文摘

目的。探讨动态变化对基质金属蛋白酶的表达(基质金属蛋白酶)和组织金属蛋白酶的抑制剂(TIMPs)糖尿病慢性难治性皮肤溃疡后自体富含血小板凝胶治疗(APG)。方法。这项研究是开发糖尿病足护理中心,中国西部医院。从目标伤口肉芽组织拍摄前和后15天内APG的应用程序。的表达MMP-2 TIMP-2以及转化生长因子-β1 (TGF -β1)在肉芽组织被问TR-PCR和包含IHC检测。表达水平之间的关系MMP-2和TIMP-2及其比率和TGF -β1进行了分析。结果。MMP-2的表达(P< 0.05)被镇压,TIMP-2的表达(P< 0.05)被提拔,而MMP-2 / TIMP-2(比P< 0.05)APG治疗后下降。TGF -的表达β1有负相关的比率MMP-2 / TIMP-2 (P< 0.05)和正相关的表达TIMP-2 (P< 0.05)。结论。APG治疗可以抑制MMP-2的表达,促进糖尿病慢性难治性TIMP-2的皮肤伤口。TGF -β1可能与这些影响。

1。介绍

基质金属蛋白酶(MMPs),一群zinc-dependent肽链内切酶降解的几乎所有细胞外基质(ECM),是由角化细胞和成纤维细胞分泌和许多其他基质细胞。胶原酶和明胶酶都是最重要的类型,而后者主要指MMP-2 MMP-9和作用于胶原蛋白类型IV-V,明胶等(1]。的内容和活动组织基质金属蛋白酶是由3个层次的DNA和蛋白表达,酶原激活,酶活性抑制(2]。组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)参加最后2水平与固定站点绑定不活跃的酶原或活跃的酶和仍然受到许多生物活性物质和细胞操作(2,3]。已知的哺乳动物内源性TIMPs分为4个类型。其中,TIMP-2结合MMP-2 pro-MMP-2一般。

据报道,动态变化的内容和活动MMP-2和/或TIMP-2,由成纤维细胞分泌具,发挥正常疗愈的基本部分,尤其是在中期和后阶段,包括加速血管再生,肉芽组织再生以及结缔组织改革,在某种程度上,维护正常真皮(4]。内容重叠的峰,肉芽组织的再生速度和高度保持14天或更长时间(4]。

拥有的内容和/或活动减少生长因子和基质金属蛋白酶/ TIMPs系统的扰动平衡,导致过度溶剂活动然后减少内容或损坏结构的生长因子和其他本地ecm,糖尿病皮肤溃疡愈合总是不佳。MMP-2发现过度生成而TIMP-2不充分地分泌在糖尿病慢性伤口,和病理失调可能带来阻碍进步的组织再生和血管再生5]。

在最近10年,自体富含血小板凝胶的智能疗效(APG)耐火材料上的伤口已经被报道6,7]。在我们的初步个随机对照试验中,累积APG组溃疡愈合率为95.7%和56.5%的标准治疗组();APG与标准治疗组的总有效率分别为100.0%和73.9% ()[8]。healing-promoting机制被认为包括移植许多生长因子的含量和释放抗菌肽(9- - - - - -11]。最近,一些血小板源伤口愈合的因素(PDWHFs)据报道影响MMP-2 / TIMP-2和其他途径在细胞和动物研究基质金属蛋白酶/ TIMPs系统(1,12)和我们的初步临床试验进一步提供了一些积极的证据对APG治疗金属蛋白酶- 1的另一个途径,MMP-9, TIMP-1 [13]。然而,数据的影响APG MMP-2 / TIMP-2通路在糖尿病治疗慢性伤口则相对不足。

此外,TGF -β1一直在报道一些基本研究抑制的代MMP-2令人沮丧的基因转录和增强TIMP-2同时[1]。在我们的初步临床研究,当地TGF -的浓度β1增加2-3-fold APG治疗后(9]。TGF -β1是正确怀疑加入MMP-2和TIMP-2 APG的规定治疗。但到目前为止,还没有直接证据保证假设。

因此,本研究逐步和创造性的旨在探讨动态变化的表达MMP-2和TIMP-2 APG治疗后慢性难治性糖尿病皮肤溃疡TGF -以及它们的相关性β1。

2。材料和方法

2.1。研究设计和人口

动态变化的研究旨在探讨MMP-2的表达和TIMP-2 MMP-2的比例/ TIMP-2 APG治疗后慢性难治性糖尿病皮肤溃疡,然后计算其相关性TGF -β1。这是糖尿病足护理中心,中国西部医院,四川大学(四川、中国)4月1日之间,2012年,和2012年12月31日。所有符合条件的患者经历了12周的观察和治疗。研究方案、知情同意的形式,和其他研究综述了有关文件和中国西部医院的伦理委员会批准。

所有符合条件的患者,根据下面的纳入和排除标准筛选,签署了知情同意和规定APG治疗。那些从目标伤口肉芽组织的,是在每一个观测点前和后15天内第一个APG的应用程序,被纳入分析。糖尿病患者在18岁,至少有一个皮肤溃疡(1 ~ 60厘米²)或窦(1厘米的体积³或更多)持久不少于4周而不是会议面积大小减少10 - 15%每周至少两周后标准治疗溃疡、参与研究(9]。

2.2。治疗程序

prerecruitment期间,所有的参与者都收到了系统性疗法和标准治疗皮肤溃疡。前者包括强化胰岛素治疗,抗感染,nerve-trophic和circulation-improving疗法等等。后者由局部清洗,清洗,排水,和清创术清除冷酷无情,坏死组织和死骨,以及穿着的变化。适当的肢体固定和重量出售规定。在治疗期内,上述系统性疗法仍在继续。参与者与局部应用程序规定的APG的伤口床前政府Suile伤口敷料(美国享乐主义者生化技术有限公司)在基线和闭塞的绷带。APG的程序准备被元et al。(详细描述14):在313×g离心后4分钟,红细胞集中了。PRP和购买力平价是由离心(1252×g) 6分钟从剩下的等离子体。凝血酶和添加了葡萄糖酸钙PRP,胶状混合物叫做APG。Suile酱和闭塞的绷带被维持3天,然后改变了每隔三天。

2.3。评估和端点

伤口评估被敷料和绷带改变每3天。肉芽组织在5毫米的范围内从伤口床的中心也连同穿衣改变做了活检,然后保持在多聚甲醛或液态氮测量到的面积小于0.5厘米²或者体积小于0.5厘米³。

肉芽组织中每个目标mRNA的表达是由定量半定量的检测逆转录聚合酶链反应(问TR-PCR)。的总RNA提取试剂盒(罗氏Dia)方法。高能力互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类生物Inc .)是用于进行逆转录和生成的互补。问rt - pcr (Chromo4生物Pad)是由SYBR绿色(罗氏Dia)方法。引物合成的相关文章,表达载体的生命科技有限公司有限公司(上海)(表1)。

肉芽组织中的每个靶蛋白的表达是表示位置的半定量的检测到免疫组织化学技术(包含IHC)。免疫组织化学染色法是由ChemMate想象+合/轻拍。主要抗体是独一无二的:鼠单克隆抗体的MMP-2 (Abcam),稀释比例为1:300;兔多克隆抗体的TGF -β1 (Abcam),稀释比例为1:400;兔多克隆抗体的TIMP-2 (Abcam),稀释率(1):100。二次抗体来自常见的工具包ChemMate想象+合/轻拍(基因技术有限公司,上海)。

每个部分的面积和密度评估染色显微镜检查(×200;BX51;奥林匹斯山,日本东京)。两个非连续微观领域是随机选择和使用数码相机拍照(DP72;奥林匹斯山,日本东京)。对于每一个选择区域,数字图像(1360×1024像素)捕获并存储为高分辨率的图像文件。测量免疫反应性的程度,计算机辅助图像分析软件(Image-Pro +媒体控制论)区分应用领域,介绍了计算集成光密度和免疫反应性的区域,并计算平均密度。

根据我们的初步研究,APG的促进作用在糖尿病慢性溃疡的治疗被认为是功能APG治疗后15天内(6]。因此,重复APG治疗进行每两周或15天,如果必要的。我们分析了数据后15天内APG治疗。

2.4。统计分析

数值数据与正态分布是由平均值±标准偏差(SDs);否则,它是由中间,四分位范围(差)。重复测量数据进行测试的一般线性模型分析(GLM)和皮尔逊相关分析的相关性。所有测试都是双面的,价值0.05被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。结果

3.1.1。流行病学数据

共51糖尿病住院患者筛选在我们中心在此试验和25名患者和规定了APG治疗。19符合条件的患者,其伤口肉芽组织的目标是在每一个观测点前和后15天内第一个APG应用程序,纳入分析,其余6被疗愈太快达到小于1厘米的溃疡领域²d15第一APG治疗后(前)或被容忍痛苦相关操作()。19岁的患者年,糖尿病和皮肤伤口持续时间12日3 ~ 16.5年和4,分别4 ~ 14周。绝大多数(17日89.47%)的参与者是男性。每个参与者保持正常的血糖、压力和脂质,以及肝和肾的功能。

3.1.2。动态变化的mRNA表达MMP-2, TIMP-2, TGF -β1的比例以及MMP-2 / TIMP-2 APG前后存在的应用程序

图1显示存在产品的电泳带MMP-2, TIMP-2 TGF -β1,β肌动蛋白和大致APG之前和之后的表达这些基因治疗。MMP-2 mRNA表达的肉芽组织降低了APG后12天内应用程序(TIMP-2逐步增加的),峰值出现在d9-d12 (),TGF -β1增加峰值d12 ()(图2(一个))。同时,MMP-2 / TIMP-2降低的比率与槽后的d12 APG应用程序()(图2 (b))。

3.1.3。TGF -的mRNA表达之间的相关性β1,MMP-2 TIMP-2 MMP-2 / TIMP-2的比率

TGF -的mRNA的表达β1与TIMP-2正相关(,γ与MMP-2(= 0.680),没有相关,γ=−0.071),与此同时负相关的比率MMP-2 / TIMP-2 (,γ=−0.809)后15天内APG的应用程序。

3.1.4。蛋白表达的动态变化MMP-2, TIMP-2, TGF -β1包含IHC APG之前和之后的应用程序

不同深浅的褐黄色颗粒在免疫组织化学染色法观察到部分。解释说,每个不同的靶蛋白表达在ECM和阳性细胞(图的等离子体3)。蛋白表达的动态变化包含IHC和photodensitometry平行的mRNA表达的q rt - pcr(表2,图4),APG应用后的差异均具有统计学意义(MMP-2,;TIMP-2,;TGF -β1,)。

3.1.5。TGF -蛋白表达之间的相关性β1,MMP-2 TIMP-2

TGF -的蛋白表达β1与TIMP-2(有正相关,γ与MMP-2(= 0.660),没有相关,γ=−0.063)后15天内APG的应用程序。

3.2。讨论

在这项研究中,MMP-2的mRNA表达,TIMP-2, TGF -β1中存在技术类似于从包含IHC蛋白表达。(信使rna和蛋白质)的表达MMP-2增加和TIMP-2减少APG治疗后,和TGF -的表达β1与TIMP-2正相关。同时,MMP-2的比例/ TIMP-2问rt - pcr,减少APG应用程序和后负相关(趋势)的表达TGF -β1。综上所述,我们得出结论,APG治疗促进TIMP-2的表达,抑制MMP-2,并减少的比率MMP-2 / TIMP-2糖尿病耐火伤口,和TGF -β1可能与这些影响。

有一些研究指APRP的影响或其他PDWHFs MMP-2的表达和/或TIMP-2,但结果不同。卡塞雷斯et al。15)报道,APRP刺激TGF -的表达β1和TIMP-2牙龈成纤维细胞;胫骨和哦16]发现PRP提拔的mRNA表达MMP-2和MMP-9伤口OLETF(大冢Long-Evans德岛老鼠脂肪)。此外,Axelrad et al。17)表明,platelet-activating因子(PAF)参谋长兴奋的mRNA表达TIMP-2人类脐静脉内皮细胞(HUVEC),但不是MMP-2。简而言之,研究MMP-2 / TIMP-2途径只有几个,几乎应用动物和细胞模型与简单的反应环境和/或干预,而在慢性难治性伤口上APG / APRP治疗,尤其是临床试验,还很少。之前这是我们实现了一个临床试验和研究动态变化的另一个途径(金属蛋白酶- 1和MMP-9 / TIMP-1)基质金属蛋白酶/ TIMPs但不是MMP-2 / TIMP-2 [13]。这创造性地研究是针对MMP-2 / TIMP-2途径,发现一个降低的比例MMP-2 / TIMP-2 APG治疗,另一个潜在healing-promoting机制。

许多基本研究报道TGF -的影响β1在基质金属蛋白酶/ TIMPs系统和显示其抑制MMP-2表达式和推广TIMP-2 [1]。这项研究表明,TGF -β1可能参与抑制MMP-2表达式(负相关或趋势),同时促进TIMP-2和进一步降低的比率MMP-2 / TIMP-2,这正好与前面的基本发现。它确保之前的假设TGF -β1调停APG的作用并提供临床数据的影响TGF -β1 MMP-2的途径。

以前,没有研究(特别是临床)旨在展示APG的影响/ PRP治疗MMP-2 / TIMP-2通路的动态变化。我们在相关领域弥补不足,启动进一步的探索。然而,我们不设置一个控制集团相比,不分析样本容量相对较小;因此进一步研究是必要的。

慢性伤口的愈合微环境转化为急性或acute-like的,通过积极的局部治疗,重点克服的挑战慢性难治性伤口。平衡的比例基质金属蛋白酶/ TIMPs提高愈合的条件是一个重要的途径,加速糖尿病伤口的愈合速度。MMP-2 / TIMP-2通路是基质金属蛋白酶的重要原料系统行为,尤其是中期和后阶段的治疗,肉芽组织和结缔组织再生所必需的改革等等。实际上,不仅值得关注APG治疗也是当地所有的新疗法。

4所示。结论

APG治疗可以抑制MMP-2的表达,促进糖尿病慢性难治性皮肤伤口的TIMP-2而且减少MMP-2 / TIMP-2的比值。TGF -β1可能与这些影响。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由国家自然科学基金的拨款81170776中国和格兰特2009 sz0153科技四川省统计局、中国。投资者没有直接参与研究设计;在收集、分析和解释数据;在论文的写作;在决定提交投稿。研究人员是独立的研究资助者。李局域网和陈大为同样这项工作。作者感谢刘护士长Min(糖尿病足护理中心、内分泌和新陈代谢,华西医院,四川大学)参与溃疡护理在治疗期和随访;教授Shiqiang岑(糖尿病足保健中心、内分泌和新陈代谢,华西医院,四川大学)手术有助于治疗失败的参与者;和所有的病人,实践护士和调查人员对这项研究的贡献。