文摘

房屋建筑附近的动物有零星报道影响动物健康的各个方面。大部分的报道集中在对应激激素水平和动物的超敏反应的影响相对于人类。有轶事报告建设自身免疫性糖尿病NOD小鼠的影响。在这里,我们描述附近建设严重妨碍发展的显性糖尿病女性点头的老鼠的后代。我们证明这不是由于遗传漂变或特质与我们的特定的鼠标的殖民地。有趣的是,尽管出生的小鼠的血糖水平仍低从母亲怀孕期间受构造应力,我们检测到一个活跃的自体免疫反应对胰岛细胞,以胰岛炎的程度和血清胰岛素自身抗体水平的存在。这些结果表明,外部压力施加在胚胎发育并不妨碍但显著延迟自身免疫过程。在一起,我们的研究结果强调在周围的影响因素在活的有机体内研究和与假设一致,环境和遗传因素对自身免疫性糖尿病发展做出贡献。

1。介绍

点头鼠标在日本是在1970年代开发的,现在已经成为选择的动物模型探讨基因,细胞和分子机制参与自身免疫性糖尿病的发展(1]。这近交品系自发发展对胰岛自身免疫反应的抗原,破坏产生胰岛素的胰腺β细胞。NOD小鼠的自发的疾病过程中观察到人类和相似之处,因此,NOD小鼠模型提供了一个重要的工具来剖析和更好地理解复杂的病理生理过程导致疾病发作(2,3]。

两个主要因素是已知的导致疾病易感性的复杂特征,即遗传和环境因素。首先,自身免疫性糖尿病是一种复杂的遗传特征,与50多个基因位点导致疾病易感性(4,5]。有趣的是,大部分的之间的直接并行可以目前糖尿病易感性遗传风险因子识别在人类和老鼠6]。然而,一个明显的不同之处是,虽然自身免疫性糖尿病的患病率在人类不受性别的影响,发病率在女性点头老鼠一直高于雄性老鼠(1]。然而,点头应变构成一个有效的模型来研究病理生理学和遗传易感性的自发发生自身免疫性糖尿病。第二,环境因素在人类糖尿病易感性的贡献不太好理解,包括,但不限于,病毒感染,饮食和表观遗传修饰7,8]。

有趣的是,环境因素不仅在定义人类自身免疫性糖尿病的易感性也表现出主要影响近交点头应变对疾病的易感性。事实上,糖尿病的发病率是取决于动物的障碍状态,在特定疾病的发病率是最高无菌设施相对传统设施(9- - - - - -11]。提供的饮食类型点头老鼠或鼠标殖民地的环境温度保持既能影响疾病的发病率(12- - - - - -15]。最后,杰克逊实验室报告了适度调整疾病的发病率在大型NOD小鼠军团将在光周期变化或附近的建筑和地震震动(http://type1diabetes.jax.org/images/fine-mapping/1976%20cumulative%20inc.jpg)。

我们在具体目前NOD小鼠殖民地无菌设施,我们会定期监测雌性小鼠的糖尿病的发病率。这些数据作为控制正在进行的实验,在我们管理不同的产品女性点头老鼠来确定这些产品对疾病的病理生理学的影响以及糖尿病的发病率(16]。在我们的小动物群体中,我们表明,附近建设明显推迟发病糖尿病NOD小鼠和几乎完全阻碍了发展为明显的糖尿病。我们也证明这不是一个遗传漂变的结果在我们的NOD小鼠殖民地。结果强调的重要性,考虑到周边环境在执行实验动物模型。

2。方法

2.1。道德声明

所有实验进行符合加拿大的法规为动物保护委员会,和实验过程是Maisonneuve-Rosemont医院动物保健委员会批准。

2.2。老鼠

点头点头/ LtJ殖民地的老鼠从2006年杰克逊实验室购买,由相互交叉非糖尿病患者6雄性和雌性老鼠在友谊医院Maisonneuve-Rosemont (HMR)特定的无菌设施。常规微生物监测肮脏的床上用品暴露前哨动物进行以下小鼠病原体:鼠标肝炎病毒、仙台病毒、肺炎病毒的老鼠,reovirus-3,泰勒鼠脑脊髓炎病毒支原体pulmonis、鼠标细小病毒,老鼠分钟病毒,鼠标轮状病毒,小鼠诺瓦克病毒,属幽门螺杆菌,幽门螺杆菌胆汁,幽门螺杆菌hepaticus,博代氏杆菌属bronchiseptica,棒状杆菌kutscheri, oxytoca克雷伯氏菌,肺炎克雷伯菌,巴斯德菌multocida,巴斯德菌pneumotropica (Heyl和Jawetz),绿脓杆菌,金黄色葡萄球菌,链球菌肺炎、β链锁状球菌spp。β链锁状球菌。sp。B组,β链锁状球菌。sp。群G,沙门氏菌,枸橼酸杆菌属rodentium,piliforme梭状芽胞杆菌。以下的殖民地也免费endo -和体外寄生虫:虱子,螨,Aspicularis tetraptera,Syphacia murisSyphacia obvelata,唇鞭毛虫属sp。痢疾sp。贾第虫属,Hexamastixsp。Monocercomonoidessp。Retortamonassp。Spironucleussp。毛滴虫。这些特定病原体的殖民地仍然自由的兴趣,除了一个报告痢疾2011年7月sp.。动物被关在一个光的光周期的14个小时/ 10小时的黑暗和环境温度设定在一系列21°C到24°C。动物们无限制地蒸馏和酸化水和啮齿动物的饮食标准(2018年Teklad全球18%的蛋白质啮齿动物的饮食,或2019 Teklad全球19%的蛋白质挤压啮齿动物的饮食,哈伦实验室Inc .,印第安纳波利斯,美国)。老鼠们单独保存在聚碳酸酯通风与硬木床上用品(7090 Teklad白杨SaniChips,哈伦实验室印第安纳波利斯Inc .),美国)。

育种夫妇已经恢复,平均每14周为了最小化潜在的遗传漂移(17]。糖尿病的发病率监测当殖民地HMR F11 F13代。这只老鼠殖民地以后被称为/ LtJ-HMR点头。点头的老鼠也从点头/购买ShiLtJ殖民地杰克逊实验室2011年1月,在HMR维持在相同条件下点头/ LtJ-HMR殖民地。我们所有的NOD小鼠殖民地被现场繁殖,保持相同的障碍状况从2006年到2012年,没有住房条件的变化,农业实践,饲料,或水。没有进行胚胎移植或交叉培养在这些殖民地。

2.3。建设

沥青和人行道上的一部分被修复于9月15日至18日,2010年。动物的房子,所有的老鼠都点头位于地下室立即毗邻建筑工地。在那个时候,我们举行了三对增殖,表中提供的细节1。

表1
描述的母亲和窝点头/ LtJ-HMR鼠标殖民地用于这项研究。
2.4。监测糖尿病发病率

糖尿病发病率是每天监测糖尿病的明显的迹象(湿笼,弯腰驼背的姿势),每两周使用Diastix尿葡萄糖水平(拜耳)开始在8到10周的年龄。老鼠被称为糖尿病在连续两个积极的尿葡萄糖读数。血糖测量> 12毫米被用来证实糖尿病。老鼠出现> 12毫米一周内血糖都牺牲了。所有其他老鼠牺牲在32周的年龄。在牺牲,胰腺是收集和冻结在最佳切削温度复合(10月,Fisher)和血清收集和储存在−80°C。

2.5。胰岛炎

冷冻胰脏器官被削减到7μ米部分,压在幻灯片,在丙酮固定,并存储在一夜之间在4°C之前苏木精和伊红染色。三到六nonconsecutive每鼠胰腺部分进行分析。小岛的数量以及胰岛炎是量化的程度根据以下规模(见图4):0,没有渗透;1、小岛周围的淋巴细胞;2,淋巴细胞周围的小岛和打破屏障渗透(少于50%);3,胰岛内淋巴细胞浸润(超过50%);4广泛淋巴细胞浸润与很少或根本没有可检测胰岛细胞。

2.6。胰岛素自身抗体(IAA)

血清水平的IAA ELISA测定的一个协议适应从以前的工作18- - - - - -20.]。胰岛素(胰岛素B(合唱),Anaspec)在96年被固定到microwells板块。作为一个消极的控制,一半的每个血清样本以前孵化与胰岛素为7天。所有血清样本(preincubated与胰岛素或不)被稀释的1/10和添加到insulin-coated microwells。辣根peroxidase-labeled多克隆山羊anti-mouse免疫球蛋白(Biolegend)其次是三甲衬底解决方案(Biolegend)是用来量化insulin-specific免疫球蛋白抗体。光密度(OD)成正比的IAA浓度样本。所有的样品都在重复运行。水平的IAA在示例=(平均样本OD)−背景控制OD的(平均)。

2.7。统计数据

日志等级Mantel-Cox测试执行使用GraphPad棱镜5确定统计学意义差异的糖尿病的发病率。

3所示。结果与讨论

杰克逊实验室此前报道称,附近的建筑部分影响糖尿病发病率的点头/ LtJ殖民地在2006年(http://type1diabetes.jax.org/images/fine-mapping/1976%20cumulative%20inc.jpg)。因此,当我们意识到附近的建筑在进行一项新的糖尿病发病率研究在2010年9月,我们密切关注糖尿病发病,发病率在女性NOD小鼠实验对照组。值得注意的是,在HMR-specific无菌动物房设施,糖尿病发病的雌性老鼠点头点头/ LtJ-HMR殖民地之间通常是12到14周的年龄,糖尿病的发病率达到大约70% -80%,32周的年龄(图1)。


图1
附近的建筑影响妊娠期糖尿病发病期间和累计发病率的后代。描述的是一个典型的累积发病率为十八岁女性糖尿病点头/ LtJ-HMR小鼠(开放广场)。两个点头/ LtJ-HMR雌性老鼠在妊娠而沥青和人行道的维修设施外被立即执行。糖尿病的发病率在七个雌性后代密切监测这些母亲(封闭的圆圈),开始在哪里观察到22周的年龄和累积发病率在32周的年龄达到大约30%。生存率较, 值< 0.05。

两三个雌性老鼠点头,被放置在育种对,在妊娠期间建设9月15到18,2010(表1)。我们监测糖尿病的发病率在七个雌性后代出生在2010年10月从这些母亲。我们观察到延迟糖尿病的发作,现在开始在22周的年龄女点头出生的老鼠从母亲怀孕期间受构造应力(图1)。此外,我们发现糖尿病的发病率显著降低累积,仅有的两个七女点头32周内开发的糖尿病小鼠点头/ LtJ-HMR鼠标殖民地(图1)。

值得注意的是,糖尿病的发病率在图1在雌性小鼠近交点头监控11到13代在一个相对较小的动物屋群,一般由3 - 5增殖对。尽管增殖更换执行平均每14周,防止糖尿病的潜在基因选择抵抗,我们不能完全排除遗传漂变的可能性在点头/ LtJ-HMR鼠标殖民地(17,21- - - - - -23]。事实上,糖尿病发病通常出现在12到14周的雌性老鼠点头点头/ LtJ-HMR鼠标殖民地,因为我们保持几增殖对除此之外的时间点,有可能我们选择老鼠携带抗糖尿病的遗传多态性。

因此我们继续测试假设糖尿病发病被推迟,发病率降低点头/ LtJ-HMR鼠标殖民地由于遗传漂变。我们进行了第二次糖尿病发病率研究有六个女点头点头/ LtJ-HMR殖民地的老鼠出生在2010年12月,两个多月后的建设已经完成。此外,我们购买了20 7-week-old女点头老鼠从杰克逊实验室点头/ ShiLtJ鼠标殖民地和维护他们在相同条件下的老鼠点头/ LtJ-HMR殖民地。发病的小鼠糖尿病女性点头点头/ LtJ-HMR和点头/ ShiLtJ鼠标殖民地之间12 - 15周的年龄和糖尿病也达到了70 - 100%的累积发病率在鼠标殖民地(图32周的年龄2)。在一起,我们的数据表明,减少疾病发生和累积发病率在女性点头老鼠出生在2010年10月不是我们的鼠标由于遗传漂变的殖民地,并可能归因于附近建筑的影响。


图2
糖尿病的发病率低并不是因为遗传漂变在我们的殖民地。糖尿病的发病监测六女点头老鼠从点头/ LtJ-HMR鼠标殖民地出生两个多月后,施工已经完成(圆圈)以及20女点头/ ShiLtJ老鼠从杰克逊实验室购买和维护HMR设施(封闭的三角形)。累计糖尿病发病率没有区别这两个殖民地。生存率较, 值= 0.4142。

感兴趣的,所有的六女点头点头/ LtJ-HMR殖民地的老鼠从图2出生的两个原始的饲养者,其中母亲受到构造应力在妊娠前两个月。因此我们选择直接比较糖尿病发病率的4名女性点头老鼠出生于2010年10月初(即。,subject to construction stress during their embryonic development) to the six female NOD mice born in December 2010, where all 10 offspring are of the same breeder pair. We again find a statistical difference in the incidence of diabetes as well as a delay in disease onset (Figure3)。这些结果表明,生物效应导致糖尿病易感性由于施工压力变化迅速消散加班和不太可能造成永久性修改表型。


图3
附近建设影响糖尿病发病和累计发病率点头老鼠出生相同的增殖。糖尿病的累积发病率比较女性点头老鼠出生来自同一个增殖两人在不同的时间,也就是说,那些附近的建筑发生在胚胎发育期间(封闭的圈子, )和那些在出生两个月后,建设活动(开放的圈子里, )。生存率较, 值< 0.05。

图4
在非糖尿病患者胰岛破坏和淋巴细胞浸润点头老鼠施工压力。小岛的数量每胰腺部分被列为以组织学部分介绍(规模200μ米)。每组包括至少三个老鼠除了糖尿病NOD / LtJ-HMR老鼠在施工期间,其中包括只有两只老鼠。注意,没有非糖尿病的老鼠从点头/ LtJ-HMR小鼠出生后施工。

如前所述,七点头雌性后代出生的母亲怀孕期间受构造应力,只有两只老鼠发展到明显的糖尿病。因此,环境压力强加的建设在胚胎发育期间出现延迟,但不一定是阻碍,对胰岛抗原的自体免疫反应。因此,我们评估自身免疫的亚临床进展量化胰岛炎和胰岛细胞破坏的程度。正如预期的那样,所有糖尿病NOD老鼠面对一些胰岛细胞和大量淋巴细胞浸润,暗示一个活跃的自身免疫过程(图4)。相比之下,32-week-old非糖尿病患者点头/ ShiLtJ老鼠面对更多的胰岛细胞和淋巴细胞浸润较少比糖尿病NOD小鼠(图4)。令人惊讶的是,一些在非糖尿病患者胰岛细胞被发现点头/ LtJ-HMR小鼠胚胎发育过程中受到构造应力(图4)。此外,少数胰岛细胞与淋巴细胞(图严重渗透4)。这些结果表明,施加的压力建设并没有阻止发病的自体免疫反应和对公开的糖尿病小鼠慢慢进步。

进一步定义一个活跃的自体免疫反应是否正在进行的五个非糖尿病患者点头/ LtJ-HMR老鼠受到构造应力在胚胎发育过程中,我们确定了血清胰岛素自身抗体(IAA)的水平。血清IAA含量与自身免疫性糖尿病发病在人类和小鼠点头和血清最终IAA含量下降和疾病进展(18,24,25]。后面,32-week-old非糖尿病患者点头/ ShiLtJ小鼠没有显示检测到血清水平的IAA的水平,而糖尿病NOD小鼠表现出血清IAA(图的变量范围5)。同意的组织学观察暗示一个活跃的自身免疫反应在非糖尿病患者点头/ LtJ-HMR老鼠,IAA在场这些小鼠的血清(图5)。总的来说,这些结果表明,非糖尿病患者点头/ LtJ-HMR老鼠可能进步明显的糖尿病。附近的建筑所强加的压力在胚胎发育期间,因此,并不排除对胰岛细胞自身免疫反应,发病虽然显著延迟显性糖尿病的进展。


图5
血清IAA含量作为指标对胰岛细胞的一个持续的自体免疫反应。血清中IAA含量显示为每个鼠标组,根据健康状况(即隔离。糖尿病患者与非糖尿病患者)。注意,没有非糖尿病的老鼠从点头/ LtJ-HMR小鼠出生后施工。每个点代表一个鼠标。

当前研究的局限性包括低数量的老鼠分析在我们的军团和难以复制类似的事件。然而,类似的糖尿病发病率的变化以前记录的杰克逊实验室的大得多的动物军团点头。实际上,杰克逊实验室曾报道适度附近建设对糖尿病的发病率的影响在他们的点头/ ShiLtJ鼠标殖民地(http://type1diabetes.jax.org/images/fine-mapping/1976%20cumulative%20inc.jpg)。相比之下,我们报告一个引人注目的和严重的延误疾病发病和疾病的累计发病率。这两项研究的主要区别在于数据的分层。而我们根据是否分层老鼠妈妈怀孕期间受到构造应力,杰克逊实验室报告的数据给出了一个更大的累积发病率研究群体在整个一年,他们没有分层数据相对于建设活动。我们所观察到的原因很可能是更显著的影响附近建设发病和糖尿病发病率是由于严格分层的小鼠的影响。效果,只在我们的手中,附近的建筑影响老鼠出生从母亲怀孕期间受构造应力和不是从出生的老鼠相同的父母在稍后的日期。效果不是永久性的,不太可能造成永久性的改变鼠标殖民地。一起大NOD小鼠队列研究的结果从杰克逊实验室目前的研究进行有限数量的老鼠点头支持这样的观点,附近的建筑可以显著影响糖尿病的发病率。

另一个因素可以影响糖尿病的发病率在我们的研究包括微生物的变化随着时间的推移鼠标殖民地。动物屋障碍状态是影响糖尿病的发病率在点头的老鼠1]。最近,微生物被证明影响糖尿病发病率引起睾酮激素水平的变化和其他代谢组变化(11]。我们没有直接表征微生物或激素水平的NOD小鼠殖民地之前和之后的建设。然而,常规的哨兵卫生报告状态没有改变加班,也没有进食,水、床上用品、或动物处理程序(如方法部分中描述)。此外,点头老鼠的生育能力没有明显影响的施工压力(表1),这表明潜在的荷尔蒙水平的变化不足以影响生育能力。诚然,这些代表非常粗糙和间接措施的微生物和激素水平,因此我们不能完全排除这样一种可能性,即糖尿病发病率的变化在我们的研究中是由于修改这些参数。感兴趣的,微生物的变化已经报告给睾酮水平显著改变不影响NOD小鼠生育力(11]。

除了微生物组和激素水平,升高血清IAA含量的母亲也被证明能够显著影响糖尿病发病率(26,27]。母亲在产后,点头是10和15周的年龄第一窝施工压力(表1)。血清中IAA含量通常在8周的年龄峰值,慢慢减弱了加班(18),这表明母亲可能存在检测血清IAA的水平。值得注意的是,第一窝点头的母亲在我们的动物房设施通常表现为一个正常的糖尿病发病率(没有显示)。不过,事实是我们没有监测血清IAA含量的母亲我们的研究提出了一种限制。

总之,许多参数可以影响糖尿病发病率NOD小鼠和有可能的替代方法的解释为什么鼠标军团受到构造应力在妊娠期糖尿病的发生率减少。然而,窝出生的事实从相同的母亲,一个垃圾是受施工压力和其他没有表现出显著差异在妊娠期间糖尿病发病率表明,施工压力调节生物反应。我们的结果从而增加杰克逊实验室的观察记录的潜在影响附近的建筑在点头小鼠糖尿病的发病率。

4所示。结论

周围,这些结果强调的重要性因素时应考虑长期执行在活的有机体内研究和与假设一致,环境和遗传因素对自身免疫性糖尿病发展做出贡献。我们的数据进一步支持的附近施工引起的环境压力,严重影响生物过程。感兴趣的,点头老鼠遭受重大的听力损失(28,29日]表明振动,而不是噪音,排放结果附近的建筑在啮齿动物引发生理变化。之前我们会因此谨慎调查人员,长期进行在活的有机体内研究,改变周围的环境必须仔细考虑并适当控制。

确认

作者要感谢Adam-Nicolas Pelletier和统计分析专家的帮助。e·e·高瓴和r·科林目前糖尿病魁北克奖学金。e·e·高瓴也是一个收件人的CIHR博士奖学金。美国勒持有CIHR新的调查员奖,目前由加拿大创新基金会和加拿大自然科学和工程研究委员会。手稿中的连接提出了杰克逊实验室获得的数据,这是由国家研究资源中心在NIH (NCRR)。