文摘

开发新的治疗2型糖尿病的治疗需要健壮的、可再生的和验证在活的有机体内实验系统。老鼠提供最理想的动物模型研究的潜在治疗方法。与更大的动物,小鼠妊娠期较短,基因相似,常常生出许多后代,可以有多个组在一个笼子里。小鼠模型已经广泛代谢的特点使用不同的测试。这份报告总结了如何执行这些测试以及如何产生自信地数据分析确定胰岛素抵抗和胰岛素分泌的变化与高重现性。代谢的主要测试评估在鼠标了葡萄糖钳,静脉注射和口服葡萄糖耐量测试。所有这些实验,包括一些通常采用变异,我们描述:(i)他们的表现;(2)他们的优点和局限性;(3)的经验公式和数学模型实现分析数据产生的实验程序获得可靠的外围测量胰岛素敏感性和β细胞的功能。最后,之前的列表的应用这些方法和分析技术更好地理解他们的使用和提供这些研究获得的证据。

1。介绍

全球预测2型糖尿病的发病率快速增长也在未来的几十年里随着越来越多的国家发展经济和超重和肥胖蔓延到人口的遗传易感性疾病的发展(1]。这些因素使得需要有效的糖尿病治疗,大得多。开发新的治疗2型糖尿病的治疗需要健壮的、可再生的,和验证在活的有机体内实验系统。特别重要的是基础在活的有机体内模型,因为这些可以选择和完善实验模型为进一步研究和药物开发。有多种动物模型的胰岛素抵抗和减少β细胞功能包括基因缺陷小鼠和大鼠和老鼠和老鼠菌株美联储高能量饮食。老鼠可以提供最理想的动物模型研究潜在的2型糖尿病的治疗方法。与更大的动物,小鼠妊娠期较短,常常生出许多后代,可以安置在多个组在一个笼子里。这使得“房子”育种更便宜和更容易产生大量获得well-powered研究。基因缺失和超表达技术已经在小鼠建立了二十年,让研究人员创建显示的单基因突变小鼠表型是有用的在2型糖尿病治疗的发展2]。也有2型糖尿病的小鼠模型,由于出现自发突变,如瘦素缺乏ob / ob和瘦素受体缺乏db / db老鼠(3]。

C57 / BL6鼠标应变喂高脂肪的食物是一种常用的动物模型发展的潜在治疗2型糖尿病(4]。这些老鼠喂食高脂肪的饮食很短的时间内(3 - 8周)变胖,严重的胰岛素抵抗和发展postglucose负载高血糖、空腹血胰岛素增多,减少胰岛素反应(第一阶段4,5]。这些表型特征相似的表型特征的一些人类2型糖尿病,这样使模型研究潜在的2型糖尿病治疗的有用的工具。

的优点C57 / BL6高脂肪饮食小鼠模型研究中潜在的2型糖尿病的治疗方法有很多。压力本身已近交数百代及其基因组被测序,导致没有个人间遗传背景的变化和很少的表型变化。与个人间的变化,研究可以做更少的动物在不损失统计力量使它非常符合成本效益的模型系统。与单基因突变模型的2型糖尿病,高脂肪饮食模型没有单个基因的缺陷意味着所有的治疗方法都可以应用不管的行动方式。额外的优势包括一代时间短。交付给一项研究可以在执行五个星期的可用性前提高脂肪食物的老鼠,在交付准备实验,也变得更加普及。高脂饮食小鼠模型已经广泛新陈代谢使用不同的代谢特征测试(6]。这个报告的目的是总结这些测试是如何执行的,以及如何产生自信地数据分析确定外围胰岛素敏感性和β细胞功能的变化与高重现性。

2。实验测试

一般来说,我们是指动物权重20到25克。所有以下注意事项适用于鼠标一般来说,不管具体的应变和是否野生型和转基因。小鼠麻醉处理允许连续抽样从preorbital丛较低程度的压力。麻醉的例子是腹腔内注射的咪达唑仑(0.4毫克/鼠标),结合fluanison(0.9毫克/鼠标)和芬太尼(0.02毫克/鼠标)。这种麻醉持续大约1 h。如果实验过程较长(例如夹实验;见下文),麻醉管理重复每隔60分钟。在整个过程中,动物应该继续加热垫。

3所示。为胰岛素敏感性和分泌代谢测试

3.1。5个小时禁食测量

有时,执行动态测试不可能和调查员必须只依靠一个抽样既葡萄糖稳态条件()和胰岛素()测量。在人类,在这样的条件下,与HOMA模型评估胰岛素抵抗和胰岛素敏感性log-reciprocal QUICKI公式(7通过使用隔夜空腹测量)。在鼠标,长期禁食意味着饥饿与深刻的糖原储备枯竭和counterregulatory影响,这种情况意味着。相反,5个小时禁食时期被认为是足够的小型啮齿动物禁食的定义的,因为它避免了大规模减少身体脂肪含量和糖原(8,9]。

最近的研究提出,HOMA(因此QUICKI)测量主要指肝脏(胰岛素介导的抑制肝葡萄糖生产),而不是描述外围胰岛素敏感性(10]。这些概念扩展到老鼠,肝脏胰岛素敏感性(11)可以计算为1 /(日志+日志)。用同样的方法,由β细胞分泌,而β细胞功能可以被描述/。当然,这些测量指posthepatic激素外观。为了更好的真正的β细胞活性测定,测量c -肽为宜。事实上,它是克分子数相等的发布与胰岛素但不退化在肝脏;因此,其外围浓度直接反映了胰岛胰岛素的释放。

3.2。葡萄糖钳

3.2.1之上。基本原理

在人类的黄金标准测试是euglycemic-hyperinsulinemic葡萄糖钳(12]。通过维持血糖浓度基本上恒定的目标水平通过葡萄糖输液尽管体内产生胰岛素水平升高,这个测试提供了一个绝对的胰岛素敏感性指数,由葡萄糖输注率当葡萄糖浓度保持在一个恒定的稳定状态。需要更多的葡萄糖,更高的是行动的胰岛素(胰岛素敏感性)葡萄糖吸收的外围组织。如果胰岛素水平是不同的在不同的动物,葡萄糖输液必须规范化的稳态胰岛素浓度。

3.2.2。实验的程序

在麻醉老鼠,右颈静脉和左颈动脉是乳胶过敏。静脉导管用于输注葡萄糖和胰岛素,和动脉导管用于抽样。三十分钟后引入导管、合成人类胰岛素注入速度60亩/公斤分钟⁻¹1分钟,其次是一个持续和不断注入30亩/公斤分钟⁻¹。体积负荷是4毫升1分钟,其次是2毫升/分钟。每隔5分钟血糖水平确定为120分钟。一个变量的葡萄糖(40 g / dL)溶液注入来维持血糖水平在100 - 120 mg / dL。血液样本在60岁时,90年,第120分钟测定血浆胰岛素。可以找到更多的细节在先前的报道13,14]。当一个工作的目的是检查胰岛素敏感性,血糖水平稳定状态期间的目标是正常的,≈6更易/ L。葡萄糖钳技术可能,然而,也用于其他目的比确定的胰岛素敏感性。其中一个可能性是评价葡萄糖在低血糖反调节机制。低于基线水平是有针对性的,例如,2.5更易/ L, counterregulation和因素,如胰高血糖素,可以测量。或者,夹具可用于估计胰岛素分泌反应针对高血糖值标准化提高血糖水平,如8.3或11.1更易/ L。因此,虽然夹技术的主要目的通常是维护正常的,尽管高胰岛素血胰岛素敏感性的测量葡萄糖钳技术可以用于各种其他科学目的只有轻微的修改。欧盟的例子,低血糖夹在图所示1。这项技术也可以用于区分肝与外围infusate由管理放射性标记葡萄糖胰岛素敏感性。然后,[3 -喷丸³H]葡萄糖,紧随其后的是一个连续注入[3 -³在整个研究期间H]葡萄糖。血液样本是在稳态(60 - 90分钟开始后注入)的测定[3 -³H)葡萄糖浓度(15]。

3.2.3。数据分析

计算胰岛素敏感性的葡萄糖输注率在第二个小时()除以平均胰岛素浓度在60,90和120分钟(),夹单位胰岛素的葡萄糖间隙计算除以夹葡萄糖浓度。胰岛素是体内管理以来,这个测试不提供任何评估β细胞分泌的高血糖的夹测试需要执行。使用氚化葡萄糖时,基底内源性葡萄糖生产出路)计算的输液速度除以[3 -³H]葡萄糖的血浆葡萄糖特定的活动;葡萄糖出现在90分钟除以测量血浆葡萄糖输注率dpm的特定的活动在这个时间点。出路是计算减去葡萄糖输注率从葡萄糖的外表。最后,葡萄糖处置率计算是葡萄糖出现率除以葡萄糖浓度。

3.3。静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)

3.3.1。基本原理

通过这个测试,注射葡萄糖稳态是摄动;这直接刺激胰岛素释放使葡萄糖被外围组织和抑制肝葡萄糖生产。率降低的胰岛素浓度的葡萄糖浓度是一个索引胰岛素的行动。同时胰岛素浓度指数的能力胰腺释放葡萄糖刺激下的激素。

3.3.2。实验的程序

在麻醉老鼠,血液样本来自眼球后的眶毛细血管丛升高到100毫升吸管预清洗的肝素溶液在0.9%氯化钠(100 U /毫升)。此后,葡萄糖(解决10 g / dL)静脉注射的剂量超过3秒1克/公斤的尾静脉没有冲洗27-gauge针后注入。体积负荷剂量的10 mL / g的身体wt。1克/公斤是相当高的,因为老鼠的快速的新陈代谢;事实上,增加胰岛素是观察到的只有1分钟,而且很少在5分钟,当给予低剂量葡萄糖如0.3或0.25克/公斤。1、5、10、20、30、50分钟后注入,收集血液样本(75毫升)。第一个示例是1分钟,因为到那时,葡萄糖的混合阶段丸可以考虑终止;最后一个示例是在50分钟,以避免可能的影响从麻醉觉醒的测量。一个例子是在左侧面板图2。

3.3.3。数据分析

净葡萄糖消除速率在葡萄糖注射液(葡萄糖耐量指数)的斜率计算间隔1分钟后葡萄糖注射液对数变换的个人血糖值。胰岛素敏感性与极小模型估计技术。模型假定一阶、非线性insulin-controlled动力学和胰岛素和葡萄糖的影响占独自净葡萄糖消失。这个建模分析,使用整个数据集从0到实验的最后提供了参数(胰岛素敏感性指数),它被定义为胰岛素的能力提高净葡萄糖消失和抑制葡萄糖生产,和参数葡萄糖效果,代表净葡萄糖消失从等离子体本身没有任何变化动态的胰岛素。葡萄糖分布体积的比率计算葡萄糖剂量之间的差异推断零拦截(模型参数)和葡萄糖基础水平。

为了简化程序获得一个胰岛素敏感性指数,一个简单的公式了。在先前的研究中,它已经表明,宽容指数(见上图)性格指数线性相关,即胰岛素敏感性的作用。此外,它已经清楚地表明,胰岛素敏感性指数取决于接下来的suprabasal消失率和葡萄糖浓度葡萄糖刺激。我们类似的方法与应用代谢参数的假设下的胰岛素敏感性指数应该是线性相关的比率/。是在这种情况下,定义为动态IVGTT胰岛素曲线下的面积区间0-50最小值除以区间的长度。这一比率,称为计算胰岛素敏感性()已被证明是一个有效的代理从最小的模型为一个简单的使用IVGTT数据。对于更多细节的开发方法,我们指的是原出版16),还额外计算显然是解释说。

急性胰岛素分泌(空气),计算的均值suprabasal 1和5分钟胰岛素水平,代表了早期胰岛素反应,而胰岛素曲线下面积(AUC)_胰岛素)描述总胰岛素释放。当AUC_胰岛素除以AUC_葡萄糖,glucose-mediated指数β细胞功能。

刚刚描述的IVGTT技术,然而,需要足够的胰岛素反应通过静脉注射葡萄糖的可靠估计的参数。当动物表现出严重的率直的分子生物学胰岛素分泌和低血清胰岛素水平与高血糖,不能量化从一个普通IVGTT。事实上,胰岛素分泌的抑制可能是如此严重,几乎没有任何suprabasal海拔血浆胰岛素后血糖的挑战是观察,使其无法使用模型。在这种情况下,胰岛素可以一起注入体内葡萄糖(insulin-modified IVGTT) (17刺激胰岛素释放[]或物质18,19]。然而,实现外围浓度可能太高如果一些残余β细胞保持能力。为了达到所需的胰岛素水平,建议使用diazoxide-supplemented glucose-insulin测试(DSGIT),建立动态的小鼠的胰岛素敏感性。这种技术应用为探索胰岛素敏感性的RIP-DN HNF-1α老鼠(20.]。DSGIT基于氯甲苯噻嗪抑制胰岛素分泌的强有力的作用[17]。过程如下:麻醉后30分钟,氯甲苯噻嗪(25毫克/公斤)皮下注射。10分钟后,葡萄糖(1克/公斤)静脉注射与人类胰岛素(剂量范围0.1 - -0.4 U /公斤)。在这种情况下加载量10μL / g身体wt. IVGTT的性能(取样和化验)发生如前所述。

众所周知,胰岛素抵抗等肥胖与胰岛素分泌增加有关。人类的一些研究已经表明,非线性逆关系(hyperbola-like)描述了生理调节系统使胰岛素敏感性和分泌朝相反方向移动,以便正常受处理葡萄糖的能力仍相对稳定(21- - - - - -23]。这个常数IVGTT叫做性格指数并计算胰岛素敏感性指数的乘积乘以急性胰岛素反应,胰岛素浓度的平均在第一分钟后葡萄糖丸。双曲线关系也意味着改变其中一个变量是相互变化的反映这种关系的其他变量和理解是基本的准确理解2型糖尿病的本质。也在老鼠身上,双曲线关系绘图时很明显的胰岛素敏感性和胰岛素分泌(17,24老鼠),因此也可以计算一个性格指数。这提供了一个工具,用于实验分析的机制调节胰岛素的行动之间的相互关系和老鼠分泌和潜在的治疗方法的研究[19]。

使用相关测量循环胰岛素浓度,然而,并不允许关于胰岛素分泌的信息,因为只有posthepatic胰岛素被视为交付。肝胰岛素提取的作用实际上也应该考虑如果我们感兴趣评估β细胞的功能,也就是说,细胞如何直接改变荷尔蒙的释放反应的胰岛素敏感性的变化。这一目标,有必要在分析还包括c -肽,可以评估曲线下的面积或在特定时间点集中值。因此,作为进一步发展的双曲线关系,通过使用从最小的模型从c -肽和β细胞参数分析、索引的能力适应的β细胞分泌胰岛素抵抗可以派生的改变。胰岛素分泌指数从而评估如此与胰岛素敏感性;它被称为适应指数一起典型的性格指数,提供了一个全面的β细胞功能的机制与流行的胰岛素抵抗。

3.4。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

3.4.1。基本原理

这应该被视为最生理测试,因为它模仿(即正确的路线。口头)假设碳水化合物。摄取葡萄糖(通常灌输到胃)在肠道吸收,进入内脏循环,然后进入体循环。血糖浓度的增加刺激胰腺β细胞释放胰岛素,刺激葡萄糖摄取的外围组织。营养物质的通道通过早期肠道刺激肠道激素的释放(例如,glucose-dependent insulinotropic多肽,GIP,和glucagon-like peptide-1, GLP-1),进而增加β细胞对葡萄糖的敏感性,增加胰岛素的生产。

3.4.2。实验的程序

麻醉后的30分钟内,填喂法管(外直径1.2毫米)被放置在胃里被用来管理葡萄糖(剂量75毫克/鼠标)在几秒钟(标准化量0.5毫升,近似能量0.171千卡)。从眼球后的血液样本收集,眶,升高毛细血管丛肝素化管前,5、10和20分钟或15日,30日,60岁,90分钟后口服填喂法。一个例子是在右边的面板图2。

3.4.3。数据分析

存在一些不同的可能性估计胰岛素敏感性通过实证方法和数学建模。

ISI排版

这个实证方法是应用程序在啮齿动物中广泛使用的公式的人类,也称为松田的方法(25]。它仅仅是作为计算的后缀的意思是表明葡萄糖和胰岛素浓度测量的平均值在整个长度的测试。这个公式提供了一个衡量胰岛素敏感性。

奥吉

建模glucose-insulin相互关系是这种方法的基础,提供了一个insulin-mediated葡萄糖间隙值,反映了胰岛素的行动。最后的公式是相当复杂(26),但其开发很容易,提供从互联网下载它(的可能性http://webmet.pd.cnr.it/ogis/,上次5月15日,2013)。公式需要动物的体重,管理的具体剂量葡萄糖,葡萄糖和胰岛素浓度在特定样本。

然而,还没有验证model-derived方法评估胰岛素分泌或β细胞的功能,除了使用浓度曲线下的面积(AUC)。可以评估AUC胰岛素分泌_ins,而β细胞功能可以通过BCI_口服= AUC_ins/ AUC_gluc。有趣的是,如果还GIP和/或GLP-1测量在测试期间,可以评估一个索引和BCI肠促胰岛素的效果_口服/ AUC_增加在AUC_增加是测量的AUC肠促胰岛素浓度。如果这项研究的主要目的是评估β细胞的性能,测量c -肽,再一次明智的胰岛素,在这些小动物血液中撤出的前提必须是有限的,只有两种化合物可以测量。更直接的β细胞的功能,因此可以从c -肽BCP_口服= AUC_cp/ AUC_gluc。同样,肠促胰岛素影响真正的β细胞释放是通过BCP_口服/ AUC_增加。

虽然性格指数的定义在OGTT从未提供,这是接受胰岛素分泌,胰岛素敏感性的产品倍仍然收益量化图自适应机制的β细胞功能和胰岛素抵抗之间的关系。虽然这些指标从未彻底验证OGTT期间,可能性格指数的乘积奥吉×BCI_口服,而适应指数可以派生奥吉×BCP_口服。

3.5。结合口服给药和静脉注射葡萄糖测试

口服葡萄糖的有趣和重要的生理暗示政府的显著增加肠道激素引起的葡萄糖。这些激素是所谓的肠促胰岛素的激素刺激胰岛素分泌glucose-dependent的方式,例如,GIP和GLP-1。在人类中,肠促胰岛素的概念最初是在1964年由两个研究表明,口服葡萄糖政府引起胰岛素反应远高于静脉注射葡萄糖,尽管血糖水平较低(27,28]。通过结合口服给药和静脉注射葡萄糖政府,从而调整静脉注射葡萄糖输注率达到匹配的葡萄糖浓度允许量化肠促胰岛素的重要性因素(主要是GIP和GLP-1)口服葡萄糖后胰岛功能。这样在老鼠身上进行的一项研究表明,大约50%的胰岛素分泌反应(以c -肽)口服葡萄糖后管理是由于肠促胰岛素的效果而不是葡萄糖,有趣的是,这个肠促胰岛素激素的相对贡献高脂肪喂养老鼠,这表明肠促胰岛素因素行为适应机制(6]。

4所示。讨论

我们已经给出了最常见的方法进行代谢研究鼠标,尤其是获得葡萄糖耐受性相关的主要参数,即胰岛素敏感性和β细胞功能和变量描述的机制适应β细胞胰岛素分泌的胰岛素抵抗。使用测试的价值在这些动物是老鼠是一个很好的模型对特定疾病(糖尿病),基本生理(老化和肥胖),以及新药的开发。所有上面的测试实际上可以在任何执行不同的鼠标应变和在几个可能的条件。代谢测试的总体目标是对糖尿病及其并发症的病因的理解,通过探索不同的情况和影响的几个从内部生产或体内化合物。例如,IVGTT和OGTT已被用于评价不同剂量的胰岛素分泌能力垂体腺苷酸cyclase-activating多肽(PACAP) [18)和glucagon-like peptide-1 (GLP-1) [19];评估的glp - 1在葡萄糖稳态的影响在不同的过程(29日- - - - - -31日];胃泌素释放肽受体的简称gene-deficient老鼠的代谢图(32IGF-I]和[33)和肝细胞的核因子(HNF) 1α(19]转基因老鼠;评估影响胰岛素分泌和敏感性不同的化合物,如胃饥饿素(34],甘丙肽[35),和酰化刺激蛋白36];和评估不同的营养物质的作用在不同品系小鼠胰岛素抵抗和β细胞功能(37- - - - - -39]。技术也被用于老鼠新陈代谢挑战与高脂饮食导致胰岛素抵抗和胰岛适应(6,24,38]。

小鼠模型的应用代谢紊乱的研究由于最近的超重和肥胖认为更重要。事实上,随着经济、科技和农业上个世纪的发展,获得足够的粮食供应是人类历史上最广泛。不幸的是,这与越来越多的久坐不动的生活方式和体育活动少,导致了全球超重和肥胖的发生率增加。超重和肥胖在全球的增长创造了流行附近肥胖相关的疾病,如心血管疾病和2型糖尿病40]。超重和肥胖相关与胰岛素敏感性下降(41)和长时间以来众所周知,大多数人能够抵消减少胰岛素敏感性增加胰岛素分泌和β细胞功能(42]。在许多人,改善β细胞功能不是长时间维持的,然而,缓慢下降的β细胞功能是结果43]。β细胞功能下降的结果是一个逐步增加在空腹和餐后高血糖和糖尿病的发展。小鼠的研究中,鉴于诱导不同肥胖状况的相对轻松,可能揭示重要了解病因,进展,并针对肥胖流行病可能的补救措施。

值得注意的是,没有具体的测试已经创建了鼠标,但它们都只是人类,然后适应动物测试开发的。OGTT在某些情况下,比如,数据分析是完全类似于人类的数据,而这个简化IVGTT和最小模型适合大小的动物,只允许有限数量的样本的收集。在这种情况下,作为IVGTT在老鼠一种未知的测试中,它是必要的验证与金本位(甚至在动物)葡萄糖钳(17]。然而,IVGTT以最小的建模评估胰岛素敏感性和葡萄糖效果仍然是一个相当复杂的方法需要一个算子的某些技巧和智慧的解释模型输出。由于这个原因,一个简化的,但仍然验证,方法设计(16)一个可靠的评估的基本参数。有趣的是,在方差与常见的过程,这种简化方法开发的鼠标已成功然后扩展到人类(44]。

总之,我们回顾了鼠标的主要代谢评估测试和分析相应的技术获取所需的信息从数据产生的实验程序。我们提供的列表之前的应用这些方法来更好地理解他们的使用和这些研究获得的证据。