海藻酸人类胰岛的微型胶囊不会增加对急性缺氧

文摘

在糖尿病胰岛移植是受到终身免疫抑制的需要。封装提供了部分immunoprotection但可能限制氧气供应,一个因素可能增强posttransplantation早期低氧诱导β细胞死亡。我们测试的敏感性的海藻酸microencapsulated人类胰岛O实验性缺氧(0.1 -0.3%₂8 h,然后再氧化)可行性和功能参数。缺氧生存能力以MTT减少了%在封装和% nonencapsulated小岛()。Nonencapsulated胰岛释放(平均37.7%)相比更HMGB1封装小岛后缺氧培养条件()。Glucose-induced胰岛素释放略受缺氧的影响。基底耗氧量也同样减少了封装和nonencapsulated小岛%与%。在27个测试细胞因子/趋化因子,缺氧il - 6的分泌增加,引发/ CXCL8两组的小岛,而增加MCP-1 / CCL2被认为只有nonencapsulated小岛。结论。海藻酸人类胰岛的微型胶囊不会增加对急性缺氧。这是一个积极的发现与胰岛移植的潜在使用封装。

1。介绍

移植的胰岛细胞可以原则上包含产生胰岛素的β细胞治疗1型糖尿病。然而,异体移植的需要用免疫抑制剂药物治疗的副作用也会随之而来。封装的小岛(或孤立的β细胞)可能会缓解这个问题,因此激励之前和正在进行的研究封装小岛成功移植的可行性。有前景的结果(逆转糖尿病动物模型的糖尿病)已报告(1- - - - - -4]。然而,问题仍然存在,封装的短期和长期功能胰岛β细胞。

一个问题属于封装小岛上缺氧的影响。本机胰腺β细胞的氧化代谢率高,满足生产和分泌胰岛素的需求(5),甚至适度减少可以抑制胰岛素释放的氧气水平(6]。移植后缺氧是一个主要的贡献(尽管不是唯一的)可行的β细胞的大幅下降(nonencapsulated)在短时间内发生移植后(7- - - - - -10]。产生负面影响的the-inevitable-hypoxia立即期间由封装后移植可能恶化,由于氧的扩散距离可以在封装和nonencapsulated小岛(或积累了β细胞)(11,12),和一个可能发生的负面影响集群的小岛(13]。比较耗氧量的封装与nonencapsulated小岛已经为新生儿做猪(14和猪15]小岛在体外(常氧条件)没有公布负面影响的封装,封装的鼠胰岛导致显著降低耗氧量(16]。然而,一个类似的比较,我们所知,没有了人类的小岛,无论是在常氧和缺氧的环境文化条件。

本研究的目的是比较的可行性和功能参数封装与nonencapsulated小岛在常氧培养条件,特别是在定义时间的缺氧。我们选择一个在体外方法,因为测试可能会影响网站移植,从而修改基本缺氧的影响。我们使用海藻酸微,因为这样一个准备最近被证明是一种很有前途的候选人为免疫保护的低炎症潜力(17,18在小鼠模型中以及功能性能1,2]。最近的一项研究使用类似的微突出有利影响人类胰岛功能封装(4]。

2。材料

超纯的海藻酸钠昆布属植物hyperborea古罗糖醛酸,Pronova UP-LVG(67%,粘度1051 mL / g,内毒素23日欧盟/ g, 187×10 MW³从Nova-Matrix),挪威奥斯陆。其他材料都来自Sigma-Aldrich化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)或低于指定的来源。

3所示。方法

3.1。胰岛采购、隔离和装运

人类胰岛被孤立在分工的移植,伊利诺伊大学芝加哥,如前所述19,20.特隆赫姆)和。持续运人胰岛功能曾被记录(1]。纯度和活力(双硫腙染色的基础上确定)和胰岛素分泌装运时以及捐赠者特征展示在表1。完全收到5出货,每个装运包含小岛从单一捐赠者。区域医疗卫生研究伦理委员会中央,挪威、批准人类胰岛的采购和使用进行研究。只有小岛从捐献者与研究同意。

3.2。胰岛文化和微型胶囊

在特隆赫姆,到达小岛是离心机(1000 rpm, 2分钟)和resuspended RPMI 1640中包含5.5毫米葡萄糖和补充10%胎牛血清(FCS), 10毫米玫瑰,4毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,100国际单位/毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。小岛被培养在烧瓶在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂在空气中。

小岛的数量估计在一夜之间文化。一半的小岛被封装在藻酸盐,而另一半仍然nonencapsulated。封装,10 - 000胰岛当量离心机(1000 rpm, 2分钟)和resuspended 300 - 400μL的RPMI 5.5毫米葡萄糖。然后他们被添加到1.8毫升的2.0%无菌过滤UP-LVG海藻酸(pH值在0.3 M甘露醇,7.3)。非齐次海藻酸微磁是由使用静电珠发生器(7 kV,一针0.4 mm,流10毫升/小时)使用胶凝溶液CaCl 50毫米₂1毫米BaCl₂150毫米甘露醇,10毫米玫瑰,在pH值7.3。微(μ米直径,测量来自33个胶囊,每个包含1 - 4小岛)被收集在一个过滤器,然后洗了三次12毫升的汉克的前20毫升的培养基和一旦被转移到培养瓶。一夜之间,封装和nonencapsulated小岛被培养,用于实验1天后。我们没有观察到大范围nonencapsulated小岛的凝结。进一步,我们没有发现明显的差异由于文化功能和可行性的长度在封装和nonencapsulated小岛。

3.3。试验协议

每个实验之前,整除从同质悬浮液的封装和nonencapsulated小岛收集估计每毫升小岛文化媒体的数量。

封装和nonencapsulated小岛被分成两组,每个人转移到培养皿(< 100小岛每5毫升培养基)连续normoxia或者暴露前8 h(缺氧14 - 18 h(复氧紧随其后。缺氧诱导将小岛在缺氧室(Billups-Rothenberg Inc . Del Mar, CA)加上一个氧监测(德尔格安全AG) & Co .公司,吕贝克,德国)和一个培养皿中湿度的5 - 10毫升的水。美国商会内部氮气(95% N得脸都红了₂,5%的公司₂),直到0.1%的水平₂是达到了。8小时后孵化室内的氧浓度已升至0.2 - -0.3%。

的四个不同的实验条件(即。,normoxia or hypoxia for encapsulated and normoxia or hypoxia for nonencapsulated islets) a control estimate of islet number per dish was made also after the end of the reoxygenation period. Islets from the different culture conditions, as well as aliquots of culture media, were sampled for measurements as detailed below.

3.4。麻省理工

对于每一个实验条件,30或40小岛(封装以及nonencapsulated)被挑选进每2 - 5平行井24-well板接触3 - 4 h(4、5 -二甲基-2 -噻唑基)- - - - - -2,5 -二苯溴化四唑(MTT)。MTT试剂在媒体上被洗几次小岛在0.9%氯化钠。小岛在400年培养一个小时μL DMSO /颜色发展在37°C。五十μ信用证的0.1 M氯化钠0.1甘氨酸,pH值10.5,增加了颜色的提取。两个平行整除每口井获得了吸光度测量。

3.5。HMGB1

高机动组的数量框1 (HMGB1)媒体整除(保存在−80°C到化验)是衡量HMGB1酶联免疫试剂盒(IBL国际,汉堡,德国)。推荐的试验是执行制片人。

3.6。胰岛素分泌

5组精心挑选的小岛被放置在每一个5 - 6井在24-well板平行。其次是预孵化为30分钟37°C 0.5毫升Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲(KRB包含0.5% BSA和10毫米玫瑰在pH值7.4)和1.6毫米葡萄糖。小岛被转移到一个新的24-well板和孵化为另一个60分钟KRB包含1.6毫米葡萄糖为了评估基底(= un-stimulated)胰岛素分泌。相同的小岛终于转移到一个新的24-well板刺激胰岛素分泌的孵化与16.7毫米90分钟KRB葡萄糖。整除的孵化媒体获得基底以及刺激分泌。样本保存在−20°C等待胰岛素RIA工具测量了人类胰岛素(微孔、圣查尔斯、钼)。

3.7。耗氧量

等量的小岛被转移到三道菜和暴露于低氧再氧化的8 h后14 - 18 h。控制小岛在normoxia不断培养。为每个条件小岛(3 x约。300小岛)立即汇集成一个样品前耗氧量测量。

耗氧量是衡量Clark-type极谱氧传感器和高分辨率的呼吸运动计量法(奥地利因斯布鲁克,OROBOROS Oxygraph-2k)。样品900小岛培养基(对应于~ 10⁶胰岛细胞/厘米³)被添加到一个室。小岛被允许沉积物在关闭室之前,打开磁力搅拌和记录在基底呼吸耗氧量。ATP合酶抑制剂寡霉素(2μg / mL)随后补充说,目的是评估非耦合(=不是ATP-coupled)呼吸。之后,protonophore羰基氰化物p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)添加和滴定(5 - 6μ米)达到最大呼吸能力的状态。最后,鱼藤酮(0.5μ和抗霉素(2.5 M)μ米),增加了线粒体复合体I和III的抑制剂,为了测量残余耗氧量(火箭)。耗氧率计算的负时间导数氧浓度出现在美国商会(pmol / s /轧机细胞)。对所有实验中,火箭值接近于零。

3.8。细胞因子/趋化因子的测量

胰岛培养条件,整除的培养基是收获后再氧化。对实验的一个子集,整除的媒体也获得后立即缺氧暴露的时间。样本保存在−80°C到进行化验。

胰岛分泌介质被多路复用分析bead-based细胞因子测定(Bio-Plex人类细胞因子组我10-Plex面板,Bio-Rad实验室、大力神,CA)包含以下分析:IL-1ra, il - 6,引发/ CXCL8 IL-9, il - 10、il - 12 (p70) GM-CFS, MCP-1 / CCL2, MIP-1β/亚兰和VEGF。此外,我们包括Bio-Plex工具包试剂检测MIF,人类细胞因子组II的一部分。我们小组选择介质preanalyzed样本的基础上(从每个四个条件)使用Bio-Plex人类细胞因子组我27-plex面板(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。以下分析低于检出限,因此排除在主要分析;il - 1β2、il - 4 IL-5、IL-13 IL-15, IL-17, Eotaxin / CCL11基本FGF,干扰素-γIP-10 / CXCL10 MIP-1α/ CCL3、PDGF-BB咆哮/ CCL5, TNF -α。推荐的多路复用分析生产者除了使用珠子推荐量的一半。intra-assay变化,网上看到补充表S1的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/374925。

3.9。Microbead解散、提取和测量的DNA

先评估DNA微胶囊内容必须完全溶解。藻酸盐微溶解(350μL)是通过增加1000μL(乙二胺四乙酸四钠(50毫米,pH值8)37°C其次是间歇性涡流长达30分钟。离心(10分钟后,13000 rpm),胰岛颗粒收获和resuspended水提取的DNA。Nonencapsulated小岛被相同的提取过程。DNA是由DNA荧光定量量化工具(Bio-Rad大力神,CA)。

4所示。统计数据

数据意味着±SEM。计算中位数。Wilcoxon等级测试用于测试的意义。一个值< 0.05被定义为具有统计学意义。

5。结果

5.1。麻省理工

胰岛的MTT提出可行性评估表2。平均吸光度值相同的封装和连续normoxia后nonencapsulated小岛。以前的缺氧暴露显著降低MTT参数两组胰岛的可行性%与% (区别)。因此没有倾向于更强的封装小岛缺氧的影响。

5.2。HMGB1

低氧诱导胰岛损伤与释放HMGB1[有关21,22]。HMGB1的释放因此用作破坏胰岛的标志。相比于封装的小岛,nonencapsulated胰岛释放% ()HMGB1连续normoxia之下。水平的HMGB1在媒体显著增加两组实验后的胰岛组织缺氧%(中位数:35.0%)封装%(中位数:33.3%)nonencapsulated小岛(的差异,)。然而nonencapsulated胰岛释放%(中位数:37.7%)比封装HMGB1小岛文化缺氧条件下(,)。

5.3。胰岛素分泌

胰岛素释放在normoxia和低葡萄糖(1.6毫米)温和(相比刺激胰岛素释放)封装和nonencapsulated小岛(图1)。分泌在这如果状态有点更高的封装与nonencapsulated小岛条件()。在同一条件下的氧气供应(normoxia,没有以前的缺氧)葡萄糖浓度提高到16.7毫米引起强烈(10-14-fold)两种类型的胰岛胰岛素反应的准备。褶皱增加16.7毫米葡萄糖,命名为葡萄糖刺激指数(GSI),封装的低比nonencapsulated小岛(与,)。有趣的是,在装船后的GSI和文化在特隆赫姆不同时期高于GSI隔离后,记录在表1。

暴露于低氧后,以低葡萄糖浓度增加胰岛素分泌nonencapsulated小岛(),但不是在封装小岛(图1)。缺氧并不影响16.7毫米的刺激影响葡萄糖胰岛素分泌的绝对值是否nonencapsulated或封装小岛。然而,由于在低葡萄糖增加胰岛素的分泌,减少低氧诱导的GSI nonencapsulated小岛更明显(%,从来,比在封装小岛和()%,从来ns)。

5.4。耗氧量

封装的耗氧量和nonencapsulated小岛文化在normoxia或短暂缺氧后如图2。在基底条件后连续normoxia耗氧量出现轻微但不显著高于在封装和nonencapsulated小岛。暴露于低氧耗氧量减少在封装(通过(%)和nonencapsulated小岛%,比较)。与基底呼吸相比,添加FCCP(最大呼吸能力的诱导物)导致耗氧量适度增加小岛受到所有四个文化条件。缺氧倾向于减少FCCP-induced呼吸(通过%在封装和%在nonencapsulated小岛,进行比较(图)2)。

缺乏管理后的“高原”的摄氧量寡霉素(结果未显示)阻碍了更详细的分析对耗氧缺氧的影响。

胰岛DNA含量在两个具有代表性的实验测量。封装的胰岛细胞平均为3.19μ2.31 g / DNA样本和nonencapsulated小岛μg / DNA样本。缺氧后获得相应的值分别为2.63和2.12μg / DNA样本。这些差异在DNA内容平行略(ns)的封装与基底耗氧量更高nonencapsulated小岛在图2(+normoxia和+ %缺氧%)。

5.5。细胞因子/趋化因子的分泌

最多元分析il - 6分泌介质检测,引发/ CXCL8 MCP-1 / CCL2, IL-9 IL12, VEGF。这些介质的分泌概要文件从封装和nonencapsulated小岛后文化在常氧和短暂的缺氧条件下给出了图3。积累(pg或fg /胰岛/ h)引发/ CXCL8 IL-9和MCP-1 / CCL2从封装和显著增加nonencapsulated基本常氧条件下小岛。相反的趋势(降低了封装的积累与nonencapsulated小岛)看到了il - 12(重要)和VEGF(无意义的)。实验性缺氧显著增强il - 6的积累和引发/ CXCL8小岛的两组,而分泌MCP-1 / CCL2显著增加来自封装小岛nonencapsulated而不变。缺氧并不影响IL-9从两组胰岛的积累。il - 12的分泌VEGF是显著降低nonencapsulated小岛和不变的封装小岛。

低氧诱导细胞因子/趋化因子积累的比值(H)除以积累期间连续normoxia (N) (H / N比率)表进行了总结3。值得注意的是,低氧诱导增强或降低了介质是不怎么明显,封装小岛和nonencapsulated小岛。因此,H / N比率接近统一封装小岛。

il - 10水平IL-1ra, gm - csf, MIP-1β/亚兰和MIF接近检出限。这些数据作为补充图S1和S2的表。封装的重要作用被认为在MIP-1基本条件β/亚兰和MIF(增加分泌)和il - 10(减少)。

我们也希望解决的问题是否低氧诱导的变化/改变的细胞因子的积累主要在缺氧后的缺氧事件或发生(即。期间,再氧化)。我们在一个子集的实验相比,(代表两个实验的两个捐助者/胰岛分离),期间积累8 h(缺氧和缺氧+复氧期间分泌。S3补充表中提供的数据表明,il - 6的分泌,引发/ CXCL8 MCP-1 / CCL2, VEGF继续在复氧期间很大程度上。最明显的挥之不去的缺氧被认为对il - 6的影响。从nonencapsulated小岛几乎90%时分泌再氧化的时间。分泌不同缺氧复氧期往往不怎么明显,封装的小岛(补充表S3和S4)补充表。IL-9和il - 12的分泌水平8 h后缺氧是很难检测到。

6。讨论

我们的结果表明,在一般情况下,急性和严重缺氧的影响不再负microencapsulated比nonencapsulated人类胰岛是否可行性或函数。事实上缺氧的影响在一些参数(MTT, HMGB1和细胞因子),或倾向于更少,以封装的小岛。这些发现的相关性会加强人类胰岛的高纯度和发病时的显示实验好函数glucose-induced胰岛素分泌和耗氧量。

HMGB1作为响应从人类胰岛分泌胰岛损伤(21分泌),是最近才被发现在缺氧(22]。我们的数据确认HMGB1分泌水平增加缺氧培养条件后,发现封装和nonencapsulated人类共享的小岛。然而,我们找不到总分泌HMGB1的封装和缺氧暴露后nonencapsulated小岛。这表明,微胶囊可以保护作用对胰岛的破坏。进一步暗示,可能会注意到,HMGB1之一,由于其炎症的性质(23,24),可能是一个因素对封装小岛纤维化反应,这种反应是一个重大的挑战在胰岛封装的基础治疗。也在这方面下分泌的HMGB1封装小岛可能被视为一个积极的发现。然而应该强调,HMGB1的直接影响人类胰岛移植最近被质疑(21]。

封装的胰岛素数据点微妙的影响,特别是稍微增加分泌基底在含氧量正常条件。这种差异背后的原因(s)尚未阐明。基于基础胰岛素释放的低氧诱导上升,我们观察nonencapsulated小岛,一个可能的解释可能是,小岛在微胶囊内受到轻度缺氧,随后引起基底分泌。Vaithilingam等人的数据可以支持这样的概念自从预处理与hypoxia-mimicking desferrioxamine剂诱发略有升高基础胰岛素分泌(25]。

高度的耗氧量在体外有关成功的移植(26- - - - - -28]。因此积极寻找(封装小岛的临床效用)的基本条件下,耗氧量(没有缺氧)没有减少在封装小岛(图2)。这些发现与之前报道的猪的胰岛封装在一个单层细胞装置(15[]和microencapsulated新生儿猪小岛14]。氧气流量的记录值(pmol / s /轧机细胞)在我们的研究与发现鼠胰岛的使用相同类型的oxygraph [29日]。低氧诱导的耗氧量下降,我们发现,这是预期从此前的研究nonencapsulated鼠胰岛(30.]。重要的是,耗氧量的减少由于缺氧并没有加剧了微型胶囊。

的生产和分泌细胞因子和趋化因子被认为反映了,至少在某种程度上,压力在小岛的影响31日]。一般重要的细胞因子和趋化因子是贪污破坏由于其不同的角色在炎症,血管生成,微胶囊纤维化。因此比较感兴趣的这些生物活性物质的分泌从封装和nonencapsulated小岛。

细胞因子/趋化因子,可以可靠地测量,我们发现,il - 6,引发/ CXCL8 IL-9,和MCP-1 / CCL2增加,或倾向于通过封装,而il - 12和VEGF往往是降低了。il - 6通常被称为一个强大的促炎细胞因子,但也显示出有消炎32,33]。各种监管角色的免疫反应也发现IL-9 [34)和il - 12是一个重要的监管机构辅助T细胞(35]。引发/ CXCL8强烈吸引子为中性粒细胞(36),导致血管生成(37]。VEGF是一个关键proangiogenic生长因子(38,39]。MCP-1 CCL2 /是一个重要的吸引力的趋化因子单核细胞,负相关的移植肾功能(40]。

应该注意的是,VEGF的分泌在缺氧反应减少而不是增加。乍一看这个发现在nonencapsulated小岛是矛盾的,因为治疗人类胰岛hypoxia-mimicking代理desferrioxamine增加VEGF的表达(25]。然而,与小岛的一项研究表明,一个48 h文化normoxia增加VEGF mRNA和蛋白在一定程度上进一步增加缺氧后(没有被观察到41]。可能受损细胞缺氧的核心小岛在某种程度上可能会损害他们的生产和VEGF的分泌。此外,我们的结果与先前的论文显示降低VEGF的分泌,以应对不同的压力源,也就是说,肠病毒感染(42]。显然,VEGF的监管在不同实验条件下不同压力需要进一步研究。

一般来说,低氧诱导增强细胞因子/趋化因子从封装胰岛分泌出现症状不明显。这可能,至少在部分,中等到高分泌在常氧(没有以前的缺氧)条件。这是否表明,封装产生更大的压力在文化不能决定的基本条件。说这样的概念是可行性,耗氧量和胰岛素数据。在任何情况下这里提供的数据不显示增强的细胞因子/趋化因子对缺氧的反应在封装和nonencapsulated小岛。

这项研究有局限性。与小岛从更多的捐助者可能会发现额外的封装之间的细微差别和nonencapsulated小岛。进一步说,一个人应该承认我们不知道在胰岛细胞准备释放细胞因子/趋化因子。引发/ CXCL8这已被证明可以由人类细胞因子β肽(31日]。然而,临床上这种不确定性可能是不重要的,因为所有细胞的一部分,胰岛移植的准备。不同的封装协议也被用在先前的研究,和我们没有测试的潜在影响这种差异在现在的环境下。然而,海藻酸的合成采用近年来已广泛应用和移植胰岛的类似的微胶囊给了有前景的结果在糖尿病动物模型1,2,4),和未来的临床研究与这些胶囊临床相关(4]。最后,一个人不能先验推断目前的发现在体外一个更复杂的在活的有机体内的情况。然而,在一个场景,在该场景中,一个或几个方面封装胰岛移植不成功的当前数据应有助于“problem-shooting”通过最小化对缺氧敏感性增加的可能性。

7所示。结论

这在体外研究揭示微妙的功能差异alginate-encapsulated和免费的小岛但是这些差异表明,封装增加急性缺氧对负面影响的易感性。实际上,几个参数的结果显示出更好的弹性对缺氧。这是一个积极的发现与胰岛移植的潜在使用封装。

确认

作者感谢Kari Slørdahl执行DNA量化和丽芙·瑞恩执行多元分析。i . k .哈尔斯、a . m . Rokstad和b . l .链是由挪威中部地区卫生行政部门之间的联络委员会(RHA)和挪威科技大学(巴克)。j . Oberholzer支持芝加哥格兰特R01 DK091526-01A1项目和国家卫生研究院。诉烧烤已经收到了来自挪威糖尿病协会的支持。

补充材料

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