文摘

内皮损伤引起的炎症因素在心血管疾病的发病机制中起着至关重要的作用。内皮细胞(EC)细胞凋亡、增殖、迁移和细胞粘附分子(CAM)表达导致动脉粥样硬化的发展。我们研究了白藜芦醇的影响(0.1 -100μ米)的增殖、迁移和凸轮的表达的主要文化狒狒动脉内皮细胞(BAECs)。此外,我们测试了它在正常情况下的影响以及在炎症条件下诱导肿瘤坏死因子- (肿瘤坏死因子- )管理通过cotreatment、预处理或后处理。免疫细胞化学、MTT、愈合,流式细胞术分析。白藜芦醇治疗显著增强BAEC扩散和衰减TNF - 全身扩散的障碍的最佳剂量1-50µM。在高剂量白藜芦醇(100μ米)和肿瘤坏死因子- 受损BAEC迁移,而低剂量的白藜芦醇(1-50μ米)减毒TNF - 全身BAEC迁移的障碍。此外,白藜芦醇抑制TNF - 全身ICAM-1和VCAM-1表达式。综上所述,我们的研究结果表明,白藜芦醇保护BAECs炎症刺激后在低浓度以及改善炎症的影响。因此,白藜芦醇应该考虑的候选药物预防和治疗炎症性血管疾病。

1。介绍

内皮细胞(EC)细胞毒性引起的炎症因素在心血管疾病的发病机制中扮演着重要角色。肿瘤坏死因子(TNF) 、多向性的促炎细胞因子参与炎症的发病机制,和血管疾病,能促进内皮细胞凋亡和炎症(1)通过直接激活的细胞物途径包括核factor-kappa (NF - B B)和增殖蛋白激酶(MAPK) [2]。这些随后导致内皮细胞损伤和细胞功能障碍(3]。因此,抑制肿瘤坏死因子- 全身的内皮细胞细胞毒性可能是重要的在预防心血管疾病和抑制其发展。

白藜芦醇具有许多药理属性包括抗癌(4,抗炎5),和心血管效应6]。直接施加的白藜芦醇心血管保护作用通过改善心肌灌注,减少氧化剂的压力,和抑制血小板聚集7- - - - - -9]。最近的研究表明,白藜芦醇行为部分通过抑制细胞凋亡和炎症抑制NF - B通路(10,11]。白藜芦醇的有利影响表明,它可能是一个重要的目标治疗心血管疾病的药物。然而,白藜芦醇特异性(12,13]和[存在剂量依赖的相关性14)对细胞增殖或凋亡的影响。各种浓度的白藜芦醇的研究管理统一的人口ECs的缺乏。这些研究需要理解不同,有时相互矛盾的白藜芦醇(细胞的影响15]。先前的研究表明,白藜芦醇有两相的性质与它的浓度在EC扩散,在低浓度(0.1 -25没有影响 米)和诱导细胞凋亡在高剂量(如100 米)在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs) [16]。

人体生物医学研究狒狒是一个良好的模型包括心血管疾病(17,18]。在目前的研究中,我们调查了各种浓度的白藜芦醇对动脉内皮细胞培养主要狒狒(BAECs)在正常情况下,以及在TNF - 全身的炎症细胞接受cotreatment条件,与白藜芦醇预处理或后处理。

2。方法

2.1。材料

除非另有指示,所有在本研究中使用的试剂及其来源如下:白藜芦醇,3 - (4 5-dimethyl-2-thiazoyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)(σ,圣路易斯,密苏里州);anti-CD62E (E-selectin)(研发系统,明尼阿波利斯,克隆BB1G-E5);anti-CD54(细胞间粘附molecule-1) (BD生物科学,圣何塞,CA,克隆HA58);anti-CD106(血管细胞粘附molecule-1)(我们生物,Swampscott,妈,克隆5 k26t);细胞培养基和物资(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。

2.2。BAEC隔离和文化

BAECs分离从狒狒股动脉如前所述17]。,2 - 3厘米段下的股动脉获得无菌手术由经验丰富的兽医;程序批准的机构德克萨斯动物保健和使用委员会生物医学研究所。动脉是孵化0.1%胶原酶在37°C 15分钟消化细胞外组织允许细胞的释放。释放细胞立即清洗和播种1.0% gelatin-coated文化板块。主要BAECs F-12K培养基上培养补充20%胎牛血清(FCS)。通道3和4的BAECs被用于这项研究。BAECs服用白藜芦醇在不同浓度的存在与否,TNF - (10 ng / mL)不同时期。

2.3。免疫细胞化学

主要BAECs被播种到Lab-Tek多井室幻灯片(BD猎鹰8-well文化幻灯片)18与200年),固定 L 4%甲醛在室温下(RT) 10分钟,然后用10%的山羊血清阻塞30分钟与300 RT,细胞培养 L(1: 400或1:800稀释主要抗体(vWF:σ,圣路易斯,密苏里州;VE-Cadherin:细胞信号技术,丹弗斯,MA)在1% BSA在磷酸缓冲盐(PBS)一夜之间在4°C,然后FITC-labelled二级抗体在1% BSA在PBS 1 h RT在黑暗中。DAPI (0.5 g / mL)添加了5分钟,装有10和幻灯片 信用证不变色的解决方案(表达载体,没有。S36936) 1×PBS。幻灯片被荧光显微镜观察。

2.4。MTT试验

细胞被播种在96 -孔板的密度1000个细胞/在2% FCS F-12K生长介质24 h和白藜芦醇处理在指定的浓度(0.1 -100 mol / L)在肿瘤坏死因子的存在与否 (10 ng / mL)不同时期。治疗细胞孵化20 L(1毫克/毫升)MTT 4 h在37°C形成甲瓒晶体与新陈代谢活跃的细胞反应。随后,甲瓒晶体与150可溶性 L DMSO溶液。吸光度的测定在使用标A570海里。细胞是由吸光度测量的可行性,规范化的细胞数量,孵化控制介质(被认为是100%),然后决定相对于控制。

2.5。愈合试验

近汇合的单层细胞是“受伤”在一个十字形的无菌200模式 L吸管小费。媒介和脱落细胞吸气,盘子被内皮细胞生长中补充(ECGM)没有FCS,作为控制或介质含有白藜芦醇(0.1 -100 米)有或没有TNF - (10 ng / mL)。伤口愈合的图像在15 h一样挠地区被抓获本地化右边的十字形抓一个40 x客观(奥林巴斯IX70显微镜)和量化通过测量伤口面积与Image-Pro +软件6.0。每口井的三个字段进行评估,所有实验一式四份。结果报告为伤口愈合的比例使用方程:伤口愈合% =[1−(伤口区域T15 h /伤口面积在T0 h)]×100年在T0 h是受伤后的时间。

2.6。流式细胞术

比例的细胞特定的细胞粘附分子的表达被量化标准免疫荧光细胞分选技术(19,20.]。以下抗体被用于这项研究:反CD62E(克隆BBIG-E5),反CD54(克隆HA58)和反CD106(克隆5 k267)。无污点的和同形像控制被用来确定背景染色。流式细胞术分析使用青色ADP(加利福尼亚州圣何塞,正欲)。盖茨在各自的平均荧光强度(MFI)值被用来代表抗原表达。所有实验进行了三次,每次一式三份。

2.7。统计分析

所有定量变量表示为手段 扫描电镜从至少三个独立的实验。对比组用单向方差分析Dunnett事后测试紧随其后。评价两组的差别,我们使用双尾学生的 以及。 被认为是具有统计学意义。SPSS 17.0版(SPSS Inc .,芝加哥,IL)是用于统计分析。

3所示。结果

3.1。主要BAEC文化和识别

主要狒狒动脉有典型的鹅卵石形状(数字1(一)和1 (b)),3 - 7天到达融合取决于细胞播种密度和数量的段落。BAECs保持增殖能力30人口或10通道,与稳定的细胞粘附分子的表达。在使用它们之前,我们与内皮染色BAECs特定标记VE-cadherin(图1 (c))和vWF(图1 (d)),以确保细胞的纯度和健康状况。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图1
形态学基本狒狒ECs培养在7天3 (a)和(b)。孤立狒狒股动脉ECs显示一个典型的中块石形状(放大×40)。与特定的内皮细胞被染色的细胞表面标记VE-cadherin (c)和vWF (d)(放大×100)。与抗体免疫荧光染色的狒狒ECs VE-cadherin和血管性血友病因子进行了使用一个FITC-labelled二级抗体。DAPI染色细胞核。图像是用一个Eclipse E800显微镜。
3.2。白藜芦醇增强BAEC核扩散和变弱TNF - 全身的障碍

我们首先测试了不同浓度的白藜芦醇的影响(0.1 -100 米)的成长主要BAECs(图2(一个)),白藜芦醇在多大程度上影响BAEC扩散TNF -受损 当管理cotreatment(图2 (b)),预处理(图2 (c)),或治疗后(图2 (d))。白藜芦醇(0.1 -100 米)高度显著增强EC扩散后24小时孵化的最佳射程10 - 50 米( , )(图2(一个))。肿瘤坏死因子- 治疗(10 ng / mL)仅24小时显著下降( (图)相比BAEC扩散控制2 (b))。然而,cotreatment 1-50白藜芦醇 M减轻细胞毒性引起的肿瘤坏死因子- ( )。未发现影响1或100年 M,表明存在剂量依赖的相关性白藜芦醇对狒狒ECs受到炎症的影响条件。与白藜芦醇预处理(0.1 -100 米)(图2 (c))24小时也减毒损伤BAEC扩散引起的孵化与TNF - 4 h ( ),特别是1-50的剂量 米( )。此外,治疗后与白藜芦醇(0.1 -100 米)(图2 (d))24小时减毒TNF - BAEC扩散全身损伤,10的最佳剂量 米( , )。在一起,数据表明,白藜芦醇可以加强初级狒狒EC扩散,可以防止细胞毒性引起的肿瘤坏死因子- 。

(一)RSV治疗
(一)RSV治疗
(b) RSV / TNF cotreatment
(b) RSV / TNF cotreatment
(c) RSV预处理
(c) RSV预处理
(d) RSV后处理
(d) RSV后处理
图2
白藜芦醇对BAEC扩散的影响有或没有TNF - 24 h。白藜芦醇(0.1 -100 米)高度显著增强EC扩散后24小时孵化的最佳射程10 - 50 M (a), TNF - (10 ng / mL)抑制内皮细胞增殖,而cotreatment白藜芦醇(1-50 抑制肿瘤坏死因子- M)逆转 (b)。BAECs用白藜芦醇预处理了24小时然后用TNF -治疗 4 h;与白藜芦醇预处理改善TNF - 全身的抑制(c)。BAECs治疗与肿瘤坏死因子- 4 h与白藜芦醇然后孵化24小时;治疗后与白藜芦醇改善TNF - 全身的抑制(d)。数据表示为基底的百分比值(100%)和均值 扫描电镜从七个独立的实验,每一式五份进行。* ,* * 与控制和& ;和& & 与肿瘤坏死因子- 一个人。
3.3。白藜芦醇减毒BAEC迁移TNF -受损

我们调查了白藜芦醇是否可能影响BAEC迁移有或没有TNF - 治疗。如图3(一个)白藜芦醇在低浓度(10 M; )增加受伤BAEC迁移与控制相比,但是,在高浓度(100 M; ),它降低了BAEC迁移在15 h。没有观察到浓度效应为0.1,1,50 m .如图3 (b)肿瘤坏死因子- ( 15岁)大大受损BAEC迁移h与控制相比,而白藜芦醇(1-50 肿瘤坏死因子- M)的存在 显著增加BAEC迁移率与TNF -相比 单独处理( )。没有100的保护作用 观察白藜芦醇。

(一)
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(b)
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图3
白藜芦醇对狒狒内皮细胞迁移的影响有或没有TNF - (10 ng / mL) 15 h。10 M白藜芦醇显著增加BAEC迁移,和100年 M白藜芦醇显著降低BAEC迁移(a)。TNF - 政府(b)减少BAEC迁移与控制相比。白藜芦醇(1-50 米)减毒损伤BAEC迁移的TNF - 当在孵化15 h (b)。数据的意思 扫描电镜从五个独立实验;每一式三份。* ;和* * 与控制,& ;和& & 与肿瘤坏死因子- 一个人。
3.4。白藜芦醇抑制肿瘤坏死因子- 全身的表达VCAM-1 (CD106)和ICAM-1 BAECs (CD54)

探讨白藜芦醇是否影响诱导细胞粘附分子的表达水平E-selectin (CD62E) ICAM-1 (CD54)和VCAM-1 (CD106) BAECs被流式细胞术分析。BAECs cotreated(数字4(一)和4 (b)),进行预处理(图4 (c)),或posttreated(图4 (d))与白藜芦醇(10、50 米)和肿瘤坏死因子- 。E-selectin、ICAM-1 VCAM-1表情BAECs被TNF -显著增加 (10 ng / mL)刺激4 h与控件(相比之下 ,图4(一))。ICAM-1 VCAM-1,但不是E-selectin,仍然升高后24小时( ,图4 (b))。白藜芦醇cotreatment没有抑制高程引起肿瘤坏死因子-凸轮表达式 4 h(图4(一)),但ICAM-1的表达和VCAM-1显著减少BAECs治疗24 h和白藜芦醇(10、50 米)和肿瘤坏死因子- (10 ng / mL)与肿瘤坏死因子- - -相比之下 单独治疗(10 ng / mL, ,图4 (b))。白藜芦醇预处理(10、50 米)24 h(图4 (c))抑制ICAM-1高程和诱导肿瘤坏死因子- VCAM-1表达式 刺激( )。BAECs TNF -处理 4 h,然后孵化与白藜芦醇(10、50 M,治疗后24 h(图)4 (d))表现出显著的减毒ICAM-1 (50 50 M)和VCAM-1 (10 米)表达与控制( , )。

(一)
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(b)
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(c)
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图4
白藜芦醇抑制诱导肿瘤坏死因子-凸轮表达式 (10 ng / mL)。肿瘤坏死因子- 大大刺激ICAM (CD54)和VCAM (CD106)表达式后4 H (a)和24 H (b)治疗和显著增加E-selectin 4 H后(CD62e)表达式。白藜芦醇(RSV) (10、50 米)抑制表达ICAM和VCAM激活与肿瘤坏死因子- BAECs刺激 (10 ng / mL) 24小时期间cotreatment (b),白藜芦醇(10、50 M)进行预处理(c)也显著地抑制ICAM的表达VCAM激活TNF - ,显著减毒持续ICAM和VCAM表达肿瘤坏死因子刺激后后处理(d)。数据的意思 扫描电镜从三个独立的实验每进行一式三份。* ;和* * 与控制和& ;和& & 与肿瘤坏死因子- 一个人。

4所示。讨论

最近,白藜芦醇已经得到了相当大的关注,因为其抗癌(4,抗炎5)、糖尿病(21],和心血管保护作用[6]。这些属性已报告在研究中使用的实验老鼠,老鼠和猪模型(8,22),但不是灵长类动物模型。此外,白藜芦醇对人体的影响受到他们的血管起源23]。

在这项研究中,我们调查了白藜芦醇的影响主要狒狒股动脉作为在体外灵长类动物模型。这种模型的优点如下。首先,它更容易获得初级macrovascular ECs狒狒和人类相比。第二,狒狒表现出高度的遗传、生化、生理、解剖人类相似,更像是人类与其他物种相比,在血管疾病的病理18]。第三,我们首选BAECs因为他们是TNF -反应过度 与静脉ECs相比,他们可能发挥关键作用在macrovascular疾病在不利条件下(24]。第四,BAECs有类似反应人类主动脉内皮细胞(HAECs)当刺激与TNF - 从而为翻译提供一个有效的模型治疗人体临床试验(25]。BAECs可以使用在疾病的早期阶段可能密切模仿ECs的炎症反应在活的有机体内。我们已经建立了一个协议主要BAEC文化和先前执行的基本调查他们的形态和功能20.,26]。此外,Mikula-Pietrasik等人最近表明,白藜芦醇及其衍生物有特异性的影响,经有不同影响人类从不同来源的扩散15]。因此,我们选择BAECs作为模型在体外研究的序幕在活的有机体内研究。

ECs的扩散和迁移可能起到至关重要的作用在血管自我修复正常生理以及病理条件。EC单层完整性得到维护通过邻近细胞的增殖和迁移。我们首先研究了不同的实验设置验证白藜芦醇对BAEC扩散的影响在正常和炎症条件。白藜芦醇具有高度显著增强BAEC扩散在10 - 100的最佳浓度 米,减毒细胞损伤引起的肿瘤坏死因子- 治疗当管理细胞cotreatment,预处理或后处理。数据有关白藜芦醇对电子商务发展的影响并没有完全一致的。先前的研究表明,白藜芦醇诱导增加随着浓度的细胞凋亡水平(25 - 100 米)和凋亡在100 M乳沟的半胱天冬酶3 (16,27),而低剂量(0.1 -25 米)没有影响。Csiszar等人证明了10 M白藜芦醇阻止EC香烟烟雾提取物(诱导细胞凋亡28]。我们的研究结果部分与之前的研究一致。此外,Ungvari等人,布里托等人表明,白藜芦醇的浓度范围1 - 100 米减毒细胞凋亡介导的氧化应激(TNF - 、氧化低密度脂蛋白和过氧亚硝基)[29日,30.]。对EC凋亡,白藜芦醇的影响取决于浓度以及细胞来源。我们的研究表明,白藜芦醇是有利于保护BAECs受到炎症刺激以及防止在低浓度时细胞损伤。

的翻译在体外和在活的有机体内从实验中发现的动物和人类被认为很大程度上取决于父母白藜芦醇血浆浓度和生物利用度。最大的等离子体浓度的白藜芦醇已报告2.36 M×Boocock et al。31日)和4.2 M×布朗et al。32]5 g transresveratrol管理时给人类。然而,下面的生理血浆水平无法察觉或通常采用的微摩尔的浓度在体外( 32 nm - 100 米)与人类细胞的研究。然而,组织中白藜芦醇的水平可能高于建议基于等离子体水平因为白藜芦醇是亲脂性的。此外,白藜芦醇显示效果在非常低的浓度(33在研究人类疾病的动物模型和大大相反的效果取决于剂量(34]。我们目前的研究调查了低浓度的白藜芦醇的保护作用在狒狒ECs。额外的实验与狒狒需要确定在体外白藜芦醇对炎症反应的影响在活的有机体内效果可以通过口服摄入的白藜芦醇和口服摄入是否护心。

EC迁移是一个重要的过程各种血管功能,比如肿瘤生长、血管重塑和血管伤口愈合。我们的研究结果表明,白藜芦醇在低浓度改善损伤BAEC迁移引起的肿瘤坏死因子- -50 (0.1 米)。我们发现,低浓度的白藜芦醇对BAEC迁移没有抑制作用。然而,高浓度(100 米)的白藜芦醇减少BAEC迁移。在et al。27)表明,白藜芦醇抑制内皮细胞迁移的剂量范围10 - 100 人类和牛脑M EC因为其抗血管特性。我们的研究结果还表明,低剂量的白藜芦醇减毒BAEC迁移的障碍引起的炎症条件,表明其抗炎作用的机制。Cicha et al。35)发现白藜芦醇剂量依赖性抑制EC迁移在1 - 20 mol / L Rho-associated-kinase——(岩石)依赖的方式。白藜芦醇促进增殖和迁移的脑激活磷酸肌醇3激酶/ Akt (PI3-K)和增殖蛋白激酶(MAPK) / ERK信号通路(36]。然而,最近的一项研究还显示,从橄榄油和红酒多酚减少炎症EC迁移培养通过MMP-9和cox - 2抑制(37]。我们表明,白藜芦醇保护BAEC从炎症条件下的迁移。然而,细胞特定的反应和分子机制需要进一步调查完全解决矛盾的观察白藜芦醇对EC迁移的影响。

炎症upregulation定义部分的细胞表面粘附分子对细胞因子的反应。粘附分子表达的分子基础是leukocyte-endothelium交互和炎症反应的一个重要特征,这是动脉粥样化形成的关键(30.]。我们调查了监管的粘附分子和不使用TNF -白藜芦醇 在BAECs。我们第一次证明白藜芦醇抑制TNF - 全身的表达ICAM-1和VCAM-1 TNF -后长期孵化 刺激,以及预处理和cotreatment。没有抑制白藜芦醇对凸轮表达的影响在短期内孵化,这特点可能导致其时间抑制NF - B (10]。E-selectin,最早的粘附分子调节白细胞招聘期间,四健会刺激后明显增加。我们没有观察到显著的抑制白藜芦醇对的表达的影响 -selectin,这可能是限制其长期孵化。

白藜芦醇降低TNF - 全身ICAM-1 VCAM-1表达式,可保护细胞免受TNF - 全身的细胞毒性。然而,白藜芦醇的潜在的分子机制发挥其生理效应需要进一步调查。在一起,我们的研究结果表明白藜芦醇的力量来保护主要在文化和ECs表明,白藜芦醇可能提供另一种治疗心血管疾病的预防和治疗。临床前试验和狒狒计划评估白藜芦醇的保护作用。

5。结论

总之,我们的数据表明,白藜芦醇可能防止狒狒ECs TNF -引起的细胞毒性 。白藜芦醇可以提供药理方法抑制炎症条件下损伤和减少心血管疾病和糖尿病的风险。

确认

这项研究是由美国国立卫生研究院拨款P01 HL028972;山东省自然科学基金(2010 ghz20201 ZR2012HM014, 2012 gge27126);医疗卫生科技发展基金会的山东(2011 hd005);国家科技支撑计划(2009 bai80b04);中国国家自然科学基金(81100617)。它使用资源支持的国家西南灵长类动物研究中心工作,格兰特多样OD011133研究办公室的基础设施项目(ORIPs)。