Boldine防止糖尿病大鼠肾功能改变

文摘

糖尿病肾病的肾脏结构和功能改变。这些改变与增加活性氧的水平相关联,基质蛋白和促炎的分子。炎症增加差距交界的沟通和减少hemichannel活动导致膜透性增加和改变组织内稳态。由于当前的治疗糖尿病肾病不预防肾损害,我们提出一个替代治疗与boldine boldo得到的一种生物碱具有抗氧化,抗炎,降糖效果。糖尿病和控制大鼠体外治疗或不治疗boldine(50毫克/公斤/天)十周。此外,系膜细胞培养在控制条件下或在高葡萄糖浓度加促炎细胞因子,有或没有boldine(100µmol / L)。Boldine治疗在预防糖尿病动物血糖的增加,血压、肾硫代巴比土酸活性物质和尿蛋白/肌酐比值。Boldine也减少改变矩阵蛋白质和肾损害的标志。在系膜细胞,boldine防止氧化应激增加,减少差距联接的沟通,由于联接蛋白和细胞通透性的增加hemichannel活动引起的高葡萄糖和促炎细胞因子,但没有阻止缝隙连接通道。因此boldine预防肾和细胞变化和可能有助于预防糖尿病受试者的组织损伤。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的微血管并发症。它的特点是一种慢性损伤肾组织,主要是肾小球结构。DN是主要与I型糖尿病相关并发症,影响约30 - 40%的糖尿病患者,是终末期肾病的主要原因1]。

有几个因素参与糖尿病的发展glomerulopathy但这种疾病是慢性高血糖的主要发起者,触发非酶的蛋白质糖基化和增加活性氧的生产,增加氧化应激和有利于凝固和纤维化的事件(2]。高血糖还糖分会让血管壁传出小动脉血管收缩剂的作用,这与血管通透性的增加,导致反渗透法。在DN持续性蛋白尿的进展,肾小球肥大,系膜扩张,阻力指标纤维化发生,也许可以和导致肾脏功能的部分或全部的损失3,4]。

在糖尿病和在不同的细胞培养在高葡萄糖浓度(从现在和命名为高葡萄糖),增加炎症反应是观察。这个响应通常是由巨噬细胞细胞因子释放和随后的吸引力,重要的演员在DN的发展5,6]。在这个和其他疾病,炎症存在,连接素的表达(Cxs),包括Cx43、改变和增加残雪hemichannels形成是观察到的活动。后者的改变与减少缝隙连接活动(对于细胞间通信)和被认为是某些疾病的一个危险因素(7,8]。

此外,肿瘤坏死因子-α和il - 1β,两个促炎细胞因子,减少缝隙连接的活动(9,10)和增加hemichannels在皮质星形胶质细胞的活动11- - - - - -13]。更,FGF-1生长因子升高在糖尿病、增加hemichannels由Cx43的活动(14,15]。cocultures星形胶质细胞和小胶质细胞,促炎条件减少差距交界的沟通和膜透性增加,影响归因于增加hemichannel活动(12]。最后,它一直在推测Cxs增加某些疾病涉及肾损害(16]。因此,残雪hemichannels已经提出了新疗法可能的目标。

如上所述,活性氧增加糖尿病和氧化应激诱导的Cx43 hemichannels存在于细胞膜(17]。有趣的是,减少药物的影响,如二硫苏糖醇,取决于hemichannels的氧化还原状态。二硫苏糖醇诱导氧化通道关闭,但打开hemichannels静止条件下,优先减少状态(18]。从这个意义上说,一个阻塞代理关闭hemichannels氧化和减少国家应该提供一个比较优势在那些只影响hemichannels通过氧化还原变化的活动。

目前,为了防止DN的恶化,患者应严格控制血糖和血压19),但这种治疗并不足以改善肾功能。在本文中,我们提出了互补使用boldine,得到的一种生物碱Peumus boldus,以防止DN的发展。这生物碱提出了有用的治疗涉及自由基的某些疾病如动脉粥样硬化、缺血再灌注,和炎性疾病等20.]。此外,我们的初步研究发现boldine残雪hemichannel拦截器通过一个机制尚未确定,但独立于它的抗氧化性质。因此,我们建议用boldine治疗可以保持一个正常的肾小球滤过和管状在糖尿病通过阻断Cx hemichannels函数。

2。方法

2.1。Boldine净化

boldine的盐酸盐形式是由德国哈丁公司(智利圣地亚哥)和获得从boldo树皮(Peumus boldus莫利纳,檬立木科),手术后被Urzua和Acuna21与一些细微的修改。生物碱的纯度检查HPLC(高效液相色谱)分析(99%)如前所述22]。

2.2。动物和实验过程

男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(180 - 200 g)饲养的bioterium Facultad de Ciencias Biologicas,来自智利天主教大学,。老鼠被分为三个组:(1)糖尿病老鼠收到一个注射链脲霉素(45毫克/公斤体重,IP);(2)糖尿病大鼠另外对待boldine(糖尿病+ boldine)(50毫克/公斤体重1毫升,每日通过填喂法),过去10周的实验;和(3)大鼠对照组只接受药物的载体(1毫升0.1 M柠檬酸缓冲,pH值4.5,每天填喂法)。动物协议生命伦理委员会批准的智利天主教大学,并按照指导的实验室动物保健和使用了美国生理协会的支持。动物被保存15周在一个房间里,一个环境温度(22 - 25°C), 12: 12小时光:黑暗周期,食物和水随意,一名兽医的监督下。

2.3。肾功能

确定物理参数和肾功能、动物体重,血液和尿液样本获得每5周。获得动物尿液样本被安置在个体代谢笼24 h。在这段时间里他们失去了食物,但水的时期随意。

从尾静脉血液采集标本,在异氟烷麻醉。测量血糖Accutrend血条。蛋白尿是使用的方法测量布拉德福德(23)和creatininuria测量从Valtek诊断实验室使用动力工具(智利圣地亚哥)。

在每个治疗,动物牺牲麻醉(氯胺酮90毫克/公斤/甲苯噻嗪10毫克/公斤,IP)。肾脏被移除,切成5毫米厚片。的一部分组织立即被冻结在液态氮蛋白质分析和免疫组织化学的部分是固定在Bouin的解决方案。

2.4。测量渗透性

Osmomat 030渗压计(Gonotec GmbH,柏林,德国)是用来测量渗透性在50μL(血浆或尿液,根据制造商的指示。

2.5。TBARS测量

硫代巴比土酸水平的活性物质(TBARS)估计使用拉马纳坦等描述的方法。24用细微的修改。肾脏匀浆上清液与SDS混合8% (w / v),稍后通知0.8% (w / v)和醋酸(20% v / v)和加热60分钟在90°C。由离心沉淀材料移除,上层清液的吸光度测定532海里。TBARS水平计算使用校准曲线与丙二醛(MDA, Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)。

2.6。血压测量

血压测量在有意识的老鼠的尾巴使用计算机20390 CODA,肯特科学仪器(托灵顿校区,CT),在一个房间里在25°C,噪音和灯光控制。老鼠实验测量之前进行了为期一个月的训练。

2.7。组织处理和免疫组织化学分析

肾脏样本(5毫米厚)被沉浸在固定Bouin 24小时在室温下的解决方案。每个组织样本脱水和嵌入Paraplast + (Monoject科学,圣路易斯,密苏里州)和串行部分5μ米厚了旋转式切片机,安装在玻璃幻灯片。其中的一些部分被沾hematoxylin-eosin())来评估组织形态学和周期性acid-Schiff (PAS)识别糖蛋白和糖原染色。疣状也使用间接执行immunoperoxidase技术本地化胶原三世和α平滑肌肉肌动蛋白(SMA)。短暂、组织部分deparaffinized,水化,用0.05米磷酸缓冲盐(PBS) pH值7.6,和孵化主要抗体胶原三世(1:500)或αsma(1: 500)在一夜之间在22°C。二次抗体和相应的过氧化物酶anti-peroxidase复杂顺序(PAP)申请了30分钟,每22°C。immunoperoxidase反应被孵化部分可视化在0.1% (w / v) 3、3′-diaminobenzidine和0.03%的过氧化氢。抗体和PAP复杂被稀释在Tris-phosphate-saline (TPS)缓冲区包含0.25% Triton x - 100和0.7% (w / v)λ卡拉胶。孵化项目之间的部分是用PBS洗净,与苏木精和脱水。图像是用Eclipse E600尼康显微镜配备了尼康DXM1200数码相机。

2.8。细胞培养

细胞系MES-13,来自间质细胞(写明ATCC crl - 1927),是在混合的DMEM培养48 h(包含5更易与L / L或25更易与葡萄糖)和F-12(2: 1),给最后一个葡萄糖浓度的7.5 L更易控制和20更易为高葡萄糖/ L,分别。这些媒体与10%的边后卫,补充100 U /毫升青霉素,100μ0.025 g / mL链霉素,μ克/毫升二性霉素B(两性霉素B)。高葡萄糖中,TNF -α(10 ng / mL)和il - 1β(10 ng / mL)添加之前的最后6小时模拟糖尿病环境文化。Boldine (100μmol / L)添加治疗在过去的24小时。

2.9。染料吸收和荧光成像方法

MES-13细胞被播种在玻璃盖玻片和覆盖着一个正常的葡萄糖培养基。当细胞达到融合,他们在PBS洗两次,pH值7.4,与洛克的录音,然后沐浴盐溶液(5.4 154年更易/ L:氯化钠,氯化钾,2.3 CaCl₂5玫瑰,pH值7.4)5μmol / L ethidium溴化(等)。细胞培养在玻璃盖玻片放在一个正直的奥林巴斯显微镜BX 51 w1i与水浸的目标。荧光的变化检测,并且采用了数码相机(公元前12位,打印大师,本拿比,加拿大)和METAFLUOR采集和图像分析软件的程序(通用成像有限公司唐宁敦,PA,美国)。荧光记录每30秒10分钟在室温(20 - 22°C)。在分析,感兴趣的区域被放置在细胞核随机选择和这些区域减去背景。使用GraphPad棱镜软件平均斜率值比较。

2.10。染料耦合

MES-13细胞被播种在玻璃盖玻片,覆盖着正常的葡萄糖培养基,缝隙连接的功能状态是由评估测试等从一个microinjected细胞的转移到邻近的细胞。细胞被放置在一个记录生理盐水(5.4 mol / L: 154氯化钠,氯化钾,2.3 CaCl₂5、5玫瑰和葡萄糖,pH值7.4)和文化观察使用一个倒置显微镜配备氙弧灯和一个尼康B过滤器(激发波长:450 - 490 nm,发射波长:超过520海里)。要领(25更易/ L) microinjected通过玻璃微电极。两分钟后注入,细胞观察,以确定染料转移发生。耦合对应的发病率的比例情况下,染料发生扩散到多个邻居细胞。指数的耦合计算的平均数量的细胞染色已经扩散的数量除以阳性病例。在所有的实验中,胞间耦合测试通过注入至少10个细胞。

2.11。电泳和免疫印迹分析

确定Cx43的相对水平,MES-13细胞细胞溶解在里帕蛋白酶抑制剂(1毫克/毫升氨基己酸,1毫克/毫升苯甲脒,0.2毫克/毫升SBTI PMSF 3更易/ L)和磷酸酶抑制剂(0.012毫克/毫升原钒酸钠、焦磷酸钠4.46毫克/毫升、和4.2毫克/毫升氟化钠)。溶菌产物离心,收集上清液进行免疫印迹分析。蛋白质浓度测定方法的洛瑞et al。25]。蛋白质样品(50μg)从细胞培养在不同治疗SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离的10% (sds - page)和在一个车道prestained分子量(MW)标记的样本被解决。蛋白质被转移到0.45μm PVDF膜,阻止了在室温下用三pH值7.4 / 5%脱脂牛奶(w / v) / BSA 1% (w / v)。然后,PVDF膜与anti-Cx43孵化一夜之间在4°C(单克隆,病菌;1:500),其次是孵化与兔二次抗体结合,过氧化物酶(多克隆,圣克鲁斯生物技术;1:1000)1 h。然后用抗体膜被剥夺和reblotted反T-ERK(多克隆,圣克鲁斯生物技术,1:4000)加载控制,遵循同样的步骤。

免疫反应性的乐队是可视化使用化学发光试剂(西方闪电,珀金埃尔默)根据供应商所描述的过程和X-LS柯达电影。乐队检测数字化,进行光密度分析使用程序映像J(美国国家卫生研究院,华盛顿DC)。

2.12。统计分析

数据集来自不同组的大鼠或细胞,在同等条件下,比较彼此的单向方差分析(方差分析),后跟一个Bonferroni事后测试。如果认为重要差异。分析GraphPad棱镜5软件对Windows(1992 - 2007年,GraphPad软件)。

3所示。结果

3.1。Boldine防止糖尿病大鼠的高血糖和高血压

为了建立糖尿病模型,研究它是如何影响与boldine治疗,体重,血压,血糖,尿量,同渗重摩,脂质过氧化反应测定血浆和尿液中每个老鼠从上述三个组。

因为增加血浆葡萄糖水平是糖尿病的主要特征,这个参数是定期评估。从所有组动物血浆葡萄糖值的末尾总结了实验表1。对照组(C)有一个正常的血糖,而糖尿病组(D)的血糖显著更高。有趣的是,糖尿病组处理boldine (DB)的血糖低于糖尿病组没有显著不同于对照组。

能够很好的证明,动物实验I型糖尿病减肥随着时间的推移,由于肌肉和脂肪组织的损失。在实验的最后,老鼠从糖尿病组(D和DB)加权明显低于C组动物在两个糖尿病组没有显著差异(表1)。

在24小时收集尿总量显著增加在糖尿病大鼠与对照组相比。有趣的是,糖尿病组处理boldine尿量相比略减少糖尿病组(表的值1)。

因为高浓度的葡萄糖在血液和尿液中发现的糖尿病老鼠,我们评估是否有同渗重摩的变化。所有组显示,等离子同渗重摩相似的价值观和总渗摩在24 h(表在尿液中排出1)。

在糖尿病、氧化脂质增加是由于氧化应激增加,血脂异常(5]。TBARS值明显高于血浆和尿液中D和DB组与对照组相比(表1)。boldine,有趣的是,它有一个强有力的抗氧化能力,并没有修改TBARS值这两个流体可以在DB相比,D。

频繁的改变发生的结果,或相关,糖尿病高血压。出于这个原因,意味着在有意识的老鼠血压测量。控制老鼠和老鼠对待boldine显示正常血压(表1),而血压显著增加糖尿病组相比,控制。有趣的是,集团DB显示类似的血压控制动物(表1)。

3.2。Boldine防止糖尿病肾脏损伤的老鼠

特别是高血糖,糖尿病的一个危险因素肾功能障碍的特征在肾小球滤过率(GFR)。评估肾功能、尿蛋白和尿肌酐的比值在不同组评估。糖尿病大鼠有显著较高的比率()相比,控制动物(),而糖尿病大鼠治疗boldine显示值没有显著不同于控制(),但明显低于D组(图1)。

3.3。Boldine防止糖尿病大鼠肾脏形态学的变化

在糖尿病、血糖触发增加氧化应激产生稳态失衡在细胞水平上,肾组织学改变。肾脏的结构改变在D组,为评估)染色,这证明了扩张小管(箭头),间质基质增加,肾小球基底膜的增厚与控制(数字2(一个)和2 (b))。此外,清晰的细胞(星号)出现在远端小管。这些变化在很大程度上没有从DB,肾脏的变化主要受到限制的存在一些明显的细胞(图2(一个))。确定这些清晰的细胞的内容我们执行PAS染色,标签碳水化合物具有强烈的粉红色。D和DB组阳性染色(图2 (b)),标签与清晰的细胞中发现)染色。PAS染色在D组丰富的,在群里并不DB, C组(图中缺席2、中、底部和顶部,电池板职责)。

3.4。Boldine减少蛋白在糖尿病大鼠肾损害的标志

在糖尿病、肾间质基质蛋白质的增加是观察到的26]。因此,我们评估如果boldine阻止这一修改在糖尿病大鼠。第三部分从C组,彩色的胶原蛋白,显示出谨慎的棕色染色,主要局限于基底膜和血管(图3(一个)上面板)。相比之下,D组显示大量增加棕色染色主要分布在小区域(图3(一个)中间面板)。有趣的是,集团DB显示染色非常相似(图中发现控制动物3(一个),下半部分)。

myofibroblasts,反应性的特点αsma,已经被发现在糖尿病肾脏间质(27,28]。正如所料,肾脏从C组α平滑肌肌动蛋白(αsma)在血管染色,更确切地说在平滑肌细胞(图3 (b)上面板,箭头)。然而,D组的肾脏,除了血管标记,显示出强大的标记在小区域(图3 (b)中间面板)。这反应在DB集团(图很明显减少3 (b),下半部分)。

3.5。Boldine阻止脂质过氧化增加肾脏糖尿病老鼠和糖尿病的细胞环境

我们还在肾匀浆,量化TBARS视为组织的氧化还原状态。TBARS从D组(μ摩尔/ g(肾脏)显著高于控制样品(μ摩尔/ g),而在DB组;TBARS类似于控制值(μ摩尔/ g)(图4)。同样,TBARS测定上层清液的系膜细胞生长48 h控制中或在高葡萄糖培养基加促炎细胞因子,模拟糖尿病环境。TBARS的内容在上层清液中含有高葡萄糖的细胞生长和促炎细胞因子在控制细胞培养条件(两倍与μ摩尔/ g蛋白)(图5)。然而,增加TBARS完全阻止细胞保持在高葡萄糖和促炎细胞因子治疗boldine过去24小时(图5)。

3.6。Boldine防止膜透性的增加糖尿病的细胞生长环境

在静止条件下,残雪hemichannels文化不同的细胞显示开放概率低但在促炎症的存在条件下开放甚至在消极的膜电位和在细胞外的二价阳离子的存在29日- - - - - -31日),导致了放松管制的电化学梯度穿过细胞膜。在糖尿病、促炎细胞因子增加(10]。出于这个原因,它预计,肾残雪hemichannels活动可能增加。因为它很难评估hemichannels的活动在一个组织,我们估计残雪hemichannel活动通过确定的延时测量等吸收染料的上染速率在培养系膜细胞(图6(一))。等吸收的速度(斜率)控制在正常葡萄糖是细胞孵化非盟/分钟,而细胞生长在高葡萄糖+细胞因子显示斜坡非盟/分钟,显著高于控制细胞(图6 (b))。在高葡萄糖+细胞因子和细胞孵化处理100μmol / L boldine等吸收的速率不同,控制细胞(非盟/分钟)。

3.7。Boldine防止减少细胞耦合通过缝隙连接在系膜细胞培养糖尿病环境

缝隙连接调解细胞间直接通信的离子和小分子包括第二信使[32]。这种类型的细胞间通讯经常减少促炎条件(12,29日- - - - - -31日]。系膜细胞培养48 h在高葡萄糖加细胞因子显示发病率降低耦合%控制的价值%。然而,在细胞与100年孵化μmol / L boldine 24 h,发病率的耦合%,这表明boldine恢复减少这些糖尿病引起的耦合条件(图7(一))。此外,在高葡萄糖+细胞因子和细胞培养boldine耦合细胞(耦合指数)的数量增加相比,在正常的葡萄糖和细胞生长在细胞生长在高葡萄糖48 h(数字7 (b)和7 (c))。

3.8。Boldine增加Cx43的相对水平在系膜细胞生长在高葡萄糖+促炎细胞因子

在炎症条件下,变化的表达Cxs被发现(33]。Cx43是最重要的一个缝隙连接的子单元中发现肾小球(34]。由于这个原因,这种蛋白质的水平是评估在系膜细胞在糖尿病条件下培养。MES-13细胞在糖尿病环境中维护一个轻微的但不是Cx43的相对蛋白质含量显著增加(%)观察(图8)。有趣的是,在细胞培养在高葡萄糖+细胞因子在100年的存在μmol / L boldine Cx43更高水平的增加(%)和统计不同控制(图8)。

4所示。讨论

先前的研究已经报道,boldine阻止大鼠的炎症反应(35)和治疗与boldine降低糖尿病大鼠的血糖水平(36),减少氧化应激(37]。本研究证实boldine在糖尿病大鼠的降糖和抗氧化作用;然而,这项研究成果最具创新的保护作用是boldine在糖尿病大鼠肾实质及其对残雪Hemichannels抑制性影响。

减少血糖在糖尿病大鼠治疗boldine可能是由于抑制作用α葡糖苷酶(38]。这种酶,徒在1、4α债券、淀粉和双糖分解为葡萄糖。此外,boldine可能降低血糖的行动作为一个胰岛素敏化剂有助于增加骨骼肌葡萄糖利用率(36)或通过减少葡萄糖在肾小管重吸收。

观察高血压糖尿病老鼠可能是由于血管损伤和肾损害引起的氧化压力增加。增加的预防糖尿病组的血压治疗boldine赞同这个观点,boldine以来假设作为一种强有力的抗氧化剂(39]。发现boldine防止增加组织TBARS水平但不是在糖尿病大鼠尿TBARS出乎意料的时候。这个观察可能至少有两种解释。其中之一是,在糖尿病,在缺乏boldine, TBARS可能积聚在肾细胞的细胞膜相比尿或等离子体。或者,可能是肾脏被重吸收和积累成肾细胞捕获过滤TBARS生成的其他器官,因此更容易观察肾脏的显著差异比体液。相比之下,在boldine面前,TBARS在肾组织的积累较低但仍消除尿液。

除了氧化应激的影响,还有其他几种方式由boldine可以防止血压上升。首先,boldine可能作为乙酰胆碱酯酶抑制剂(38]。如果是这样,boldine可以增加血管壁的乙酰胆碱浓度这反过来又可能导致血管放松,因此,降低血压。第二,boldine可能预防肾损害,这可能有助于维持正常的平衡存在于肾脏血管活性的系统。两个主要的内分泌系统在血压调节中存在于肾脏。他们是肾素血管紧张素系统,诱发血管收缩和水、盐潴留和激肽释放酶激肽系统,导致血管舒张和水和钠排泄(19,40]。这些系统的主要酶的肾在管状部分。通过防止损害肾小管上皮细胞,boldine可能有利有助于维持正常的平衡这两个系统,因此,一个正常的压力保持在这些动物。支持这种想法,在boldine,治疗糖尿病大鼠蛋白尿和creatininuria仍然在正常范围和肾脏形态学改变,如肾小球基底膜增厚、管状扩张,远端小管和积累的糖原,在很大程度上预防。也减少纤维化和炎症细胞浸润组的观察糖尿病大鼠boldine对待。

虽然肾收到一个重要的心输出量的比例,这个组织对缺氧十分敏感,产生一个快死的管状细胞,激活炎症反应,表现为巨噬细胞浸润和矩阵积累。因此,boldine也可以保护防止低氧诱导的肾组织损伤。一些作者提出的一个重要行动Cx43预处理[41]。从这个意义上讲,Cx43的增加以应对boldine可以解释部分生物碱的保护作用。

我们建议预防损坏部分由于封锁hemichannels和缝隙连接活动增加。据报道,导致开放hemichannels炎症条件,促进体内平衡和细胞功能受损的损失12,29日- - - - - -31日,42]。我们的结果表明,系膜细胞在糖尿病环境提出了增加hemichannel活动和损失通过缝隙连接细胞通讯,由boldine治疗预防,导致耦合细胞的数量的增加,产生影响,对肾脏的适当的功能至关重要。Cx43蛋白质含量的进一步增加boldine可以解释新合成的存在缝隙连接和解释耦合细胞的数量增加。

总之,变化在糖尿病大鼠的高血糖,高血压,和肾损害与boldine预防糖尿病大鼠治疗,建议增加氧化应激产生的有害影响和促炎州糖尿病与boldine减少,不仅通过其抗氧化作用,而且由于预防维护细胞内稳态的开幕式hemichannels并保持细胞相互耦合。

道德标准

动物协议批准智利天主教大学伦理委员会,并按照指南的护理和使用实验动物了美国生理协会的支持。

利益冲突

大猩猩Hernandez-Salinas Alejandra z . Vielma,马琳n . Arismendi Mauricio p .硼,胡安·c·赛斯和维多利亚Velarde宣布没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

实验被大猩猩Hernandez-Salinas构思和设计,胡安·c·塞斯,维多利亚Velarde, Mauricio p .硼。他们由大猩猩Hernandez-Salinas, z Alejandra Vielma,玛琳·n·Arismendi。分析的数据是大猩猩Hernandez-Salinas,胡安·c·塞斯,维多利亚Velarde, Mauricio p .硼。试剂、材料和分析工具被大猩猩Hernandez-Salinas贡献,胡安·c·赛斯和维多利亚Velarde。本文作者是大猩猩Hernandez-Salinas,胡安·c·赛斯和维多利亚Velarde。

确认

Kenji Shoji的专家技术援助,Paola索托,莱昂纳多Cigarra,卡洛斯•德斯和玛丽亚Alcoholado。本研究支持由洋底de持有al Desarrollo Cientifico y学府(FONDEF) D07I1086 Anillo ACT71(维多利亚Velarde和胡安·c·赛斯)和智利的博士奖学金Comision Nacional de Investigacion Cientifica y Tecnologica (CONICYT)(大猩猩Hernandez-Salinas)。本文的数据来自一个部分完成的论文提交要求医生在生理科学的程度(大猩猩Hernandez-Salinas)智利天主教大学德。

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