以减少发热,疼痛和炎症发生的疾病如风湿性关节炎。即使在低剂量,阿司匹林有效抑制环氧酶COX 1和2通过共价乙酰基转移酶活性部位的丝氨酸残基(21]。Nonacetylated水杨酸盐报告没有修改环氧酶酶的活动22]。在更高的浓度,nonacetylated水杨酸盐和阿司匹林抑制IKKβ/ NF -κB轴,炎症的重要调节器(23,24]。据报道,阿司匹林抑制glycoxidation和AGE-cross-link形成(25),但不是糖化本身。在临床研究中,治疗双水杨酸酯、水杨酸nonacetylated,导致noninhibitory影响时代的形成(18]。在这项研究中,我们使用高剂量的水杨酸钠在3 g / kg的饮食,导致血清浓度为102.6±4.6μ米,相应的为人类治疗剂量,可以看到抑制小鼠的糖尿病肾病的发展nonacetylated水杨酸钠。一项研究表明,肥胖激活IKKβ/ NF -κB通路在动物和抑制这种途径的水杨酸盐提高obesity-induced糖尿病(22,26]。此外,临床研究表明,水杨酸盐减半NF -κ在循环免疫细胞(B活动27]。动物研究表明,水杨酸盐诱导的数量减少了50%单核细胞的表达CCR2介导单核细胞的迁移到局部炎症网站(28]。这是符合我们的发现在这项研究中。此外,有趣的是,水杨酸诱导的基因表达Glo1催化转化细胞毒性的甲基乙二醛S-D-lactoylglutathione D-lactate,而抑制glycation-mediated细胞损伤与糖尿病和老化有关。

维生素B6、维生素B6,据报道,许多影响包括(1)抑制年龄期间被捕获二羰基中间体形成糖化反应,(2)清除毒性羰基葡萄糖和脂质降解的产物,和(3)捕获活性氧(ROS) (12,29日]。吡哆胺的用量(~ 200毫克/公斤/天)用在这项研究中,实现血清浓度为0.42±0.29μM,在更少的有毒的范围内,其临床疗效已被证明在其他早期糖尿病肾病动物模型,如KK-Ay /助教和糖尿病大鼠体外实验13,14]。吡哆胺的血清浓度低于我们的预期和先前的报道30.];这可能是由于其在水溶液不稳定和光敏性以及不同的管理方法。使用我们的糖尿病肾病小鼠模型,吡哆胺治疗200毫克/公斤/天显著提高早期到晚期阶段的肾损伤。

总之,本研究表明,水杨酸抗炎剂以及一种antiglycooxidative药物吡哆胺能抑制小鼠的糖尿病肾病的发展。这两种药物明显阻塞diabetes-induced炎症和profibrotic基因表达式。衰减的肾脏和upregulation巨噬细胞浸润Glo1信使rna表达只在水杨酸治疗组中被发现。结合的协同和添加剂影响水杨酸和吡哆胺以及治疗效果的药物有望在未来的研究调查。介入策略使用这些药物对糖尿病肾病可能有用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢裕女士为她的援助和承认金融支持Niimura补助金为日本社会的科学研究促进科学(24590375,24590375,26450152)。