文摘
糖尿病肾病(DN)是终末期肾功能衰竭最常见的原因之一。本研究进行了确定Dantonic药丸(DP)治疗的效果β连环蛋白表达在鼠模型链脲霉素(STZ)诱导早期DN, irbesartan治疗作为一个积极的控制。包括一般的分析代谢指标和肾脏功能,免疫组织化学染色和反向转录实时PCRβ肾皮质的连环蛋白进行每4周大鼠模型。治疗后的DP irbesartan,蛋白尿水平,肾重/体重,和肾小球基底膜厚度减少,但的表达β在肾皮质连环蛋白不表达下调。DP的有效的药物目标改善蛋白尿和肾脏肥大不应该抑制调节的表达β连环蛋白与STZ-induced早期糖尿病大鼠损伤。
1。介绍
糖尿病提供了一个重要的健康问题,因为这种疾病会导致整个身体长期并发症包括肾和其他系统(1]。糖尿病肾病(DN)的发展进步fibrosing肾病。Wnt通路组件已报告与各种肾脏疾病包括DN (2]。规范连环蛋白蛋白质含量控制Wnt-responsive目标基因的激活被称为规范化Wnt /连环蛋白通路。Wnt蛋白质与受体蛋白和稳定下游转录监管机构连环蛋白通过抑制连环蛋白磷酸化,据报道影响小管形成和上皮细胞分化[3]。高葡萄糖水平(HG)增加的磷酸化连环蛋白,减少核连环蛋白水平。的不稳定连环蛋白的表达增加与其他profibrotic因素在系膜细胞(4]。受损的连环蛋白信号是一个著名的病理反应负责ECM代谢引起的汞在系膜细胞(5]。
“草药”和“草药”是可互换的术语是指包含各种混合物的草药治疗。人们选择草药作为替代传统药物由于其低水平的毒性和“自然”的起源。几千年ofclinic实践中医药(TCM)积累了相当数量的公式,表现出可靠的体内疗效和安全性。“Dantonic丸”(DP),也被称为“强心的药丸,”表明显著疗效DN患者(6]。虽然DP已广泛应用多年,系统科学证据和证明的有效性通常缺乏与合成化学药物(7]。中药配方由多种草药,因此容易产生大量代谢产物,可能作用于身体的多个目标。
背后的分子机制DN的进展到终末期肾功能衰竭不定义良好,从而限制访问潜在的治疗靶点。因此,一个可能的治疗策略可能的调制连环蛋白水平和/或功能。许多临床研究定义了蛋白尿作为主要的标志与irbesartan肾功能的下降和治疗,从而降低尿白蛋白排泄,作为一个积极的控制。然而,到目前为止,DP是否有影响早期DN的连环蛋白水平尚不清楚。本研究旨在建立糖尿病动物模型观察DP的介入影响连环蛋白表达在早期糖尿病肾损伤大鼠并提供致病性和理论的证据,这些老鼠的DN。
2。材料和方法
2.1。材料
本研究进行内分泌学部门,实验室隶属西安交通大学第一医院从2009年10月到2011年1月。雄性SD大鼠(重180 - 200克;清洁级)选择实验动物中心的西安交通大学医学院和照顾使用标准化的方法。老鼠保持温度控制的条件下(22°C2°C)和人工12 h光/暗周期与食物和水随意。所有的老鼠被随机分为四组:非糖尿病患者控制老鼠车治疗(对照组,),链脲霉素(STZ)诱导大鼠糖尿病肾病与车辆治疗(STZ +汽车集团),与irbesartan STZ-induced糖尿病大鼠治疗(STZ + irbesartan集团与DP), STZ-induced糖尿病大鼠治疗(STZ + DP组,)。每组7老鼠评估每4周,直到研究结束,涉及12周观察期。这项研究是制度动物伦理委员会的批准。
2.2。方法
2.2.1。模型建立与药品管理局
链脲霉素(10 g / L) single-peritoneally注射的剂量60毫克/公斤体重建立糖尿病模型。的血糖水平来源于尾静脉,分别以72 h,注射后的第六天。证实了模型标准的血糖水平> 16.6 mmo / L。STZ大鼠的+ irbesartan和STZ + DP组管理irbesartan 50毫克/公斤·天和DP 500毫克/公斤·天,4周后开始,分别建立模型。每4周,24小时尿液被保留,血液从心脏收集,和大鼠麻醉下牺牲了。肾皮质组织(100毫克)被用来提取总RNA,剩下的和4%多聚甲醛固定的组织病理检查。
2.2.2。肾功能的生化和功能检测
血清血清肌酐(Cr)浓度是决定使用一个商业分析工具(美国佛罗里达州BeckmanCoulter、迈阿密、)。尿肌酐浓度测量使用分析基于贾菲的反应根据制造商的协议(肌酐测定装备)。肌酐清除率(Ccr)计算使用以下方程:Ccr [ml / min·公斤的体重)[尿铬(摩尔/升)尿量(ml) /血清铬(mol / L)] / [1/1440 (min)](1000 /体重(g)))8]。尿蛋白水平检测到放射免疫检定法后,制造商的协议。肾重/体重(千瓦/ BW, %)测量。
2.2.3。肾病理检查
肾小球和肾小管间质病变观察后,他和PAS染色。二十肾肾小球被随机选中的皮质面积400 x放大由一位经验丰富的病理学家测量系膜扩张的指数。系膜扩张的指数得分的定量估计每个肾小球系膜区宽度,表示为一个函数的总肾小球面积(9]:0,正常的肾小球;1、矩阵扩张发生在多达50%的肾小球;2、矩阵扩张肾小球发生在50 - 75%;3、矩阵扩张发生在75 - 100%的肾小球。
2.2.4。肾了电子显微镜的形态学评价
电子显微镜的形态学评价进行如下所述。部分肾组织切成1毫米的立方体,2.5%戊二醛固定,后缀四氧化锇在1%。样品在梯度酒精脱水系列和嵌入在环氧树脂812。四(60海里)超薄部分被剪掉了一颗钻石刀不断,沾染了醋酸双氧铀及柠檬酸铅。肾小球基底膜(GBM)的厚度进行了日立h - 7650 (80 kV)透射电子显微镜(JEM100SX、日本)。
2.2.5。的决心连环蛋白蛋白表达,免疫组织化学(包含IHC)
石蜡切片是常规脱蜡、水化和下降0.03体积分数的H2O2和甲醇。然后,微波抗原修复使用,组织被封锁与减毒抗体正常山羊的血清和休整,我(antirabbit)。河鼠连环蛋白抗体稀释的比例在1:50,沾biotin-labeled山羊的antirabbit抗体我和diaminobenzidine restained hematine,脱水,清除,用甘油明胶。彩色肾肾小球和小管随机选择20景点400 x放大倍数下观察一位有经验的病理学家。积极的染色率评估如下:≤25%阳性细胞(+),26 - 50%阳性细胞(+ +),51 - 75%阳性细胞(+ + +),阳性细胞> 75% (+ + + +);每个得分为1、2、3、4点,分别为统计分析(10]。
2.2.6款。的决心通过定量实时PCR连环蛋白mRNA的表达
从肾组织总RNA提取试剂盒方法根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸是由逆转录合成使用工具包(豆类公司、大连、CA)。的表达连环蛋白mRNA检测定量实时聚合酶链反应(rt - pcr)。肌动蛋白作为内部参考。PCR是20的总量L,以30 ng cDNA为模板。在95°C初始变性步骤后3分钟,40 95°C的周期为30秒30秒和60°C退火和延伸CFX384骰子实时PCR系统上运行(Bio-Rad实验室,Inc . CA)。熔解曲线分析了放大后完成。的mRNA水平正常化肌动蛋白水平的控制和比例。引物的设计和合成了大连Baosen公司)及其序列,产品长度,反应条件如表所示1。
2.2.7。统计分析
测量数据被表示为的意思SD。团体之间的显著差异进行了分析使用factorial-designed方差分析。简单线性相关分析的方法来衡量两个变量之间的相关性。P值< 0.05被认为是重要的。SPSS 16.0软件被用于这项研究。
3所示。结果
3.1。通用组的比较
有四组老鼠在这项研究中,和代谢指标,如体重、食物摄入量,水的摄入量,尿量,为每个组和血糖水平,总结在表2。食物摄入量、水的摄入量,尿量,STZ-induced糖尿病大鼠的血糖水平较高thanthosein正常控制大鼠()。身体重量降低糖尿病的老鼠比正常老鼠。然而,没有明显差异的代谢指标在糖尿病大鼠治疗车,DP, irbesartan在12周()。
3.2。DP和Irbesartan对肾的影响功能和病理检查
他和PAS染色的肾病理检查表明,系膜基质增加,肾小管空泡的糖尿病大鼠的退化。尿蛋白水平,Ccr,千瓦/ BW,系膜扩张指数和GBM厚度明显高于在糖尿病大鼠与正常大鼠相比)。治疗12周后与DP irbesartan,与汽车相比,尿蛋白水平,千瓦/ BW,和糖尿病大鼠GBM厚度减少,但Ccr和系膜扩张指数(和、职责)。DP的影响和irbesartan在糖尿病大鼠肾脏功能和病理检查表所示3和图1。
(一)
(b)
3.3。DP和Irbesartan mRNA和蛋白的表达连环蛋白
为12周连环蛋白mRNA表达的STZ-induced糖尿病大鼠与对照组相比显著调节()。的连环蛋白mRNA表达STZ + DP和STZ + irbesartan组减少,但这些变化没有显著不同的水平相比STZ +汽车集团()。免疫组织化学染色的连环蛋白STZ +车辆组比对照组(),但是染色STZ + DP和STZ + irbesartan组没有少与STZ +汽车集团()。DP和irbesartan的效果连环蛋白mRNA和蛋白表达水平如图2。
(一)
(b)
相关分析。没有明显的mRNA和蛋白表达水平之间的相关性连环蛋白和尿蛋白水平在糖尿病大鼠或千瓦/ BW ()。
4所示。讨论
DN的特点是明确肾形态和功能变化。糖尿病早期肾功能变化的特点是肾小球反渗透法和肾小球和肾肥大。这种疾病的特征是GBM增厚和系膜基质扩张(11]。本文提供的数据表明,长期模型STZ-induced糖尿病与糖尿病肾病的早期阶段。16周,肾脏肥大、反渗透法和蛋白尿是建立在我们的模型中。当时,最早的改变肾小球系膜基质积累,但不是肾小球毛细血管的崩溃,被检测到,之前报道(12]。在我们的实验中,DP草药准备和irbesartan减毒在糖尿病大鼠早期nephropathic症状,表现为蛋白尿,肾脏肥大、肾小球基底膜增厚。DP的没有影响和irbesartan治疗12周在独特的代谢指标,特别是高血糖诱导的糖尿病大鼠。因此,应该注意的是,这些疗法具有针对糖尿病肾损害的保护作用独立于降低血糖水平,这是在协议与其他研究[13]。在这方面,我们可以得出结论,DP的治疗剂量(500毫克/公斤·天至少是同样有效的irbesartan(50毫克/公斤·天在早期糖尿病肾病大鼠。
的原则制定中医采用指导选择草药(草匹配)多组分中药配方规定治疗疾病。最重要和有效的药理成分标识在DP danshensu和三七14]。丹•沈DP作为主要草本植物,已被确认为含有亲脂性的tanshinones如tanshinone花絮和亲水性酚酸尤其是包括danshensu [15]。Danshensu下调纤连蛋白的表达和collagen-1引起高葡萄糖水平在人类腹膜间皮的细胞(16]。圣气水提取物的田七会使的表达肿瘤生长因子(17),血管内皮生长因子(18),和结缔组织生长因子(CTGF) [19)和抑制晚期糖终端产品的生产过剩20.保护肾脏在糖尿病模型。因此,我们证实了DP疗法治疗糖尿病肾脏并发症应有效。
先前的研究显示,Wnt通路被发现与DN。绑定特定的Wnt蛋白质受体/ coreceptor复合物能传感细胞内信号通过-catenin-dependent或-catenin-independent通路。通常有两个池连环蛋白在细胞:一个与钙粘着蛋白在信息连接紧密相关,和其他“免费”的胞质/核。后者参与基因转录调节池。在静息状态,胞质/核连环蛋白必须保持在一个非常低的水平通过免费的快速周转连环蛋白(21]。包括Wnt蛋白质,连环蛋白活性也受肿瘤坏死因子(22)、N-cadherin和基质金属蛋白酶(MMP) [23]。此外,ROS解放的cadherin-sequestered池连环蛋白促进信号(24]。的靶基因连环蛋白,调节炎症,血管生成,并通过upregulation纤维化的细胞间粘附分子(25)、纤溶酶原激活物inhibitor-1 [26],CTGF [27),参与DN发病和进展的重要因素[28]。因此,STZ-induced糖尿病肾病的发展似乎是一个复杂的过程,涉及连环蛋白。
免疫组织化学和实时PCR分析表明的表达连环蛋白在肾皮质调节在未经治疗的糖尿病大鼠较非糖尿病患者控制老鼠在16周的研究。类似的研究也显示,调节连环蛋白水平在糖尿病大鼠肾细胞溶质和细胞核体外实验(29日]。治疗12周后与DP或irbesartan,减少连环蛋白表达水平太轻微的糖尿病控制老鼠相比明显不同。这些结果表明,DP irbesartan降低尿白蛋白和肾脏肥大预防肾损伤的早期DN通过抑制机制,不涉及连环蛋白。实验模型的解释是,动力学有关纤维化的发展速度(最多几周或几个月)与人类相比(年)。因此,治疗动物可能必须开始相对较早,之前的不可逆的破坏(即肾结构。到达之前,只能进不能退的地步)。背后的分子机制DN的进展到终末期肾功能衰竭不定义良好,从而限制访问潜在的治疗靶点。由于糖尿病肾病蛋白尿导致心血管事件和死亡是一个独立的危险因素(30.),一个策略来保护肾脏通过降低早期糖尿病肾病的影响是治疗这种疾病的第一步。我们所知,没有研究探讨治疗机理通过调节DP的DN连环蛋白。
总之,DP可能导致DN和机制的进一步理解小说的发展对其预防和管理策略。然而,我们的理解的特异性连环蛋白在DN非常有限的由于缺乏可靠的方法有选择性地评估其功能。这样的研究是重要的不仅对中药的质量控制,也对新医药产品的开发在糖尿病肾病的预防和管理。
利益冲突
作者报告没有利益冲突。