文摘

Endomorphins (EMs)有一个非常重要的bridge-function心血管、内分泌系统和神经系统。本研究旨在调查EMs的影响引起的血管活性的物质的合成和分泌晚期糖化结束产品主要培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。首先,HUVECs与AGEs-bovine刺激血清白蛋白(AGEs-BSA),牛血清白蛋白(BSA),分别或一起AGEs-BSA和EMs。然后,HUVEC存活率被MTT试验计算,水平不,内皮一氧化氮合酶(以挪士)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)是由比色分析发现,和endothelin-1的内容(ET-1)被ELISA检测。以挪士的mRNA水平和ET-1通过rt - pcr检测。p38的表达增殖蛋白激酶(p38 MAPK)检测到免疫荧光测定。结果表明,以挪士的mRNA表达和分泌显著增强与EMs相比那些AGEs-BSA孵化后,虽然没有的分泌和进气阀打开,mRNA表达和分泌ET-1有相反的变化。的荧光强度相比,核后降低预处理EMs p38MAPK与AGEs-BSA孵化。结论。目前的研究表明,EMs在HUVEC AGEs-BSA-induced损伤有一定的保护作用。

1。介绍

大量证据证明的形成和积累先进的糖化终端产品(年龄)的进展正常衰老过程和速度加速糖尿病(1,2];增加稳态水平的高活性dicarbonylic化合物可能导致的形成年龄,而代年龄的增加可以部分解释non-enzymatic糖基化蛋白的过程。这些蛋白质似乎有助于不同的细胞功能等的具体识别和退化AGEs-modified蛋白(3]。AGE-binding蛋白质几件物品已经被确认,到目前为止,包括AGE-R1 AGE-R2, AGE-R3,愤怒,和巨噬细胞清道夫受体I型和II型。在内皮细胞、年龄施加负面影响线粒体功能,提高生产的活性氧(ROS),从而增加氧化应激导致细胞功能障碍,甚至细胞死亡。年龄也会增加细胞内活性氧的形成,不,和一氧化氮合酶(NOS)和刺激神经酰胺以及MAPK级联激活不同的目标包括转录因子通过中间分子如NF -κB (4- - - - - -6]。因此防止内皮细胞AGE-triggered受伤可能会改善糖尿病危害血管并发症。

内源性阿片肽,endomorphin 1 (Tyr1-Pro2-Trp3-Phe4-NH2 EM1)和endomorphin 2 (Tyr1-Pro2-Phe3-Phe4-NH2 EM2反应堆),在1997年发现的冠军et al .,有较高的亲和力和更有选择性μ比其他阿片类物质鸦片受体(7]。许多研究表明,内源性阿片系统在心血管系统的调节角色在不同的物种(8,9),如兔子(10),大鼠(11,12),和老鼠13]此外,贾菲et al。14)报道,血管舒张反应endomorphin 1是由一个氮oxide-dependent机制和可能充当endothelium-dependent血管舒张剂在老鼠。然而,EMs的精确分子机制抑制AGE-induced损伤内皮细胞尚未彻底阐明。本研究的目的是调查EMs的抑制效果和涉及机制在年龄induced-oxidative压力和人类脐静脉内皮细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。试剂

由上海Hanhong Endomorphins合成化工有限公司有限公司(上海,中国)。胎牛血清(的边后卫)是来自杭州四季青生物工程材料(杭州)。没有和内皮一氧化氮合酶(以挪士)分析工具从剪成生物工程研究所(中国南京)。兔子反P38 (H174)抗体,FITC-conjugated山羊anti-rabbit抗体从Bioworld技术获得,Inc .(明尼阿波利斯,美国)。BSA购买从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。引物,聚合酶核苷酸,Rnasin豆类所提供的生物公司(志贺大津,日本)。

2.2。制备的年龄

AGEs-BSA由孵化10毫克/毫升BSA在150毫米100毫米葡萄糖磷酸盐(PBS), pH值为7.4在37°C 6周(15]。控制BSA孵化在相同条件下葡萄糖。游离糖被离心过滤Centricon过滤筒。AGEs-BSA被荧光分光光度计确定。

2.3。细胞培养和治疗

在这项研究之前,我们招募了母亲同意,并书面同意脐带产后贡献10厘米,和孤立的根据先前报道的方法16与一些细微的修改。培养细胞被他们认定为内皮形态和血管性血友病因子的存在。短暂,细胞生长与10%胎牛血清的DMEM补充,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100毫克/毫升)。文化是维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。培养基是每两天更新。实验,细胞治疗endomorphins (10μM, 1μ0.1米,μ米,或10海里)暴露在这些物质2 h与AGEs-BSA治疗之前。

2.4。细胞生存能力分析

细胞被孵化的密度在96 -孔板5×103细胞有200μL培养基/。根据上述细胞孵化集团后,30μL介质含5毫克/毫升MTT(美国σ)被添加到每个。4 h后潜伏期,100年μL 10% SDS补充道。然后,一夜之间在黑暗中孵化后,肝癌和溶解晶体被量化。光学密度得到使用测试波长570纳米。

2.5。化学发光分析的

一氧化氮(NO)的水平导数亚硝酸盐测定的条件培养基HUVEC的格里斯反应(17]。根据上述分组后细胞被孵化,100μL文化解决方案的收集和放入对应的另一个盘子,然后由格里斯没有生产细胞测量方法,根据指示没有化验设备。光密度是在540纳米微型板块读者阅读。每个实验进行了一式三份。

2.6。确定以挪士和伊诺活动

根据上述分组后细胞被孵化,200μL文化解决方案的收集和放入对应的另一个盘子,然后以挪士和伊诺表达在细胞被测量按照指示的NOS测定装备。光密度是在530纳米微型板块读者阅读。每个实验进行了一式三份。

2.7。ELISA分析Endothelin-1

特定的夹心酶联免疫吸附(ELISA)采用单克隆抗体被用来确定ET-1的水平;ELISA执行根据的指示ET-1酶联免疫试剂盒由广告Litteram诊断实验室(美国)。光密度是在450纳米微型板块读者阅读。每个实验进行了一式三份。

2.8。实时rt - pcr分析以挪士和ET-1 mRNA水平

孵化后,细胞被洗两次与PBS和总信使rna提取试剂盒。此后,reverse-transcripted在以下条件下:37°C,持续15分钟,85°C,持续5秒,cDNA产品储存在−80°C。PCR, 3μL的互补产品的每个样本与Taq DNA聚合酶放大,用一对引物特定人类以挪士ET-1,β肌动蛋白在25μL反应体积;描述的引物序列和PCR条件表1。PCR循环条件为30秒95°C, 95°C,持续5秒,60°C为30秒50周期,在94°C,最初变性5分钟和5分钟的最后一个延伸72°C。结果数据分析Rotor-Gene实时分析软件6.1。的相对计算每个目标基因的信使rna表达水平 。

表1
用于rt - pcr引物。

2.9。免疫荧光染色

如前所述(执行免疫荧光染色18]。细胞被固定为4%多聚甲醛(pH值7.4)在4°C和15分钟permeabilized Triton x - 100为0.2%在室温下5分钟。被屏蔽后30分钟正常牛血清为5%,细胞被孵化和p38 MAPK抗体(1:100稀释)在4°C隔夜紧随其后FITC-conjugated二级抗体(1:50稀释,1 h)。使用荧光显微镜图像得到(IX81、奥林巴斯、日本)。

2.10。统计分析

使用单向方差分析进行统计评估图基的测试。的值 被认为是具有统计学意义。数据表示为均值±SE至少有三个独立的实验。

3所示。结果

3.1。EMs对细胞活力的影响

暴露的HUVEC AGEs-BSA (100 mg / L) 6 h, 24小时和48小时显著减少细胞生存能力明显比BSA (100 mg / L,渗透控制)( ,图1)。细胞生存能力降低6 h和AGEs-BSA治疗后48小时达到最低水平。而预处理EM1和EM2反应堆(10μM, 1μ0.1米,μM、10海里)AGEs-BSA组相比显著增加细胞活力,功能很明显在24 h, 48 h相比6 h ( 与 ),比低浓度和高浓度更明显,表明EMs可以减弱AGEs-BSA减少细胞生存的时间和浓度的方式(图2)。


图1
MTT比色AGEs-BSA对细胞活力的影响试验。HUVECs服用AGEs-BSA (100 mg / L)或BSA (100 mg / L) 6 h, 24 h, 48 h。可行性计算活细胞的百分比在对待文化相比控制文化。每个值代表均值±SD ( )。 与BSA组。
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图2
影响EM1, EM2细胞MTT比色可行性测试。HUVECs EMs处理(10μM, 1μ0.1米,μ米,10 nM)在治疗前2 h AGEs-BSA (100 mg / L) 6 h, 24 h, 48 h。可行性计算活细胞的百分比在对待文化相比控制文化。每个值代表均值±SD ( )。统计分析与方差分析AGEs-BSA组相比。 。
3.2。EMs对生产的影响

作为显示在图3没有在HUVEC的生产 μM孵化后24 h在对照组和 μM AGEs-BSA组,显著高于对照组( ),而没有在HUVEC的生产 μ米, μ米, μ米, μ米在EM1孵化24 h后预防组的浓度10μM, 1μ0.1米,μ米,10 nM,特别是低于AGEs-BSA集团( 0.05)。这些结果表明,EM1抑制浓度的方式没有生产在AGEs-BSA HUVEC刺激。EM2组相同的结果观察。

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图3
影响EM1, EM2反应堆在HUVEC没有浓度由格里斯反应测试。每个数据表示为均值±SD ( )。 与AGEs-BSA集团 与控制(BSA)组。
3.3。EMs对伊诺分泌的影响

在对照组(见图4),伊诺的分泌 U /毫升孵化后24 h和 . 05 U /毫升AGEs-BSA治疗组,显著增加了对照组( )。虽然伊诺分泌EM1, EM2预处理组 U /毫升, U /毫升, U /毫升, U /毫升; U /毫升, U /毫升, U /毫升, U / 10毫升的浓度μM, 1μ0.1米,μM、10 nM,显著降低AGEs-BSA治疗组( 0.05),这些结果表明,EMs concentration-dependently有效地抑制了伊诺HUVEC的分泌。

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图4
影响EM1, EM2 HUVEC伊诺水平。每个数据表示为均值±SD ( )。 与AGEs-BSA集团 与控制(BSA)组。
3.4。EMs对以挪士分泌的影响,以挪士的mRNA水平

在对照组(见图5(一个)),以挪士的分泌 U /毫升孵化24 h后,AGEs-BSA治疗组 U /毫升,对照组相比显著降低( )。而以挪士的分泌物在EM1, EM2预处理组 U /毫升, U /毫升, U /毫升, U /毫升; U /毫升, U /毫升, U /毫升, U / 10毫升的浓度μM, 1μ0.1米,μM、10 nM,明显高于AGEs-BSA相比治疗组( 0.05),这些结果表明,EMs预处理废除了降低效率,和浓度的方式。类似的结果观察到的mRNA水平以挪士(图5 (b))。这些结果表明,EMs有效抑制以挪士表达和分泌的减少刺激HUVEC的年龄。

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图5
EM1, EM2反应堆在HUVEC以挪士分泌由ELISA试验(a)。根据上述分组HUVECs被孵化。每个值代表均值±SD ( );信使rna表达水平治疗后以挪士AGEs-BSA EM1或EM2反应堆,用BSA细胞治疗作为参考(b)的控制。每个互补脱氧核糖核酸样本的参数Ct推导和一对引物;对于一个给定的样本,Ct值β肌动蛋白是减去从每个候选人的Ct基因反应到达 Ct值。的意思是 Ct从所有控制反应然后减去 每个处理样品到达的Ct Ct。相对褶皱变化计算的表达式 。每个数据表示为均值±SD ( )。 与AGEs-BSA集团 与控制(BSA)组。
3.5。EMs对ET-1, ET-1 mRNA水平

在对照组(图6(一)),ET-1的分泌 ng / mL后24 h和孵化 ng / mL AGEs-BSA治疗组明显高于对照组( )。虽然ET-1分泌物在EM1, EM2预处理组 ng / mL, ng / mL, ng / mL, ng / mL; ng / mL, ng / mL, ng / mL, 10 ng / mL的浓度μM, 1μ0.1米,μ米,10 nM,明显低于AGEs-BSA治疗组( 0.05),这些结果表明,EMs预处理废除了增加有效浓度的方式。类似的结果观察ET-1的mRNA水平(图6 (b))。这些结果表明,EMs有效地抑制ET-1 mRNA表达和ET-1 HUVEC的分泌。

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图6
EM1, EM2反应堆在HUVEC ET-1分泌由ELISA试验(a)。根据上述分组HUVECs被孵化。每个值代表均值±SD ( );mRNA的表达水平在治疗后ET-1 AGEs-BSA和EM1或EM2反应堆,用BSA细胞治疗作为参考(b)的控制。每个互补脱氧核糖核酸样本的参数Ct推导和一对引物;对于一个给定的样本,Ct值β肌动蛋白是减去从每个候选人的Ct基因反应到达 Ct值。的意思是 Ct从所有控制反应然后减去 每个处理样品到达的Ct Ct。相对褶皱变化计算的表达式 。每个数据表示为均值±SD ( )。 与AGEs-BSA集团 与控制(BSA)组。
3.6。EMs对p38 MAPK的影响

在这项研究中,我们调查试图确定EMs抑制AGEs-induced通过p38 MAPK活动在内皮细胞功能障碍。正如数据7 (b)和8(一个)的荧光强度p38 MAPK在细胞核明显升高AGEs-treated HUVECs相对于BSA-treated集团(数据7(一)和8 (b))。然而,在EMs进行预处理组(数字7 (c)- - - - - -7 (f))和数字8 (c)- - - - - -8 (f)),在细胞核中p38 MAPK的荧光强度与BSA组相似,AGEs-BSA组相比明显较弱。因此,这些结果暗示EMs抑制p38 MAPK的表达在细胞核中引起的。

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图7
免疫荧光的研究EM1 HUVECs p38 MAPK。细胞被固定,孵化p38 MAPK抗体和FITC-conjugated第二抗体。照片拍摄在400 x放大。(BSA (a)、(b) AGEs-BSA (c) 10μ米,(d) 1μ0.1米,(e)μ米,(f) 10海里)。
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图8
免疫荧光的研究EM2反应堆在HUVECs p38 MAPK。细胞被固定和孵化p38 MAPK抗体和FITC-conjugated第二抗体。照片拍摄在400 x放大。((一)AGEs-BSA, BSA (b), (c) 10μ米,(d) 1μ0.1米,(e)μ米,(f) 10海里)。

4所示。讨论

血管内皮细胞在调节anti-thrombus发挥重要作用,维持血管的自然功能,分泌多种活性物质。年龄、高血糖、oxide-LDL和炎性因子的主要因素是诱发内皮细胞损伤(19,20.]。一旦内皮细胞受损,就会导致功能障碍和异常分泌活性物质(如不,NOS、ET-1和内皮PGI2)。

没有是一种强氧化剂,最重要的一个介质在内皮细胞功能的规定,由三个亚型的没有合成酶合成(NOS),也就是说,以挪士,进气阀打开,nNOS。以挪士是既定的表达,特别是在生理条件下连续生产(21]。我们的研究结果表明,孵化与年龄(100 mg / L), 24小时没有导致显著增加,伊诺生产和分泌和减少mRNA的表达以挪士相比,对照组HUVECs(数字3- - - - - -5);这些影响被EM1惊人逆转,EM2预处理,这些研究结果符合一些先前的报道(22,23]。它也认识到,没有由以挪士被描述为“低产出”途径而伊诺无法产生“高输出”的方式导致细胞或器官功能障碍和细胞凋亡24]。证据表明NOS表达同种型(特别是伊诺)在某些病理条件改变,没有供应过剩(25,26]。根据我们的数据,我们推断,年龄可以改变NOS同种型表达式通过减少以挪士表达式和刺激伊诺HUVECs供过于求,导致生产过剩的,这是由于增强伊诺表达式。EMs可以增强NOS活性的调控以挪士表达式和减少伊诺生产,导致健康生产和生物利用度。指出EMs可以减弱HUVECs号由年龄的障碍。EM1显示效果一样EM2反应堆在我们的观察。大量的研究报道,EMs可以在哺乳动物细胞调节NOS的表达,如人类骨髓基质细胞(27),人类巨噬细胞(28),和小鼠腹腔巨噬细胞29日];然而,据我们所知,没有在HUVECs报告。

ET-1,强化血管多肽家族中的一员,被描述为一种最有效的内源性血管收缩剂(30.];之间的平衡没有和ET-1血管张力的调节是至关重要的。我们的研究清楚地表明,EM1, EM2预处理理气mRNA表达和ET-1的血浆浓度,由AGEs-BSA差异(图6)。我们认为EMs抑制ET-1表达式通过增加没有生产由以挪士合成和减少生产由进气阀打开合成,导致平衡ET-1不,可能导致内皮功能。

早些时候,这是表明p38 MAPK直接磷酸化c-Jun [31日,32];蛋白质磷酸酶和p38 MAPK在各种电池系统和交互涉及多种细胞反应的规定在一起(33]。HUVECs,年龄诱导分化伴随着ERK的活化物,和p38 MAPK通路(34]。这些数据是符合我们观察p38 MAPK被激活的年龄(100 mg / L);此外,我们的研究表明,p38 MAPK激活减弱在EMs进行预处理组相对于年龄组。结果表明,EMs的救助效果AGEs-induced损伤可能是介导,至少部分由p38 MAPK通路。这是承认,我们使用的研究手段和方法对信号通路的研究似乎太单一的,需要通过各种实验方法和不同的角度。这是我们未来工作的方向和重点。

总之,endomorphins可以减弱HUVEC障碍的合成和分泌,以挪士,进气阀打开,ET-1年龄和可能引起的抑制p38 MAPK信号通路核刺激。这些发现有部分揭示了分子机制endomorphins保护HUVECs从年龄引起的损伤,从而可以提供药物治疗内皮功能障碍在糖尿病的基础。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号。81160108,81160108),和技术项目在中国甘肃中医(批准号gzk - 2009 - 13)。任何潜在的利益冲突与本研究相关的报道。