HD0471953的体内功效：一种新型的GPR119激动剂治疗2型糖尿病

抽象的

G蛋白偶联受体119（GPR119）已成为治疗2型糖尿病的新目标。GPR119在胰腺B细胞和肠L细胞上的表达为单一药物促进胰岛素和GLP-1分泌提供了独特的机会。在这项研究中，我们根据其对T2DM鼠模型的抗血糖效应的能力，从我们的大型合成化合物库中鉴定出了一种新型的小分子GPR119激动剂HD0471953。我们已经通过正常的C57BL/6J小鼠测试了HD0471953 HD0471953的急性功效。然后，进行了HD0471953的长期管理，以评估各种糖尿病啮齿动物模型的功效。HD0471953的单个给药显示出具有正常小鼠OGTT剂量依赖性的血糖对照，并且胰岛素和GLP-1也增加了。为了鉴定慢性功效，我们观察到血糖和禁食胰岛素的下降，剂量依赖性10、20和50 mpkDB/DB老鼠。结果表明，用于治疗2型糖尿病患者的HD0471953可能是一种潜在有希望的抗血糖药。

1.简介

2型糖尿病（T2DM）的特征是慢性高血糖，这是由于胰岛素敏感性缺陷的结果[1，，，，2]。在T2DM患者中，葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）的耗竭是代表性的特征，可导致餐后高血糖症，尤其是在早期，[[3]。在T2DM的临床疗法中，可用的降血糖剂，​​例如二甲双胍，A-糖苷酶抑制剂，噻唑烷类（TZDS）和磺酸碱衍生物（SUS）。但是，这些化合物具有副作用，包括低血糖，体重增加和心血管问题[4]。GPR119激动剂目前因其作为抗糖尿病剂的治疗潜力以及适当的治疗方式而受到了重大关注，以安全地改善代谢疾病。GPR119的激活增加了胰高血糖素样肽-1（GLP-1）。GLP-1类似物通过胃肠道机制增加了葡萄糖依赖性胰岛素的分泌，GLP-1在胰腺B细胞中释放，肠内分泌L细胞活化的GPR119 [5]。模仿这些配体在正常和糖尿病小鼠中诱导GLP-1分泌和葡萄糖耐受性[6]。迄今为止，已经开发了许多GPR 119个激动剂[7]。

在这里，我们报告了新型小分子GPR119激动剂HD0471953的体内表征，该激动剂在现代药房中合成。我们特别比较了HD0471953的作用与二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂sitagliptin，这也增加了血流中的GLP-1水平[8]，在几种动物模型中的血糖控制和胰岛素分泌上。

2。材料和方法

2.1。化学物质和动物

HD0471953和西他列汀在使用测定之前在Hyundai Pharm Inc.中合成，HD0471953和Sitagliptin溶解在0.5％羧基 - 甲基纤维素中（CMC; CMC; Sigma-Aldrich，SIGMA-ALDRICH，SIGMA-ALDRICH，MO，MO，MO，USA）。

2.2。体外营地测量

在HIT-T15细胞（KCLB，汉城，大韩民国）系列中测量了通过测试药物增加的细胞质cAMP水平。用RPMI1640培养基（Gibco，Gaithersburg，MD，美国）培养细胞，其中含有10％的胎牛血清（FBS； Gibco）和1％的青霉素/链霉素溶液（Gibco），5％CO₂，在37°C。将细胞用测试培养基孵育10分钟，即hanks缓冲盐溶液（HBSS; Gibco），其中含有5 mm的4-（2-羟基乙基）-1-二帕皮嗪硫代磺酸（HEPES; GIBCO），0.5 mm的3--的3---3--的3--硫酸盐酸（Hepes; Gibco）。异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX； Sigma-Aldrich）和0.1％的牛血清白蛋白（BSA； Sigma-Aldrich），然后是5×10的细胞⁴ cells/well of 96-well plate before day 2, in 5% CO₂，在37°C。然后，用10、2、0.4、0.08、0.016和0.0032处理测试培养基中的测试药物 μM到细胞分别为90分钟。用均质的时间分辨荧光（HTRF； Cisbio，中国上海）对细胞质cAMP AFTE1R药物治疗的测量。所有实验均重复进行。

2.3。动物

所有涉及动物的程序均由现代制药公司的动物伦理委员会批准。所有动物在自由喂养条件，温度和湿度控制的房间中单独安置在12小时/12小时的光/黑暗周期下。正常的C56BL/6J雄性小鼠和DB/DB小鼠分别从Nara Biio Inc.（大韩民国首尔）和韩国生物科学与生物技术研究所（Kirbb; Kirbb; Ochang，Refucerne）获得。

2.4。体内实验

2.4.1。口服葡萄糖耐量测试（OGTT），胰岛素和GLP-1测量

通过口服葡萄糖耐量测试（OGTT）测试了测试药物的急性药理功效。将八周龄的雄性C57BL/6小鼠禁食过夜，然后口服0.5％CMC（媒介物）或20个，100 mg/kg HD0471953至10 mL/kg。30分钟后，以2 g/kg/10 mL的剂量口服葡萄糖，并收集血液样本。然后，通过在-30、0、0、20、40、60和120分钟后通过尾巴剪断尾巴来监测血糖水平。血浆葡萄糖和胰岛素水平立即使用Accu-Chek活性血糖计（Roche，瑞士）确定。

为了测量通过测试药物改善胰岛素和活性GLP-1分泌能力，用过夜染的小鼠进行了单独的实验。在30分钟后进行测试药物后，加载葡萄糖注并在20分钟后获得血浆样品。用胰岛素和活性GLP-1酶联免疫吸附测定法（ELISA； MILLIPORE，MO，MO，美国）分析分离的血浆。

2.4.2。重复给药的功效

慢性功效的研究是通过DB/DB老鼠。所有动物均已授予媒介物或测试药物出价和锡塔列汀QD给药。

车辆组的管理为0.5％CMC（车辆，）和测试组的10、20和50 mg/kg HD0471953（）至10毫升/千克。在治疗期间，检查了每只动物的休闲葡萄糖水平和体重。在开始管理后的4周时，用管理小鼠对血浆和OGTT进行过夜的胰岛素水平进行测量。从腹动脉采样血液，立即去除并测量脂肪FAD的重量。将血液样品在2000 g处离心10分钟以获得血清并储存在-20°C下。胆固醇和脂蛋白谱通过自动分析仪（瑞士Roche Cobas）分析。

2.5。统计分析

值表示为平均标准偏差（SD）。学生t检验用于比较两组，并使用Dunnett的多重比较测试进行单向方差分析进行了多个组比较。使用“ GraphPad Prism 5”软件（GraphPad Co.，La Jolla，CA，美国）和A进行统计分析<0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。GPR119激动剂增加营地水平

众所周知，GPR119的信号传导是通过提高cAMP合成而触发的[9]。因此，我们已经测试了HD0471953是否在仓鼠，HIT-T15细胞的胰腺β细胞系上提高了细胞内营地水平。在此测试中，HD0470471953显示出剂量依赖性的细胞内营地水平（图1）。在0.4 nm处的阴性对照中，细胞内cAMP水平约为1.5倍，在10 nm处理HD0471953时显示出2.5倍。

3.2。HD0471953对正常小鼠单一治疗后葡萄糖耐量的影响

我们通过检查正常小鼠OGTT期间的血糖，血浆胰岛素水平和GLP-1分泌，评估了HD0471953在体内胰岛素分泌急性调节中的作用。

我们还通过单一的药物给药，通过OGTT测试了改善血糖控制。西他列汀改善了正常小鼠的血糖控制，施用HD0471953，具有20 mg/kg的HD0471953，改善了血糖控制，以及葡萄糖负荷后20分钟的葡萄糖水平降低（图）2（a））。与媒介物组相比2（b））。

我们还测试了HD0471953提高营地水平是否增加胰岛素或GLP-1分泌。隔夜固定的普通C57BL/6J小鼠被给药20，100 mg/kg剂量（在图中“ A”2（c））HD0471953在30分钟的葡萄糖载荷之前（图中的“ B”2（c）），然后在20分钟后的葡萄糖载荷后通过ELISA分析胰岛素和GLP-1水平。DPP-4抑制剂西他列汀显示血浆GLP-1水平的升高（图2（c），，，，相对于车辆组）和GLP-1水平的提高可能会导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌改善（图2（d），，，，与车辆组）。在HD0471953的100 mg/kg剂量下，血浆GLP-1水平显着增加（图2（d），，，，与车辆组）；此外，血浆胰岛素水平在20和100 mg/kg剂量时也显着增加（图2（c），，，，与车辆组）。

3.3。HD0471953在糖尿病中使用慢性治疗的影响DB/DB老鼠

评估HD0471953（6周龄）糖尿病的慢性治疗的影响DB/DB每天用10、20和50 mg/kg HD0471953或车辆对小鼠进行两次治疗4周。治疗期后，检查了血浆葡萄糖空腹胰岛素水平，初始体重和最终体重。尸检后，血浆高密度脂蛋白（HDL）低密度脂蛋白（LDL）胆固醇，血浆甘油三酸酯（TG），附睾脂肪和腹股沟脂肪称重。HD0471953的给药以剂量依赖性方式降低了空腹葡萄糖水平（图3（a））。在药物给药4周内进行口服葡萄糖耐量测试（OGTT），HD0471953治疗组显示出比车辆组低的血糖水平，而OGTT的AUC值在车辆组中显示出较低的丰度（图）3（b））。此外，给药20和50 mg/kg HD0471953的组显示，治疗后28天的体重降低（图3（b））。与媒介物相比3（e）-3（h）），但没有意义。初始体重和最终体重略有变化（图3（g））。DPP-4抑制剂西他列汀治疗导致血浆胰岛素水平升高，表明葡萄糖刺激的胰岛素分泌得到了改善。西他列汀或20 mg/kg HD0471953治疗组的胰岛素水平显着较低（图3（h））。附子脂肪没有变化，但是腹股沟脂肪以剂量依赖性的方式降低（表1）。

4。讨论

可以使用各种治疗策略来改善1型或2型糖尿病患者的葡萄糖稳态。尽管磺酰脲衍生的抗糖尿病药物表现出强烈的血糖降低作用，但严重的低血糖被认为是主要问题[10，，，，11]。TZD和其他过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）活化剂也是T2DM的流行治疗策略。但是，这些药物具有不良影响，例如体重增加，冠心病和心脏病发作[12]。因此，需要针对新分子靶标的药物发现研究来克服这些障碍。

与T2DM的其他药物相比，基于肠血素激素治疗的优势不仅预期了血糖控制的改善，而且还会减少体重[13]。在啮齿动物肥胖模型中，长期作用GLP-1类似物的Exendin-4的慢性治疗可提高胰岛素敏感性和体重的损失[14]。不幸的是，所有基于泌尿蛋白酶激素的药物都不会导致体重减轻。尽管据报道有选择性DPP-4抑制剂对提高胰岛素敏感性和血糖控制具有很强的影响，但一些报道说，西格​​列汀不会降低肥胖受试者的体重[15，，，，16]。此外，选择性DPP-4抑制剂具有与免疫系统有关的不良反应，例如类风湿关节炎和胰腺炎[17-19]。

GPR119在胰腺β细胞和肠道L细胞上表达。它的作用机理始于增加细胞内营地的水平，该途径层流于β或L细胞中的胰岛素或GLP-1分泌[20，，，，21]。HD0471953对HIT-T15β细胞系的处理可导致cAMP水平升高，依赖性剂量依赖性。HD0471953的急性给药也增加了正常C57BL/6J小鼠的GLP-1和胰岛素分泌，这与T2DM动物模型中的胰岛素敏感性和血糖控制的改善有关[17]。这些数据表明HD0471953可能会激活GPR119，该GPR119调节正常小鼠中的胰岛素和GLP-1分泌。

HD0471953的长期给药DB/DB小鼠是一种重组基因诱导的肥胖T2DM模型，只要持续治疗，小鼠就会改善血糖控制，这表明HD0471953可以改善胰岛素敏感性和血糖控制。此外，用HD0471953治疗的小鼠显示体重的轻微损失，尽管DPP-4抑制剂在几项研究中尚未显示出对体重的影响[15，，，，16]。与媒介物处理的小鼠相比，在28天后重复给药HD0471953导致葡萄糖水平较低。与媒介物处理组相比，在给药后4周接受HD0471953治疗组的OGTT的葡萄糖耐受性提高了。这些数据表明HD0471953改善了胰岛素敏感性和血糖控制DB/DB老鼠。GLP-1激动剂会产生体重减轻，而DPP-4抑制剂似乎具有体重中性作用[22]。基于GLP-1机理的葡萄糖降低效果显示HD0471953，GPR 119激动剂的脂质谱。与车辆组相比，HDL LDL胆固醇和TG表现出改善，但略有改善。附子脂肪水平表现出略有变化，但腹股沟脂肪以剂量依赖性方式降低。这种影响很小，但仍然具有潜力。

在这项研究中，肥胖诱导的T2DM小鼠接受了我们新型GPR119激动剂HD0471953的长期给药，显示出没有严重低血糖的胰岛素敏感性和血糖控制的提高。此外，与阴性对照小鼠相比，观察到较低的体重。总之，我们发现并确定了一种新型的GPR119激动剂HD0471953，进一步的研究将描述GPR119的生物学功能以及临床试验的可能性。

作者的贡献

因此，Ra Kim和Dae-hoon Kim也同样贡献。

致谢

这项研究得到了韩国知识和经济部的“预先技术中心（ATC；项目许可：10042208）的授予”的支持。

参考

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