Ampicillin-Improved葡萄糖耐量在食源性肥胖C57BL / 6小鼠ntac是依赖于年龄的

文摘

氨苄青霉素已被证明能够提高小鼠的糖耐量。我们假设存在这种效应只有在治疗开始之前断奶治疗终止时,它就消失了。高脂肪喂养C57BL / 6 ntac小鼠被分为组在不同年龄段接受氨苄青霉素或不是。我们发现饮食和氨苄青霉素显著改变了动物的肠道微生物群组成。此外,有一个显著的改善葡萄糖耐量Ampicillin-treated,有没有老鼠参与小鼠相比对照组。在研究终止,对肿瘤坏死因子mRNA的表达编码,血清淀粉样蛋白A,和乳糖酶调节,而肿瘤坏死因子的表达(配体)总科成员15表达下调的回肠Ampicillin-treated老鼠。更高的树突细胞百分比被发现系统在高脂肪食物的老鼠,和较低的耐受性树突状细胞百分比被发现与高脂肪饮食和后期氨苄青霉素治疗。结果支持我们的假设存在一个“窗口”在生命早期的肠道微生物群的改变影响葡萄糖耐量以及肠道免疫的发展和断奶后,这个窗口可能消失。

1。介绍

2型糖尿病(T2D)是一个越来越无所不在的疾病不仅在西方世界,而且在许多第三世界发展最快的国家1]。它是由外周胰岛素抵抗和胰岛素分泌无法补偿(2]。在过去的十年中,肠道微生物群组成一直在关注解开的谜的生活方式疾病及其发展(3]。在动物模型中,肠道微生物群组成已被证明影响发展的多种自身免疫和炎症性疾病,如1型和2型糖尿病、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、炎症性肠病,以及一系列的过敏(4]。

Leptin-deficient肥胖开发葡萄糖耐受不良的小鼠有显著减少拟杆菌门和厚壁菌门的增加与野生型相比精益垃圾配偶(5]。此外,肥胖表现型老鼠可能与肠道微生物群移植到无菌野生型小鼠(6]。食源性肥胖小鼠(戴奥)也表现出修改后的肠道微生物群组成,内毒素和肠道通透性增加7]。机械的解释仍有些理论,理论从减少肠道调节性T细胞的早期启动导致不足辅助T细胞的抑制后来在生活中所谓的“卫生假说”(8)——转移脂多糖(LPS)在肠漏在敏感个体9]。肠道微生物群的一个重要作用是促进能源收获,否则难以消化的组件在我们的饮食。因此,它是合理的假设的肠道微生物群对肠道脂质代谢的影响。无菌鼠与正常微生物群的调整增加全身脂肪,导致更大的能力来获取能量从饮食和胰岛素敏感性下降(10]。无菌鼠相比传统的老鼠显示减少lipogenic-related基因表达(11]。然而,一些研究表明,机制更复杂的不仅仅是肠道脂质代谢有关。被假定外周胰岛素抵抗增强,刺激肠道toll样受体4 (TLR4)主要由有限合伙人从革兰氏阴性变形菌门导致分泌的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF_α)。这个一直以持续皮下输注有限合伙人的老鼠,从而增加血糖和胰岛素血症导致体重增加肝脏、脂肪组织,和全身12]。另外,从革兰氏阳性菌的肽聚糖刺激TLR2和激活先天免疫(13),因此缺乏这样的刺激可能会增加慢性炎症由于缺少监管的免疫力。氨苄青霉素是一种广谱的抗生素可用于目标两种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。氨苄青霉素治疗更长,比如2 - 3周老鼠(14在野生型),四个星期nonmodified C57BL / 6小鼠(15,8周在瑞士老鼠戴奥16),改善葡萄糖耐量,而窄谱抗生素红霉素主要针对革兰氏阳性细菌(似乎并没有任何影响15]。因此,更有可能是慢性炎症导致葡萄糖耐受不良与革兰氏阴性细菌和随后的有限合伙人和TLR4刺激而不是革兰氏阳性细菌和随后的TLR2刺激。这也是支持的事实,TLR4缺陷小鼠对葡萄糖耐受不良的感应高脂肪饮食(HFD) [17]。对糖耐量的影响在Ampicillin-treated野生型C57BL / 6小鼠不是结合对增长的影响或肠道监管免疫学(15),而在戴奥瑞士老鼠,氨苄青霉素除了改善葡萄糖耐量水平也降低了胰岛素,TNF -α、il - 6和TLR4活动(16]。之间的区别这两个研究可能是慢性炎症不是在野生型诱导C57BL / 6小鼠,这是已知的自发发展葡萄糖耐量(18),而HFD老鼠,因为它已在瑞士使用老鼠(16[],是诱发轻度炎症19]。因此,可能会有更多的immune-active HFD小鼠细胞影响氨苄青霉素治疗。

背后的机制改善葡萄糖耐量由于广谱抗生素治疗可能只是降低相关转让有限合伙人不成熟和渗透的直觉。然而,肠道可能不是同样渗透在任何时候的年龄(9]。所有先前的研究已经启动氨苄青霉素治疗在生命早期和持续的整个研究[14- - - - - -16]。preweaned肠道似乎比断奶肠道渗透性(20.,21),因此葡萄糖耐量只能诱导如果在生命早期开始用抗生素。此外,如果肠道微生物对糖耐量的影响在很大程度上应该与有限合伙人转让从直觉到血清,不耐受会返回很快终止抗生素治疗后,,就不会有持久的影响,揭示免疫系统。因此,本研究的目的是确定是否存在一个特定的时间框架操纵的肠道微生物群的广谱抗生素治疗会影响疾病的发展,这里显示为葡萄糖耐量,早期干预是否会产生持久的效果。

2。结果

2.1。动物的重量

在5周的年龄,没有重量差异可以证明两组之间(图2 (b))。在11周的时候,HFD-fed组动物明显比最小的致命剂量同行重,而没有HFD两组之间的差异可以证明。在年龄16周,之间的差异被发现只有参与HFD组和最小的致命剂量组(图2 (b))。

2.2。血糖和胰岛素

在5周的年纪,显著增加被发现在口服葡萄糖耐量Ampicillin-treated HFD老鼠(组1;氨苄青霉素+ /戴奥+)与参与HFD老鼠(组2;氨苄西林- /戴奥+)(AUC,;图2(一个))。的年龄,然而,在11周,6周后终止氨苄青霉素治疗,葡萄糖耐量的Ampicillin-treated HFD组(组1;氨苄青霉素+ /戴奥+)相比显著降低低脂肪饮食(最晚完成日期)控制动物(组3;氨苄青霉素−/戴奥−)(;图2(一个))。氨苄青霉素治疗4周从12到16周的年龄并没有引起任何口服葡萄糖耐量的差异,但HFD老鼠用氨苄青霉素治疗在早期(1组;氨苄西林5 w + 16 w−/戴奥+)葡萄糖宽容仍显著低于低脂喂养老鼠(组3;氨苄西林5 w w−−16 /戴奥−)(;图2(一个))。空腹胰岛素水平没有显著差异在任何时候任何团体之间的测量在研究过程中。在6周的年纪,糖化血红蛋白(HbA1c)值的Ampicillin-treated HFD老鼠(组1;氨苄青霉素+ /戴奥+)的值明显低于参与HFD老鼠(组3;氨苄青霉素−/戴奥−)(;图2 (c)),还是这样的年龄在17周HFD老鼠用氨苄青霉素治疗在早期生活(小鼠一次(1组;氨苄西林5 w + 16 w−/戴奥+)对于那些治疗两次(1 b组;氨苄西林5 w + 16 w + /戴奥+))。

2.3。血浆细胞因子和脂多糖(LPS)

老鼠不是随时用氨苄青霉素治疗,il - 6在HFD显著降低小鼠相比,在17周的年龄最小的致命剂量的小鼠的值()。没有其他差异被发现在血浆细胞因子测量研究终止(图3;表1)。肿瘤坏死因子-α水平测量,但所有测量值都低于检出限。


集团	氨苄青霉素		戴奥		IL-1a			- 2			il - 4
集团	早期	晚些时候	戴奥		中位数	最低	最大	中位数	最低	最大	中位数	最低	最大

1	+	−	+	10	80.845	28.35	591.01	31.44	2.91	66.11	2.17	0.35	31.05
1 b	+	+	+	10	61.96	7.85	591.01	32.61	4.4	53.17	3.26	0.35	22.25
2	−	+	+	6	100.32	28.76	664.78	32.27	4.4	124.6	0.35	0.35	5.49
2 b	−	−	+	4	112.92	45.67	2222.22	4.4	4.4	43.81	1.625	0.35	3.26
3	−	−	−	8	62.395	45.6	389.82	36.56	5.34	65.84	3.82	0.35	28.73

集团	氨苄青霉素		戴奥		IL-5			il - 6			il - 10
集团	早期	晚些时候	戴奥		中位数	最低	最大	中位数	最低	最大	中位数	最低	最大

1	+	−	+	10	214.27	2	57.4	37.55	1.1	136.14	155.045	48.06	874.79
1 b	+	+	+	10	87.08	32.08	60.14	34.3	1.1	374.97	246.91	70.73	1244.12
2	−	+	+	6	269.025	55.23	36.38	9.2	1.1	80.87	352.825	146.38	729.41
2 b	−	−	+	4	140.725	13.46	4.3	6.7^一个	1.1	12.3	205.345	114.05	1883.25
3	−	−	−	8	164.635	2	4.3	34.05^一个	1.1	51.72	403.235	130.14	642.39

集团	氨苄青霉素		戴奥		IL-12p70			IL-17			地震-
集团	早期	晚些时候	戴奥		中位数	最低	最大	中位数	最低	最大	中位数	最低	最大

1	+	−	+	10	4.3	4.3	57.4	11.24	1.2	25.05	520.83	58.45	1386.39
1 b	+	+	+	10	4.3	4.3	60.14	9.21	0.73	28.9	58.45	58.45	1902.05
2	−	+	+	6	4.3	4.3	36.38	2.425	1.2	20.53	58.45	58.45	1939.3
2 b	−	−	+	4	4.3	4.3	4.3	3.485	2.22	4.97	58.45	58.45	4876.61
3	−	−	−	8	4.3	4.3	4.3	8.25	1.2	18.87	58.45	58.45	1939.3

集团	氨苄青霉素		戴奥		正			肿瘤坏死因子			gm - csf
集团	早期	晚些时候	戴奥		中位数	最低	最大	中位数	最低	最大	中位数	最低	最大

1	+	−	+	10	44.675	5.56	252.73	1.05	1.05	1.05	5.45	5.45	49.69
1 b	+	+	+	10	35.04	3.03	444.26	1.05	1.05	1.05	5.45	5.45	24.7
2	−	+	+	6	35.085	17.95	436.95	1.05	1.05	1.05	5.45	3.74	24.7
2 b	−	−	+	4	36.99	24.64	1421.42	1.05	1.05	1.05	5.45	5.45	6.29
3	−	−	−	8	35.915	21.2	333.55	1.05	1.05	1.05	5.45	3.74	24.7

。

LPS水平测定在6周的年龄在17周的年龄。在任何时候的任何团体之间的显著差异(图4)被发现。

2.4。肠道微生物群

变性梯度凝胶电泳(DGGE)的聚类分析获得的资料在五周的年龄时显示0%的相似性比较所有的动物。在11周的整体相似度为41%,年龄在16周的整体相似度为23%。当比较不同的时间点对参与动物在整个研究中,43%的相似性得到HFD和最小的致命剂量的老鼠。

入口坐标分析中得到了主成分分析(PCA)情节表现出显著差异在肠道微生物群在五周的年龄与氨苄青霉素治疗(PC1:PC2:;图5(一))和饮食(PC1:生物:;图5(c)),这也是年龄在16周(氨苄西林PC1:;图5(b))(饮食PC1:;图5(d)),而没有差异可以证明期间氨苄青霉素治疗,也就是说,在11周的时候,除了一个临界差异与饮食(PC2:)。

2.5。表达分析回肠

的mRNA的表达血清淀粉样蛋白A (SAA) ()和白介素18(地震)((图)中表达下调HFD老鼠6(一))。虽然有些变化之间的动物,被视为SAAmRNA ()和TNFmRNA ()是表示两个15倍的老鼠用氨苄青霉素治疗相比,年龄在5至16周只小鼠治疗晚期(图6 (b))。肿瘤坏死配体超科15 (TNFSF15) mRNA被发现在老鼠用氨苄青霉素治疗显著下调5到16周的年龄相比在生命后期处理(;图6 (b))。乳糖酶调节三倍的老鼠只有用氨苄青霉素治疗在生命早期HFD所有其他组的老鼠相比,但区别只是发现两次与氨苄青霉素治疗的病人相比显著(;图6 (b))。

2.6。流仪分析树突细胞和调节性T细胞

更高比例的CD11b阳性树突状细胞(CD11c +)被发现系统在脾脏HFD老鼠相比,最小的致命剂量的小鼠(图7(一)),而降低脾脏树突细胞表达耐受性标记CD103被认为在同一个老鼠(图7 (d))。此外,两组HFD老鼠用氨苄青霉素治疗在以后的生活中有一个较低的耐受性树突状细胞数量相对于其他组独立早期生活的氨苄青霉素治疗(图7 (e))。没有发现显著差异的派尔集合淋巴结补丁,和没有其他差异被发现在树突和调节性T细胞(FoxP3阳性(图)7)。

3所示。讨论

氨苄青霉素治疗从出生开始对葡萄糖耐量明显有益的影响并非如此,当这些早期治疗小鼠测试在以后的生活中,尽管他们在17周的年龄糖化血红蛋白仍较低。长期血糖和糖化血红蛋白反应可能在17周的年龄仍然受到影响的早期生活氨苄青霉素治疗。它也是有趣的,在研究的其余部分,早期治疗小鼠比对照组显著减少葡萄糖宽容,支持新出版的观察开始抗生素治疗肥胖症增加在年轻的老鼠22]。

三个基因参与炎症反应,即TNF, TNFSF15, SAA,被发现是根据氨苄青霉素治疗的时间差异表达。小鼠基因SAA2,本研究在治疗小鼠基因调节,表达和诱导主要在肝脏的炎性细胞因子il - 1、il - 6和TNF -α。肝SAA1和SAA2感应到为人处事暴露后对小鼠急性炎症条件下有限合伙人(23]。还额外的肝脏表达SAA的感染和炎症反应在猪和牛报道(24,25]。加上TNFmRNA也调节,支持,氨苄青霉素治疗,尽管诱导急性治疗期间改善葡萄糖耐量,实际上会导致炎症和随后的风险增加葡萄糖耐量降低后终止。然而,在这项研究中血清il - 6和il - 1的没有差别在小鼠早期生活与氨苄青霉素HFD比其他老鼠。

可以推测,氨苄青霉素治疗在这个发展的关键阶段监管免疫干扰口服耐受的发展,因此会增加炎症反应的风险时肠道细菌出现。人类和HFD肥胖老鼠曾与损耗的调节性T细胞(26]。然而,在另一项研究中,氨苄青霉素治疗似乎并没有产生重大影响的调节性T或NK细胞相关免疫(16]。我们的研究并没有表明调节性T或树突细胞隔间,无论是本地还是系统,似乎扮演着重要的角色在改变葡萄糖耐受诱导的早期生活氨苄青霉素治疗。然而,转变的比率CD11b积极和CD103积极HFD小鼠树突状细胞表明这些可能是由HFD意义葡萄糖耐受不良引起的,而这似乎没有理由调节性T细胞,至少不是在17周的年龄当监控。TNFSF15mRNA显著下调小鼠的回肠中两次与氨苄青霉素治疗相比,只接受治疗一次。也称为TL1A TNFSF15,是一个潜在的血管内皮细胞生长抑制剂(27),它与肠道的炎性疾病,如炎症性肠病(IBD) (28)和肠易激综合症(IBS) (29日]。这种抑制剂的表达受肠道微生物群的一些成员(30.),因此它是有趣的,但不是令人惊讶的,是表达下调的动物接受最激烈的氨苄青霉素治疗。我们的观察,早期生活氨苄青霉素治疗移植肠道乳糖酶是根据一项研究,乳糖酶在小猪也调节了在无菌条件下比传统小猪(31日]。

氨苄青霉素治疗明显改良肠道微生物群在时间点上的治疗,但这些肠道微生物群的变化似乎没有持久的没有老鼠Ampicillin-free时期之间的区别。

本研究的发现可能说话的支持理论,有限合伙人在早期生活在渗透扩散粘膜屏障进入固有层和血清,通过TNF -从而诱发慢性炎症α。缺乏对血清TNF -的影响α我们观察到,似乎在这样的说话,但这是监控在研究结束的,而不是在氨苄青霉素治疗。Preweaning减少肠道有限合伙人的水平,因此,在这个年纪改善葡萄糖耐量,而有限合伙人扩散可能降低断奶后由于减少肠道通透性(21]。在老年大鼠渗透率又提升了(32]。因此,我们的研究只表明了对pre-weaned和幼年动物的影响。的重要性也是HFD对糖耐量的影响似乎下降在研究过程中,这可能,一方面,支持有限合伙人扩散理论在早期生活必不可少的因素,但另一方面离开少纠正的不容忍任何实验处理。C57BL / 6小鼠高胰岛素分泌能力,随着年龄的增长他们会增加减少外围的轻度炎症对葡萄糖耐受不良的影响(33]。这也可能是在这项研究中。葡萄糖耐量的事实一般在五周的年龄似乎是降低在这个研究可能是由于很小的时候在这个时间点上的动物。它认识到压力是由于处理的动物可能会导致增加血糖水平。

地震诱发干扰素-γ生产自然杀伤(NK)细胞和T细胞作为响应有限合伙人(34]。HFD明显下调信使rna编码SAA和肠道内的地震。这是令人惊讶的,因为SAA通常是相关的急性炎症和胆固醇的运输到肝脏,它还扮演了一个角色在不同的炎症性疾病,如动脉粥样硬化、风湿性关节炎(23]。另一方面,SAA是已知的在炎症的急性期,迅速作出反应,这可能是一个补偿效应,它是表达下调回肠如果调节其他有机体在更长一段时间。饮食影响SAA对应于观测,其诱导il - 6也显著降低等离子体对高脂肪食物的老鼠。il - 6是高脂喂养动物相比,高脂肪喂养动物是一个意外发现肥胖和2型糖尿病的人连接到增加低度炎症细胞因子il - 6等。

进一步研究氨苄青霉素治疗糖耐量的影响,它也会在将来的研究中有价值的收集免疫数据在年轻小鼠治疗期间,尽管这显然呼吁另一个实验设计,动物被杀死肠道抽样过程中学习。这也将是重要的关联的肠道通透性的葡萄糖耐受不良,甚至是研究感兴趣的年老的动物。

总之,改变葡萄糖耐量的抗生素治疗小鼠看起来主要可能的早期生活,和宽容的改善治疗终止时消失。

4所示。材料和方法

4.1。动物

实验进行了符合欧盟指令86/609保护脊椎动物用于实验和其他科学目的,和丹麦动物实验法从11月23日1306号,2007,遵循原则类似于“实验动物保健原则”(NIH没有出版。85 - 23日,修订后的1985年;http://grants1.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm)。这项研究是通过动物实验检查员,司法部,丹麦。

25假定怀孕女性C57BL / 6小鼠ntac (Taconic欧洲/ S, Ejby,丹麦)被分成三组。怀孕的老鼠生了40雄性幼崽,这是单独拨款(第1 - 40号)和随机分为笼子,每组两到四个动物。研究总共持续了17周数从出生的雄性幼崽。动物从断奶体重一次每周。之前被颈椎错位在17周的年龄的动物麻醉Hypnorm / Dormicum混合物(VetPharm有限公司Sherburn Elmet,利兹,英国;罗氏/ S, Hvidovre、丹麦)(0.2毫升SC在1:1:2水溶液)。动物们每天受到视觉控制和疾病的迹象或misthriving附属兽医咨询。

4.2。饮食

动物组1和2被喂以高脂肪饮食(HFD)在整个研究(60%能源来自脂肪,D12492,研究饮食公司,新布伦瑞克,新泽西州,美国),而动物组3作为一个低脂对照组接受低脂饮食(最晚完成日期)在整个研究(10%能源来自脂肪,C12450B,研究饮食公司,新布伦瑞克,新泽西州,美国)(图1)。提要是体重,每周更换2次。

(一)口服葡萄糖耐量试验

(b)体重

(c)糖化血红蛋白(HbA1c)

图2

(一)口服葡萄糖耐量(均值和SEM、相对值)。统计计算曲线下面积(AUC)和显示显著差异组1(氨苄青霉素+ /戴奥+)和2(氨苄西林−/戴奥+)五周的年龄()。在11周的年龄,可以证明美联储高脂肪组之间没有差异,但是差异组1(氨苄青霉素+ /戴奥+)和3(氨苄西林−/戴奥−)现在明显()。在16周时差异Ampicillin-treated早期组1(氨苄西林5 w + 16 w−/戴奥+)和美联储低脂组3(氨苄西林5 w w−−16 /戴奥−)仍明显()。(b)在五周的年纪,没有区别的身体重量可以证明,而美联储高脂肪组之间差异1(氨苄青霉素+ /戴奥+)和2(氨苄西林−/戴奥+)相比美联储低脂组3(氨苄西林−/戴奥−)在11周明显的年龄()。在16周的年龄,只有差异参与高脂喂养组2 b(氨苄西林5 w w−−16 /戴奥+)和低脂喂养组3(氨苄西林5 w - 16 w−/戴奥−)可以证明()(均值和SEM描述)。(c)糖化血红蛋白(%糖化血红蛋白,均值和SEM)显示差异高脂喂养组1(氨苄青霉素+ /戴奥+)和2(氨苄西林−/戴奥+)6周的年龄(),而现在在12周的年龄差异可以证明。在17周的年纪,之间的差异被发现早期治疗组1(氨苄西林5 w + 16 w−/戴奥+)和1 b(氨苄西林5 w + 16 w + /戴奥+)和晚期治疗组2(氨苄西林5 w−16 w + /戴奥+),分别为(;)。

图3

α 各种血浆细胞因子水平测量研究在17周终止(均值和SEM)。il - 6在统计学上显著高于低脂喂养组3(氨苄西林5 w w−−16 /戴奥−)相比,参与高脂喂养组2 b(氨苄西林5 w w−−16 /戴奥+)()。肿瘤坏死因子水平(图中未显示)也被测量,但所有测量都在检测灵敏度。

图5

主成分分析(PCA)的肠道微生物群在食源性肥胖C57BL / 6小鼠治疗或参与与氨苄青霉素从出生直到五周的年龄,年龄从12到16周,或两者兼而有之。集群在所有四个PCA情节很重要:(一)PC1:PC2:,(b)PC1:,(c)PC1:生物:(d)PC1:。

(一)

(b)

图6

在回肠mRNA表达显著差异揭示了qPCR在食源性肥胖C57BL / 6小鼠与氨苄青霉素治疗或不治疗年龄从出生直到5周(1个;氨苄西林5 w + 16 w−/戴奥+),从12至16周的年龄(2;氨苄西林5 w−16 w + /戴奥+),在这两个时间点(1 b;氨苄西林5 w + 16 w + /戴奥+),或者根本不(2 b;氨苄西林5 w w−−16 /戴奥+),以及低脂美联储控制老鼠(3;氨苄西林5 w w−−16 /戴奥−)。白介素18 (IL 18),乳糖酶(Lct),血清淀粉样蛋白(Saa2)、肿瘤坏死因子(Tnf)、肿瘤坏死因子配体超科15 (Tnfsf15)。(一):SAA ()、地震()。(b): Lct ()、肿瘤坏死因子()、SAA (),* * Tnfsf15 ()。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(我)

图7

⁺ ⁺ 流仪分析脾脏的淋巴细胞分离,肠系膜淋巴结(MLN),派尔集合淋巴结补丁(PP)。((一)- (c))的百分比CD11b阳性树突状细胞(CD11c)。((d) - (f))耐受性CD103阳性树突细胞的百分比。((g) - (i)) FoxP3阳性调节性T细胞(CD4的百分比)。高脂肪饮食(HFD)诱导C57BL / 6小鼠用氨苄青霉素治疗年龄从出生直到5周(1个;氨苄西林5 w + 16 w−/戴奥+),或从出生直到五周的年龄之后,氨苄青霉素治疗年龄从12到16周(1 b;氨苄西林5 w + 16 w + /戴奥+),或只从12至16周的年龄(2;氨苄西林5 w−16 w + /戴奥+)说明与未经处理的HFD诱导小鼠(2 b;氨苄西林5 w w−−16 /戴奥+)和未经处理的控制老鼠(3;氨苄西林5 w w−−16 /戴奥−)。误差线代表了SEM。* (),* * ()。

4.3。抗生素治疗

动物在组1 ()收到了广谱抗生素氨苄青霉素的饮用水(1 g / L) (Ampivet兽医。,Boehringer Ingelheim, Copenhagen, Denmark) from three days prior to birth of the pups until the pups reached five weeks of age. The animals in groups 2 and 3 received pure drinking water (tap water) during this period (group 2 (),组3 ())。五周的年龄所有的动物收到纯饮用水直到第12周,1组1分为组()和1 b (),第二组分为2组()和2 b ()。组1 b和2中的动物转移到水含有氨苄青霉素的研究。组2 b和3 ()作为HFD和最小的致命剂量控制组,分别接受整个研究纯净饮用水。水在抗生素治疗期间每周更换2次,一旦周期间没有抗生素治疗(图1)。

4.4。葡萄糖、胰岛素、糖化血红蛋白

口服葡萄糖耐量试验(OGTT)执行的第一个治疗周期(周5),第二个治疗期前一周(11)和第二年底治疗期(周16)。老鼠禁食过夜10小时前程序。一个基线血糖水平测量了自由泳迷你Glucometer (Hermedico,哥本哈根,丹麦),和鼠标后立即与葡萄糖溶液填喂法根据重量(Amgro I / S,哥本哈根,丹麦、浓度500 g / l。剂量4毫升/公斤)。血糖测量,60、90、120和180分钟后填喂法。

在周6、12和17小鼠血浆样本分析胰岛素内容使用超敏感大鼠胰岛素酶联免疫试剂盒(美国唐纳树林的晶体化学)的修改样品体积减少到5μL和内部大鼠胰岛素的标准,准备使用热处理鼠血浆,。糖化血红蛋白(HbA1c)测定在西门子DCA有利分析仪(西门子医疗诊断、Ballerup、丹麦)的1μL完整的血液从尾静脉穿刺提供收集盒。

4.5。血浆细胞因子和脂多糖(LPS)

血浆细胞因子il - 1α2、il - 4 IL-5, il - 6、il - 10, IL-17, TNFα,正γ通过鼠标,gm - csf测量Th1 / Th2 10丛FlowCytomix多路复用设备(Bender MedSystems,维也纳,奥地利)结合两个单工盒;小鼠白介素(p70) FlowCytomix单纯形和地震FlowCytomix单纯形(Bender MedSystems)。执行的分析是根据制造商的指示。分析是运行在BD FacsCanto流式细胞分析仪(BD生物科学、Albertslund、丹麦)和数据处理进行了使用FlowCytomixTM Pro 2.3软件(Bender MedSystems)。

等离子体的内容有限合伙人测量使用PyroGene重组因子C内毒素检测系统(Lonza、巴塞尔、瑞士)。测试利用重组因子C (rFC)这是一个endotoxin-sensitive蛋白质结合fluorogenic衬底。执行的分析是根据制造商的指示和荧光测量之前和之后一小时孵化在37°C SpectraMax + 384板读者(分子设备有限公司、钙、美国)。

4.6。肠道微生物群

粪便样本获得无菌五11和16周的年龄进行分析通过DGGE如前所述[35]。总之,细菌的DNA提取使用QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。样品均质提取之前使用FastPrep FP120细胞分裂者(QBiogene、议员生物医学、法国)45秒6米/秒。中提取DNA的质量和浓度验证NanoDrop 1000分光光度计(美国热科学)。遗传物质被放大通过聚合酶链反应(PCR),使用特定的引物的V3地区16 s rRNA基因。随后,遗传物质分离的DGGE包含30% - -65%的聚丙烯酰胺凝胶化学梯度(100%对应7 M尿素和甲酰胺40%)。DGGE概要分析了使用BioNumerics 4.5版本(应用数学、Sint-Martens-Latem、比利时)聚类分析(骰子相似系数1%的波段位置公差和优化使用未加权的两组与算术平均法(UPGMA))的聚类算法和主成分分析(PCA)。

4.7。基因表达在回肠

回肠是取样后立即与液态氮冷冻颈椎错位。大约20 - 30毫克的冰冻组织均质在1毫升QIAzol裂解试剂(试剂盒)使用gentleMACS分离器(Milteny研究,GmbH,德国)。使用RNeasy脂质组织总RNA提取的midi设备(试剂盒),和所有样本处理RNase-free DNase(试剂盒)(制造商的指令)。RNA纯度是评估使用紫外吸收光谱包括OD 260/280和OD 260/230比率NanoDrop nd - 1000分光光度计(Saveen和沃纳AB, Limhamn,瑞典)。RNA完整性(RIN), 6.1 - 8为所有样本,测量在一个安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技、Nærum、丹麦)使用RNA 6000纳米设备。提取RNA被转换成cDNA逆转录使用QuantiTECT 500 ng总RNA逆转录工具包(试剂盒)包含一个随机引物和oligo-dT(制造商的指令)。为每个样本两个单独的cDNA反应进行。互补脱氧核糖核酸是稀释1:6低EDTA TE-buffer (VWR-Bie & Berntsen)前置放大之前,完成使用TaqMan前置放大器主混合(应用生物系统公司,培育城市,CA)。200海里汇集底漆组合制备结合每个引物用于本研究。TaqMan前置放大器主组合(5μ2.5 L)混合μL 200海里汇集底漆组合和2.5μL稀释cDNA和孵化在10分钟95°C,紧随其后的是16个周期95°C的15秒和60°C在4分钟。Preamplified cDNA稀释至少1:4在低EDTA TE-buffer (VWR)。定量PCR引物(qPCR)提供了使用DELTAgene试验设计服务(Fluidigm公司、旧金山、钙、美国)(表2)。所有的引物设计在内含子。引物扩增效率和动态范围从标准曲线由稀释获得一系列高度反应样本。qPCR 48.48动态数组中进行综合射流电路(Fluidigm) 48 preamplified样本结合48底漆集2304同时qPCR反应如前所述36]。qPCR BioMark表演实时PCR仪器(Fluidigm公司),和下面的周期参数使用:2分钟50°C, 10分钟在95°C,紧随其后的是35周期与变性15秒。在95°C和退火/伸长1分钟60°C。融化曲线在每次运行后生成确认单一PCR产品(从60°C到95°C,增加1°C / 3秒)。反应是在重复执行(互补脱氧核糖核酸复制)。没有包括模板控制(NTC)指出潜在的问题与非特异性扩增或样品污染。Nonreverse DNA转录酶控制包括评估潜在的污染。目标的相对浓度信使rna被分配使用标准曲线由三个独立的稀释系列的高响应样本(cDNA稀释1:3,1:15日1:75年,1:375年,1:1875年,和1:9375)。数据获得使用Fluidigm实时PCR分析软件3.0.2 (Fluidigm公司)。


基因符号	基因	扩增效率(%)		序列5′3′	加入数量

Actb	Beta-actin	99年	F	CCCTAAGGCCAACCGTGAAA	NM_007393.3
			R	CAGCCTGGATGGCTACGTAC
支队伍	碱性磷酸酶,	93年	F	TCCTAAAGGGGCAGTTGGAA	NM_001081082.1
	肠		R	ACCTGTCTGTCCACGTTGTA
B2m	β2微球蛋白	One hundred.	F	CTGGTGCTTGTCTCACTGAC	NM_009735.3
			R	GGTGGGTGGCGTGAGTATA
Gusb	葡萄糖醛酸酶,β	101年	F	AGTATGGAGCAGACGCAATCC	NM_010368.1
			R	ACAGCCTTCTGGTACTCCTCA
惠普	结合珠蛋白	96年	F	TATCGCTGCCGACAGTTCTAC	NM_017370.2
			R	CTCTCCAGCGACTGTGTTCA
Hprt1	次黄嘌呤	97年	F	CAGTACAGCCCCAAAATGGTTA	NM_013556.2
	Phosphoribosyltransferase		R	AGTCTGGCCTGTATCCAACA
Il18	白介素18	98年	F	CAAAGAAAGCCGCCTCAAAC	NM_008360.1
			R	GACGCAAGAGTCTTCTGACA
Il1a	白介素1α	103年	F	AGATGGCCAAAGTTCCTGAC	NM_010554.4
			R	AGAGATGGTCAATGGCAGAAC
临床上	乳糖酶	92年	F	TGTCCTAGCCTACAACCTCAAC	NM_001081078
			R	AGCGGTCTGTAATGGAAGCA
Muc2	粘蛋白2	93年	F	TATGCCAGGCCAGGAGTTTA	NM_023566.2
			R	GCAAGGCAGGTCTTTACACA
Nfkbia	核kappa系数α	96年	F	GAGCGAGGATGAGGAGAGCTA	NM_010907.2
			R	GGCCTCCAAACACACAGTCA
Rpl13a	核糖体蛋白L13A	103年	F	AGGTTACGGAAACAGGCAGAA	NM_009438。
			R	CAGGAGTCCGTTGGTCTTGA
南非航空公司	血清淀粉样蛋白一	102年	F	GAGTCTGGGCTGCTGAGAAA	NM_011314.2
			R	ATGGTGTCCTCGTGTCCTCT
真沸点	TATA盒结合蛋白	One hundred.	F	ACCAGAACAACAGCCTTCCA	NM_013684.3
			R	AAAGATGGGAATTCCAGGAGTCA
Tgfb1	转化生长因子β1	98年	F	GCTGCGCTTGCAGAGATTAA	NM_011577.1
			R	GTAACGCCAGGAATTGTTGCTA
Tlr4	toll样受体4	98年	F	GTTCTTCTCCTGCCTGACAC	NM_021297.2
			R	GCTGAGTTTCTGATCCATGCA
肿瘤坏死因子	肿瘤坏死因子	95年	F	CAAATGGCCTCCCTCTCATCA	NM_013693.2
			R	TGGGCTACAGGCTTGTCAC
Tnfsf15	肿瘤坏死因子	97年	F	GCAAGCCGAGAGCACAC	NM_177371.3
	总科,成员15		R	CCATCCCTAGGTCATGTTCCC

4.8。流式细胞术

从脾细胞被孤立,肠系膜淋巴结(MLN),派尔集合淋巴结补丁(PP)无菌挤压两个显微镜载玻片之间的PBS的新的器官,随后暂停穿过70μm细胞的过滤器。细胞悬浊液是存储在冰。脾细胞resuspended在红细胞裂解缓冲(0.15米NH (ACK)₄KHCO Cl, 10毫米₃1毫米EDTA味精pH值7.3)和孵化了六分钟。随后,细胞被洗和resuspended PBS。细胞表面染色树突细胞和t细胞标记和适当的同形像控制抗体。所有抗体(anti-mouse CD4、CD11c、CD11b CD103, FoxP3)买来eBioscience(美国圣地亚哥,CA)。监管的t细胞染色细胞随后固定,permeabilized,细胞内Foxp3染色根据制造商的协议。分析使用一个Accuri C6流式细胞分析仪(Accuri血细胞计数器Inc .,安阿伯市,美国)。

4.9。统计数据

常态分布的数据测量与Anderson-Darling正常测试考虑值小于0.05显著(一款统计软件、考文垂、英国)。统计分析进行OGTT曲线下的面积(AUC)使用Statistica(美国Statsoft,塔尔萨,哦)和统计学意义评价双向重复测量方差分析使用学生的事后分析t以及显著的效果。分析胰岛素、糖化血红蛋白、血浆细胞因子,有限合伙人,和主成分分析数据,GraphPad棱镜版本5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)和统计学意义评估使用单向方差分析(克鲁斯卡尔-沃利斯测试数据不认为高斯分布)和学生的t以及(Mann-Whitney测试数据不认为高斯分布)。值低于检测(胰岛素和细胞因子的测量工具)有一半的情人的价值量化的极限(1/2 LLOQ)。回肠的分析数据的表达分析,数据预处理、正常化,相对量化和统计进行使用GenEx5 (MultiD、Goteborg、瑞典)。数据日志₂改造前接近正态分布t以及(2-tailed,未配对)。基因表达被认为是如果明显不同值< 0.05和褶皱变化>±2.0。流式细胞仪数据的分析,方差分析紧随其后t应用以及群体之间的显著差异(一款统计软件)。

利益冲突

作者没有直接金融关系的任何商业身份在这篇文章中提到可能会导致利益冲突。

确认

这项研究作为一个唯一的一部分进行研究项目(食品、健康和医药卫生和疾病,http://www.foodfitnesspharma.ku.dk/)。唯一的程序支持的丹麦科学,技术和创新。Ida符文是LIFEPHARM(的一部分http://www.lifepharm.dk/)。Pernille Kihl,卡佳Bangsgaard Bendtsen,兰迪Lundberg Mette Nelander,海琳Farlov感谢技术援助。卡琳Tarp比与qPCR承认她优秀的帮助。化验部门在诺和诺德公司/ S (Maløv、丹麦)请感谢分析胰岛素样本。

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糖尿病研究期刊》的研究

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