文摘
2型糖尿病及其慢性并发症如今已经成为世界范围内的流行。然而,它的分子机制仍然未知。之前我们已经发现了一个新变种rs12742393NOS1AP中国人2型糖尿病的易感性。在这项研究中,我们分析了血清总分析以下三种基因型的rs12742393发现潜在的相声中变异和疾病首次通过蛋白质组学分析。我们使用OFFGEL肽分离,质/ MS分析和label-free量化分析人类基因型的血清样本禁食rs12742393 (CC, AC, AA,职责)。四个蛋白被鉴定,包括apoA4、alpha1-ACT HABP2,和角蛋白10,血液水平CC和AA比如rs12742393之间发生了重大的变化。与AA组相比,apoA4增加的水平(),而alpha1-ACT的浓度,HABP2,角蛋白10减少CC组(、0.021175和0.015661,分别地)。然后我们选择额外的空腹血清样本ELISA和免疫印迹验证。然而,没有发现显著差异通过ELISA和免疫印迹()。蛋白质分析基因型之间的变化rs12742393表明这个SNP可能参与2型糖尿病的发展。
1。介绍
一氧化氮合酶1适配器蛋白质(NOS1AP),也称为阉鸡,调节神经元一氧化氮合酶(nNOS)活动和影响一氧化氮(NO)释放绑定(NMDARs) [n -甲基- d受体1]。最近的研究表明,nNOS也局部胰岛素分泌颗粒除了神经组织,可以激活通过增加细胞内钙是一种已知的葡萄糖刺激β细胞(2,3]。几项研究已经表明,nNOS和没有直接参与胰岛素分泌和胰岛素抵抗[4- - - - - -7]。表明nNOS之间的交互和葡糖激酶(GCK)会影响GCK本地化和活动,从而影响分子胰岛素分泌(GSIS)讲究的β细胞(4]。此外,一个新颖的机制βnNOS细胞功能障碍也被描述,作为一个关键蛋白质连接胆固醇和葡萄糖代谢,可以化学损害GCK活动和减少对胰岛素GSIS颗粒(8]。此外,基因研究已经暗示了变化NOS1AP与降低血糖降低效应磺酰脲类用户以及增加2型糖尿病的发病率在病人服用钙通道阻滞剂(9,10]。虽然变异如何影响了疾病的研究有限,一个功能研究表明rs12742393可能影响NOS1AP通过影响基因表达的转录因子结合(11]。我们先前的研究显示rs12742393的证据NOS1AP参与了2型糖尿病易感性在中国人口,与风险等位基因C等位基因(或1.17,95%可信区间1.07 - -1.26;)[12]。然而,协会在欧洲血统(不是复制13]。
最近,随着基因组学和生物信息学的发展,蛋白质组学被广泛用于描述所有的蛋白质以及它们的各种修改关于环境的影响在整个身体和其他刺激。蛋白质组学可以让全球复杂样品的筛选和提供定性和定量的证据改变了蛋白表达。基于信息和初始数据,我们假设rs12742393NOS1AP可能会影响糖尿病在中国人口的发展。为了验证这个假设,我们研究不同的蛋白质分析根据不同基因型(AA,交流,和CC) rs12742393的蛋白质组学技术。
2。材料和方法
2.1。临床样本收集和准备
十二个健康的参与者与正常葡萄糖调节被选为蛋白质组学调查,包括四个CC纯合体,四个AC杂合子,和四个AA纯合子个体。然而,我们只是选择CC和AA航空公司最后统计分析和验证,因为他们可以分为两个不同的团体基于HCA和PCA。蛋白质组学分析的个体都是严格匹配随着年龄的增长,性别、体重指数、葡萄糖和脂质相关参数(糖化血红蛋白、空腹血浆葡萄糖OGTT-2 h葡萄糖、甘油三酯,总胆固醇,低密度脂蛋白和高密度脂蛋白)。然后用24 48健康参与者CC纯合体和24结合体AA航空公司包括免疫印迹以及ELISA验证。所有这些验证样本与年龄、体重指数、血糖、血脂水平。血清样本收集在空腹状态下,然后储存在−前20°C的分析。该研究机构审查委员会批准上海交通大学附属第六人民医院。从每个参与者书面知情同意了。
2.2。在溶液中消化和肽OFFGEL分馏
原油等离子体被albumin-removal稀释和治疗操作并做一些修改,以收集血浆蛋白(14,15]。然后描述的蛋白质混合物被处理获得的总肽混合物鉴定(16]。对于p我基于肽分离,我们使用了3100 OFFGEL分馏塔(安捷伦科技、Boblingen、德国)12-well设置。Electrofocusing肽的执行在20°C和50μ直到100套的水平。所有的分数都蒸发真空下离心和维护−20°C。MS分析之前,样品被Empore脱盐C18 47毫米磁盘(3米)。
2.3。Label-Free猎枪蛋白质组学鉴定
每个分离肽溶解在20μL 0.1%的甲酸和加载到RP列。使用安捷伦1100执行反毛细管系统(安捷伦科技C18柱(150)μm身份证。,100 mm length, Column Technology Inc., Fremont, CA). The mass spectral data were acquired on a LTQ linear ion trap mass spectrometer (Thermo, San Jose, CA) equipped with an electrospray interface operated in positive ion mode. The mass spectrometer was set as one full MS scan was followed by ten MS/MS scans on the ten most intense ions from the MS spectrum with the following dynamic exclusion settings: repeat count, 2, repeat duration, 0.5 min, and exclusion duration, 1.5 min.
2.4。蛋白质数据库搜索和识别
MS / MS谱都是对人类使用吉祥物算法搜索国际蛋白质指数(IPI)数据库(版本3.73),每一个真正的蛋白质氨基酸序列序列是紧随其后的是一个逆转。Carbamidomethylation (57.0214 Da)是在一个固定的半胱氨酸修饰,和氧化(15.9949 Da)被设置为一个变量修改蛋氨酸。只有一个失踪的裂解位点被允许。所有输出结果组合在一起使用内部软件命名BuildSummary删除冗余数据。搜索对人类国际蛋白质指数进行蛋白质序列数据库控制错误发现率为1%,所有谱肽计数ΔCn得分至少0.1。最后,国家自然科学基金委(归一化光谱丰富因素)得分计算代表每个蛋白质的丰度的血清(17]。
2.5。四个蛋白免疫印迹分析
我们另外48收集血清样本24 CC纯合体和免疫印迹结合体24 AA航空公司确认。2 uL的每个人血清样品稀释到1/40 2 * SDS受到PAGE-gel电泳,然后蛋白质在凝胶转移到硝酸纤维素(英国绘画纸国际有限公司)。膜首先被孵化与适当的初级抗体在一夜之间在4°C(载脂蛋白A4鼠标马伯,从细胞信号技术# 5700;角蛋白10兔多克隆Ab, ab97764 Abcam有限公司、剑桥、马;antialpha1-antichymotrypsin鼠标马伯,LF-MA0166 AbFrontier;anti-HABP2兔多克隆Ab, ab81490 Abcam有限公司、剑桥、马、职责)然后孵化HRP-conjugated二级抗体1 h。信号被增强化学发光检测系统(ECL-plus Amersham PharmaciaBiotech)。灰度计算蛋白质的乐队使用图像软件。减少系统误差,我们使用GAPDH 1: 1000稀释(GAPDH兔子马伯,细胞信号14 c10)的加载控制。计算相对水平靶蛋白的血清样本的密度比的比例带乐队的加载控制。
2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析
人类载脂蛋白A4 (apoA4)酶联免疫试剂盒(猫。不。kt - 50113, Kamiya生物医学公司)和人类alpha1-antichymotrypsin (alpha1-ACT)酶联免疫试剂盒(猫。不。kt - 498, Kamiya生物医学公司)是可以量化的蛋白质水平。原始和1:2500稀释血清样本准备apoA4 alpha1-ACT检测,分别,然后标准程序是紧随其后的是每个酶联免疫试剂盒的说明书。每个样品的吸光度在450 nm记录使用Bio-Rad标模型。
2.7。统计分析
数据显示为平均值±标准误差(str)正态分布值。为正态分布变量组之间的差异比较使用双尾t以及。所有计算都与SAS(版本8.0;SAS研究所卡里,NC)。一个值低于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。半定量的血清蛋白质组学鉴定
我们分析了微分蛋白质在三组使用猎枪蛋白质组学和label-free定量策略(图1)。蛋白质被确定与标准对应估计错误发现率为1%。后结合MS / MS数据生成的所有实验,62523肽数量导致识别1725个不同的肽被分配到353年12血清蛋白质组样品。半定量的分析、蛋白质识别至少在七个样品在我们的数据被选中。
3.2。HCA和主成分分析报告
想象全球模式与2型糖尿病相关,我们使用HCA和PCA在这项研究。如图2,HCA和PCA可以完全把CC和AA航空公司分成两个不同的组。因此,我们排除了AC组相比,只有其他两组(CC和AA比如)调查不同的蛋白质分析。最后,124年蛋白质之间的统计分析,进一步验证选择CC和AA组(见补充材料(表1)网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/357630)。
(一)
(b)
3.3。临床数据
12个受试者选择的蛋白质组学分析,但只有8名被四个CC运营商和四个AA航空公司被选为进一步验证基于PCA和HCA结果(表1)。额外的48样本选择免疫印迹和ELISA验证,与24 CC运营商和24 AA航空公司(补充表2)。
3.4。统计分析的显著改变蛋白质
获得显著改变蛋白与糖尿病有关,124年的蛋白质是排名基于定量数据和显示四个蛋白包括载脂蛋白A4 (apoA4) alpha1-antichymotrypsin (alpha-1-ACT),角蛋白10,hyaluronan-binding蛋白2 (HABP2)有显著性差异(AA和CC组之间)。与AA组相比,apoA4增加的水平(),而alpha1-ACT的浓度,角蛋白10,HABP2减少CC组(、0.015661和0.021175,分别地)。这四个蛋白参与脂蛋白代谢,急性炎症反应,表皮发展以及细胞粘附(表2)。
3.5。Semiquantification通过免疫印迹分析
ApoA4 alpha1-ACT,角蛋白10,HABP2被免疫印迹的额外验证血清样本24 CC比如和24 AA该等位。所有目标蛋白质的集成密度被GAPDH规范化。没有复制任何显著差异的四个蛋白免疫印迹。然而,差异之间的角蛋白10显示一些趋势CC和AA组()。
3.6。ELISA的量化分析
为了确定四个蛋白的水平被LTQ, ELISA用于分析人类apoA4和alpha1-ACT水平(ELISA包可用)扩大血清样本(免疫印迹中使用的一样)。所有标准空白校准样品的吸光度是调整和目标蛋白浓度是根据公式计算来自标准的校准器。然而,没有观察到显著差异的两种蛋白质在两组之间。
4所示。讨论
在这项研究中,RP-HPLC-MS /女士加上定量分析策略应用于调查rs12742393基因型的不同的蛋白质分析NOS1AP。本研究调查了可能的功能NOS1AP首次使用蛋白质组学分析。
数据显示越来越水平的apoA4 CC纯合子航母,虽然表现出减少水平的alpha1-ACT HABP2以及角蛋白10结合体与AA航空公司。这些蛋白参与脂蛋白代谢、炎症或感染的急性期,细胞增殖和迁移,以及表皮发展,这可能导致糖尿病的发展。
载脂蛋白A4 (apoA4),由小肠分泌脂肪吸收,造成很多脂质吸收,反向胆固醇运输(18),抗炎反应,19),特别是葡萄糖体内平衡。例如,apoA4直接影响增强分子生物学在胰岛细胞胰岛素分泌。ApoA4基因敲除小鼠还显示葡萄糖耐量和胰岛素分泌而外生ApoA4 ApoA4管理−−/老鼠可以改善葡萄糖耐量通过增加胰岛素分泌(20.]。此外,遗传变异与空腹血糖水平apoA4还表示一个协会(21]。因此,apoA4,唯一的调节蛋白风险等位基因携带者在我们的研究中,可能有一个与2型糖尿病与NOS1AP通过交互(或nNOS)。其他功能的机制应该阐明研究。
Alpha1-antichymotrypsin (alpha1-ACT)是一种急性期蛋白在肝、诱导炎症反应时。提升水平的alpha1-ACT观察肝细胞癌患者使用2 d-lc MALDI-MS /女士[22]。此外,最近的研究已经证实il - 1β可以修改IL-6-induced急性期蛋白的生产,如alpha1-ACT,通过一个复杂的细胞内STAT3之间的串扰和NF -κB-mediated信号转导(23]。这些证据可能会为我们提供一些新的视角发现内部alpha1-ACT和糖尿病之间的联系。
Hyaluronan-binding蛋白2 (HABP2)是一种细胞外HA-binding丝氨酸蛋白酶,是参与血液凝固和纤维蛋白溶解的外在途径。虽然HABP2主要产生于肝脏,许多研究已经证明了其在肺内皮细胞中表达,它做出了很多贡献的肺损伤24- - - - - -27]。到目前为止,还没有直接证据与HABP2糖尿病患者;然而,它的配体,透明质酸,建议与CD44和PKC和减少炎症在糖尿病肾病小鼠28]。我们的数据显示一个CC运营商HABP2水平下降,这可能会给我们一些提示找到这种蛋白质和糖尿病之间的串扰。
角蛋白10属于I型(酸性)细胞角蛋白家族,属于中间丝状体的总科(如果)的蛋白质。由于其在表皮发展经典角色,突变KRT10与epidermolytic有关角化过度(29日,30.]。然而,角蛋白10也有相互作用的蛋白激酶B (PKB)和非典型PKCδ,这可能损害激酶的活化和抑制细胞内易位(31日]。正如我们所知,PKB和PKC途径可以调节葡萄糖稳态;因此,PKB的障碍和PKCδ由角蛋白10可能引起潜在的代谢紊乱(32,33]。应该进行进一步的研究来阐明机制。
总的来说,这是第一次调查2型糖尿病易感变异的势函数利用蛋白质组学技术。我们发现四个蛋白可能与糖尿病的机制。然而,这些蛋白质之间的内在互动和NOS1AP rs12742393的机制NOS1AP调解仍需要进一步的研究来阐明。此外,蛋白质组学分析的结果并没有复制在免疫印迹或ELISA扩大样本;因此,我们不能完全排除“假阳性”的蛋白质组学分析。的原因,我们没有验证免疫印迹和ELISA的结果可能是由于细微的差别在两组之间的临床特点的主题(主题为蛋白质组学分析和验证分析)。例如,BMI的受试者在蛋白质组学分析(平均体重指数> 26公斤/米2)高于验证分析(平均BMI < 24公斤/米2);因此,它有可能影响葡萄糖和脂类代谢的可能。此外,性也应考虑分析。因此,我们应该与葡萄糖和脂质相关特征更加严格排除解释除了增加样本量。然而,正如我们所描述的方法,蛋白质组学分析非常严格的质量控制;因此,我们认为两组之间的蛋白质显示显著差异不仅仅是一个偶然的结果。因此,这可能是由于两组受试者之间的不同特点和有限样本的验证分析。应该参与这项研究更多的样本进行验证测试。
我们发现四个蛋白明显表现出rs12742393 CC和AA航空公司之间的差异的NOS1AP。虽然我们无法验证这些差异在大样本人群中,我们建议这四个蛋白可能与2型糖尿病的发展子群的病人通过相声NOS1AP蛋白质,这可能会为我们提供一个新的视角对2型糖尿病的机制。
利益冲突
没有利益冲突。
作者的贡献
冯江和Congrong王同样对本文亦有贡献。
确认
作者感谢所有护理和医护人员在上海临床糖尿病中心为他们奉献在这个研究。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81170760)、中国国家973项目(2011 cb504001),中国国家863项目(2012 aa02a509),上海新星计划(12 qh1401700),和上海的优秀年轻的医学专家(XYQ2011041)。