文摘
层主题包含1 (LYRM1)是一种新型基因肥胖的脂肪组织中大量表达主题和胰岛素抵抗。在这项研究中,游离脂肪酸(远期运费协议)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)所示移植LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna表达。相反的,抵抗素和罗格列酮产生抑制作用LYRM1信使rna表达。这些结果表明,的表达LYRM1信使rna是受多种因素影响,与胰岛素敏感性有关。LYRM1可能是一个重要的中介与肥胖相关胰岛素抵抗的发展。
1。介绍
肥胖已经成为全球性的公共卫生问题最近几十年(1]。2型糖尿病的特点是一个β细胞反应不足进步胰岛素抵抗,这通常是伴随着体重增加(2]。全球增加2型糖尿病的患病率与上升的肥胖率[3]。常见的肥胖(肥胖复杂多基因)基因之间的相互作用的结果,环境和社会心理因素(4]。然而,个体差异的机制,导致肥胖仍然模糊的倾向。
在早期的研究中,我们孤立和特征层主题包含1 (LYRM1),是一种新型人类基因表达在网膜脂肪组织高水平的肥胖患者。LYRM1促进preadipocyte preadipocytes的增殖,抑制细胞凋亡5,6]。过度的LYRM13 t3-l1脂肪细胞导致刺激葡萄糖摄取减少,线粒体形态异常,细胞内ATP合成减少,线粒体膜电位下降。此外,LYRM1过度导致过度生产的细胞内活性氧(7]。我们的发现表明LYRM1可能是一个新的候选基因与肥胖相关胰岛素抵抗有关。
多项研究表明,在肥胖患者脂肪组织释放出了大量的游离脂肪酸(远期运费协议)和发病数,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和抵抗素(8- - - - - -11]。所有这些因素已经被确认为胰岛素活性的主要监管机构。过氧物酶体的合成催化剂proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)叫罗格列酮(BRL49653)是thiazolidinedione的一部分(TZD)类药物。Thiazolidinedione是几类药物之一,主要是通过抑制胰岛素敏化剂,在成熟的脂肪细胞表达和分泌的发病12]。然而,潜在的这些因素如何影响胰岛素敏感性的分子机制尚未阐明。
在这项研究中,我们显示LYRM1是一种新型的基因与肥胖相关胰岛素抵抗有关。我们假设这些因素(远期运费协议,TNF -α和抵抗素)和药物(罗格列酮)可能有潜在的调控机制在肥胖的规定LYRM1mRNA的表达,从而影响胰岛素敏感性。本研究的目的是调查的影响远期运费协议,TNF -α、抵抗素和罗格列酮LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna表达。
2。材料和方法
2.1。3 t3-l1细胞培养和治疗
3 t3-l1细胞培养、维护和分化如前所述[13]。简单,实现了融合后,细胞生长两天在DMEM / high-glucose介质(美国加州Gibco,卡尔斯巴德)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco,加州卡尔斯巴德,美国)有限公司5%2环境。随后分化引起的孵化与0.5类似的媒介,是补充更易与L 3-isobuty-1-methylxanthine(混合;σ,圣路易斯,密苏里州,美国),1μmol / L地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和10μg / mL胰岛素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),2天。细胞被放置在一个包含10中μg / mL胰岛素2天。后来,媒介是取代DMEM只包含10%的边后卫,每2天。
诱导分化后第八天,如果超过90%的细胞显示脂肪细胞的形态学和生化特性,细胞用于实验。在无血清DMEM隔夜孵化后,3 t3-l1脂肪细胞治疗与10 ng / mL TNF -α(T7539), 60 ng / mL抵抗素(SRP4560), 0.5μM罗格列酮(375004),都在DMSO溶液溶解,或1毫米FFA鸡尾酒由棕榈酸(p5585)、油酸(O1008)和亚油酸(L1376;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。高FFA的解决方案是准备根据以前公布的方法(14,15]。短暂,脂肪酸溶解在2% (w / v)脂肪无酸的牛血清白蛋白(BSA),股票浓度为100 mM或同等体积的车辆。股票的解决方案是稀释1:100年DMEM 1毫米的最终浓度。12小时或24小时后的孵化TNF -α罗格列酮,抵抗素和高FFA的解决方案,组织进行后续实验。
2.2。定量实时反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)
从3 t3-l1脂肪细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。提取的RNA被分光光度法量化为260 nm。1的互补脱氧核糖核酸合成μ克总RNA用lamv逆转录酶工具包(Promega A3500;美国威斯康星州麦迪逊Promega),根据制造商的指示。实时rt - pcr进行应用生物系统公司7500序列检测系统(ABI 7500 SDS;美国加州福斯特城)遵循制造商的协议。
两套引物被用于PCR分析。259年英国石油公司内的DNA片段LYRM1基因是用来量化LYRM1信使rna。克隆到质粒PCR产品以前pMD-T 18, DNA测序验证。质粒标准已知拷贝数被用来生成一个对数线性标准曲线,从副本的数量LYRM1可以被实时qPCR决定。110 - bp的区域β肌动蛋白基因用于标准化结果。从质粒包含一个标准曲线生成β肌动蛋白片段。这个标准曲线是用来确定数量的副本β肌动蛋白。简而言之,样本在95°C的环境为最初的10分钟变性,紧随其后的是40 PCR循环。每个周期由95°C的孵化15秒和退火60°C 1分钟。浓度的比例LYRM1来β肌动蛋白反映的表达水平LYRM1每个细胞信使rna。底漆和Taqman探针(英杰公司、上海、中国)序列如表所示1。
2.3。统计分析
每个实验进行至少三次。所有数据被表示为±SD方法。执行统计分析使用单向方差分析使用SPSS 12.0统计软件包(SPSS Inc .)、芝加哥、生病,美国)。对于所有的测试,值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。的表达LYRM1信使rna的转换期间3 t3-l1 Preadipocytes成脂肪细胞
LYRM1mrna表达在非常低的水平在3 t3-l1 preadipocytes。3 t3-l1细胞脂肪细胞的转换期间,的表达LYRM1基因逐渐增加达到一个稳定水平(图后第十天1)。超过90%的细胞表现出典型的脂肪细胞形态第十天。
3.2。表达式的远期运费协议的影响LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna
远期运费协议的影响进行评估LYRM1信使rna水平,我们检查的表达LYRM1mRNA 3 t3-l1脂肪细胞治疗的远期运费协议1毫米。治疗持续时间是12或24小时,10天后分化是刺激。我们发现远期运费协议1毫米的浓度导致时间增加LYRM1信使rna表达。LYRM1信使rna表达显著增加了12 h(曝光(图224小时后),继续增加曝光。在这个时间点,的表达LYRM1信使rna大约是2倍大于控制mRNA ()。这一结果表明,远期运费协议的信使rna表达水平显著增加LYRM1基因。
3.3。肿瘤坏死因子的影响α和抵抗素的表达LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna
我们检查了LYRM1mRNA表达3 t3-l1刺激脂肪细胞分化后10天,曾接受10 ng / mL TNF -α或60 ng / mL抵抗素。肿瘤坏死因子-α略有增加LYRM1信使rna表达3 t3-l1脂肪细胞经过12 h。信使rna表达继续增加治疗后24小时(;图3)。抵抗素表现出温和的抑制作用LYRM1在12 h基因表达;然而,表达显著减少抵抗素治疗后24小时(;图4)。
3.4。罗格列酮的表达的影响LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna
研究之间的关系LYRM1表达和PPAR -γ受体激动剂,我们检查了罗格列酮的影响在60 ng / mL 3 t3-l1脂肪细胞。治疗后12小时,LYRM1信使rna表达3 t3-l1脂肪细胞减少。24 h后mRNA表达明显减少大约一半的控制(;图5)。
4所示。讨论
世界卫生组织报告说,至少有十亿成年人超重,3亿人肥胖。在没有干预的情况下,这些数字将上升(16]。大多数肥胖个体胰岛素抵抗是2型糖尿病的一个重要病因。脂肪细胞分泌多种介质,包括FFA、TNF -α抵抗素,所有这些调节胰岛素信号和葡萄糖吸收。LYRM1是一个最近发现的基因参与肥胖相关胰岛素抵抗[5,7]。LYRM1mRNA表达调节在3 t3-l1细胞转换成脂肪细胞,表明的表达LYRM1基因参与脂肪细胞的分化。从诱导分化后第十天,LYRM1mRNA表达保持在一个稳定的高水平,表明这个克隆细胞系可用于调查的规定LYRM1基因的表达。阐明机制LYRM1参与肥胖相关胰岛素抵抗的发病机制,我们具有这种基因是如何受调节胰岛素敏感性的因素。此外,我们还研究了罗格列酮的影响,这是一个PPAR -γ受体激动剂,LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna表达。
循环游离脂肪酸浓度升高2型糖尿病的特点,与胰岛素抵抗的病因17]。胰岛素抵抗被认为来自受损的胰岛素信号在目标组织。信号受损是由于增加的丝氨酸/苏氨酸磷酸化的胰岛素受体底物(IRS-1和IRS-2)。此外,胰岛素抵抗是加剧了减少pi3激酶激活(PI3K)和易位的抑制刺激葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4) [18,19]。过度的远期运费协议导致胞内积累的代谢产品,如神经酰胺,二酰基甘油或酰coa。这些FFA-derived产品可能导致缺陷在胰岛素信号和葡萄糖运输PI3K-dependent通路(20.,21]。然而,这种现象的潜在机制尚未阐明。在这项研究中,我们观察到远期运费协议增加了体内调节LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna表达。我们之前显示LYRM1超表达可以抑制刺激葡萄糖运输脂肪细胞(7]。我们观察到,过度的远期运费协议可能诱导胰岛素抵抗。电阻可以部分通过upregulation诱导LYRM1表达式,这将抑制脂肪细胞葡萄糖摄取。这些发现支持和扩展其他结果的文献,调查远期运费协议对胰岛素信号的影响。
研究最广泛的细胞因子之一,TNF -α据报道,调节胰岛素抵抗[10]。肿瘤坏死因子-一个关键的角色α在与肥胖相关胰岛素抵抗被TNF -α或肿瘤坏死因子-α受体被删除在食源性肥胖老鼠和leptin-deficient ob / ob老鼠,导致显著提高胰岛素敏感性(22]。然而,注入TNF -α中和抗体为肥胖,胰岛素抵抗,或2型糖尿病患者,没有改善胰岛素敏感性(23,24]。在这项研究中,我们观察到,TNF -α略上调LYRM13 t3-l1脂肪细胞信使rna表达。需要进一步的研究在人类脂肪细胞。目前,我们建议TNF -α全身胰岛素抵抗只是间接的参与增加了LYRM1表达式。
抵抗素被确认为一个基因表达下调的TZD在小鼠脂肪细胞(11]。在啮齿动物,抵抗素在肥胖增加的循环水平25]。此外,血清抵抗素水平的增加诱导胰岛素抵抗在几个大鼠和小鼠模型,包括急性后管理(26]。重组抵抗素造成了严重的肝胰岛素抵抗在啮齿动物26]。然而,一项研究发现降低空腹血糖,改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性增强,抵抗素基因敲除小鼠(27]。在人类中,有相当大的争议的角色抵抗素。我们发现抵抗素产生温和的抑制作用LYRM13 t3-l1脂肪细胞基因表达。这些数据表明,LYRM1和抵抗素在肥胖相关胰岛素抵抗的发展互动。
在这项研究中,我们观察到罗格列酮抑制LYRM13 t3-l1脂肪细胞基因表达。罗格列酮是TZD类药物的一部分,作为药物胰岛素增敏剂和转录因子PPAR -受体激动剂γ。PPAR -γ属于三核受体亚型(其他两个是PPAR -α和PPAR -δ),它是由不同的基因编码。PPAR -γ脂肪形成的主调节器,是必要的和足够的脂肪细胞分化[28]。它还上调脂肪酸转运蛋白的表达(FATP-1和D036) (29日]。罗格列酮抑制肿瘤坏死因子-α介导的抑制脂肪细胞的分化,而TNF -α减少PPAR -的表达γ(30.]。服用tzd抑制抵抗素基因表达在人类巨噬细胞(31日,32)和降低血清抵抗素水平在人类和啮齿动物(33- - - - - -35]。我们推断,罗格列酮抑制LYRM1基因表达通过PPAR -最有可能γ。
我们的研究结果表明LYRM1信使rna表达大大地受到罗格列酮,远期运费协议,和两个发病,TNF -α和抵抗素。这两个发病是参与调控胰岛素敏感性。的差别upregulation或对这些LYRM1表达可能与FFA或rosiglitazone-related胰岛素抵抗密切相关。最近,LYRM1在鼠成肌细胞已被证明负调节的功能IRS-1 PI3K / Akt,同时减少GLUT4易位和葡萄糖吸收响应胰岛素(16种)36]。然而,一个更精确的生理活动的特征LYRM1需要完全理解这些过程。
利益冲突
有关本文作者声明的任何潜在的利益冲突。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号30801256和30801256),江苏省医学领先人才计划(批准号LJ200624),江苏省自然科学基金(批准号BK2011040)、南京市医学科技发展基金会(ZKX09012)。最小张Hai-Ming赵和Zhen-Ying秦贡献同样这项工作。