文摘

运动对2型糖尿病的管理建议,但其对糖尿病肾病(DN)的影响仍然未知。我们假设适当锻炼改善炎症和氧化损伤的早期DN通过衰减。2型糖尿病KK - 老鼠,自发的DN模式,进行了两种不同的运动(即。、中度和低强度)。久坐不动的老鼠或者处于一个锻炼方案导致体重没有明显损失。我们检测了尿白蛋白排泄,足细胞和巨噬细胞,肾HIF-1的表达αMCP-1和生物标记物的氧化应激,如尿8-OHdG和血清SOD。锻炼降低尿白蛋白水平也保持足细胞行使KK -的数量 老鼠独立超重和高血糖的改进,虽然中等强度锻炼增加HIF-1的表达式α。久坐不动的KK - 老鼠MCP-1表达的增加和巨噬细胞的浸润,增加了尿8-OhdG,降低血清SOD水平与行使KK - 老鼠。总的来说,低强度运动变弱肾缺血早期DN的发展而不影响明显。足细胞的还原利率的尿白蛋白和维护数字,与并行改进氧化损伤和炎症,相关有益的运动在糖尿病肾病。

1。介绍

最近的研究表明,一个慢性炎症过程,氧化应激促进糖尿病肾病(DN)的进展(1- - - - - -4]。我们也显示巨噬细胞浸润和增加MCP-1表达式和肾小球和尿液KK - 老鼠,2型糖尿病的常用动物模型(T2D) [5,6]。此外,尿8-OHdG氧化DNA损伤的一个标志,也增加了在小鼠模型(7]。

生活方式的修改,特别是适当的锻炼,建议管理T2D通过改善代谢危险因素,如血压、血糖、血浆脂质,及氧化应激标志物。另一方面,这也要消耗大量的氧气,导致生产高浓度的活性氧(ROS)。也有证据表明,活性氧和高葡萄糖暴露导致足细胞凋亡在实验DN (8]。认为运动性蛋白尿的通常不是永久但损耗(9,10]。此外鲜为人知,适度锻炼不利影响肾功能(11- - - - - -14]。一些研究报道,运动显示renoprotective影响在两种类型的糖尿病受试者在DN的动物模型,虽然具体的作用机制,锻炼良好的对肾功能的影响还没有完全理解(15- - - - - -18]。

1969年,KK - 鼠标建立了西村(19]。这款鼠标是由黄色的肥胖基因的转移( 等位基因)KK小鼠。因为在KK -糖尿病功能 鼠标KK小鼠比这更严重,这只老鼠被广泛用作T2D的实验模型。KK - 小鼠自发与高血糖相关展览T2D,葡萄糖耐受不良,高胰岛素血症、肥胖、和微蛋白尿。在KK -肾损伤 老鼠相似的人类DN与肾小球出现弥漫性系膜增生,系膜细胞增殖,节段性硬化,TGF超表达β1在20周的年龄。我们有报道说,KK - 鼠标是一个合适的模型研究DN在人类6,7,20.- - - - - -22]。

在目前的研究中,我们假设适当运动可以改善早期DN通过衰减表达式的肾脏的炎症和氧化应激KK - 老鼠。

2。材料和方法

2.1。实验动物和协议

八周大的男性糖尿病KK - / Ta Jcl老鼠从克丽购买日本(日本东京)。我们还买了同样的年龄男性KK / Ta Jcl KK -小鼠作为对照 鼠标。老鼠被单独安置在塑料笼子免费食物(啮齿动物颗粒饮食NMF;348千卡/ 100 g,包含粗脂肪5.5%)和水在整个实验周期。所有老鼠都保持在一个房间里在常规条件下与常规12小时光/暗周期和温度控制在24±1°C。所有实验根据顺天堂大学动物保健委员会的指导方针。

适应新环境后,在跑步机上跑步(日本大阪,大阪微系统)为4周,KK - 小鼠被分为三组:(1)久坐不动的集团(没有锻炼),(2)低强度运动组和(3)中强度运动组( 每组-13)。老鼠在10米/分钟锻炼一个小时中等强度组每周5天或5米/分钟30分钟3天一个星期在低强度组8周。做运动KK - 和KK小鼠放在不旋转车轮同样的时间。实验协议终止时老鼠达到20周的年龄。

2.2。生化测量

尿albumin-creatinine比率(ACR)、体重(BW),和糖化血红蛋白(HbA1c)在12至20周的年龄测定。尿的水平8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)、n -乙酰-β-D-glucosaminidase(唠叨)、血清肌酐、超氧化物歧化酶(SOD)和肌酐清除率(Ccr)在20周的年龄测定。尿标本收集24小时使用代谢笼(鼠标代谢笼,克丽日本)。由免疫测定尿白蛋白肌酐样本测量(DCA 2000系统;拜耳诊断,埃尔克哈特)。血液中葡萄糖水平从retroorbital窦获得测量使用Glucocard(京都第一核电站Kagaku,京都,日本)。糖化血红蛋白也是衡量免疫测定(DCA 2000系统,拜耳诊断)。血清肌酐是衡量一个自动分析器(富士Dry-chem 5500;富士胶片,日本东京)。尿8-OHdG水平是衡量一个酶联免疫吸附试验(故事制药、Kagawa、日本)23]。血清SOD活性(SOD测定Kit-WST, Dojindo分子技术,东京,日本)被酶免疫分析法测定。Ccr估计比日常尿肌酐的排泄血浆肌酐浓度,然后表示为毫升每分钟每平方米的表面积。

2.3。免疫组织化学染色对缺氧诱导因子(HIF) 1α,单核细胞趋化蛋白1 (MCP), CD68、CD204

20周的老鼠牺牲了年龄。肾脏与生理盐水灌注逆行通过腹主动脉5分钟约150毫米汞柱压力事先冲洗的脉管系统。冻结部分或石蜡包埋组织化学染色部分执行。肾组织快速冷冻在最佳切削温度复合,切成3 -μ米厚的部分。Formalin-fixed和石蜡包埋组织被削减时2μm。使用商用抗体进行免疫组织化学研究如下:鼠标单克隆anti-HIF-1α抗体(ab-1;美国马Abcam),山羊多克隆抗体anti-MCP-1 (sc - 1784;美国圣克鲁斯,CA),鼠单克隆anti-CD68 (pan巨噬细胞的标志)(MCA1957;AbD Serotec,牛津大学,英国),鼠单克隆anti-CD204 (M2巨噬细胞的标志)(MCA1322;AbD Serotec,英国牛津大学)。HIF-1α染部分被阻塞了鼠标Ig阻塞试剂(mkb - 2213;向量实验室、CA、美国)。其他彩色部分是被屏蔽解决方案(2%胎牛血清,10%正常山羊血清在PBS)。与二次孵化的部分抗体:抗体免疫球蛋白,anti-mouse免疫球蛋白,和anti-rat免疫球蛋白,分别(Nichirei、东京、日本)。二次抗体由光学显微镜与diaminobenzidine可视化。

的HIF-1α染色的至少20个随机选择的字段(×200)从每个鼠标使用ks - 400 4.0版本的图像量化分析系统(ks - 400;卡尔蔡司的愿景,德国慕尼黑)。的数量M1, M2, MCP-1-positive细胞数在至少20个随机选择的领域(×200)和/或至少20肾小球。分析由两个调查员蒙蔽的方式(6,24]。

2.4。实时PCR MCP-1 mRNA的定量分析

实时PCR也用来评估MCP-1 mRNA表达整个肾脏的老鼠在20周的年龄。总RNA提取整个肾脏使用RNeasy迷你包(试剂盒株式会社日本东京)。使用随机五个一互补DNA合成(量子RNA设备;Ambion,德克萨斯州奥斯汀市。美国)。互补的DNA被进一步放大实时聚合酶链反应(PCR)系统(ABI棱镜7500实时PCR系统;美国PerkinElmer,加州福斯特城)。最初的模板浓度是源自的周期数荧光信号穿过一个阈值的对数生长期PCR反应。相对基因表达是基于阈值确定周期(Ct值)。PCR参数95°C 10分钟,50周期在95°C 15年代,60年代和60°C。引物和fluorogenic调查MCP-1从TaqMan获得基因表达分析,应用生物系统公司(美国加州福斯特城)。 The assay identity number of MCP-1 was Mm-00441242-m1 and GAPDH was Mn-99999915-g1.

2.5。Immunofluorescent染色对足细胞(WT-1)

Immunofluorescent染色对足细胞在肾组织中都使用了多克隆兔anti-mouse WT-1抗体(圣克鲁斯,sc - 192)。山羊anti-rabbit Alexa萤石488用于可视化WT-1阳性细胞。安装有荧光的部分安装媒体(Dako Cytomation)前可视化Fluoview 1000共焦显微镜(奥林巴斯、东京、日本)和FV10-ASW软件(版本1.3摄氏度;奥林匹斯山)。

至少20个肾小球的染色每个鼠标量化使用ks - 400图像分析系统。足细胞的数量每肾小球面积确定使用的方法韦贝尔[25]。足突细胞数量比肾小球面积计算。这些考试是由两个调查员没有知识的起源的幻灯片,然后计算平均值。

2.6。统计分析

数据被表示为平均数±标准差。统计差异意味着运用Dunnett确定的测试。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。生化参数

开始之前的实验中,我们测量了基线空腹血糖、体重,和每个动物的尿白蛋白在12周的年龄,并证实没有明显差异在这些值在久坐和行使KK - 老鼠。然而,这些参数在久坐KK - 老鼠明显高于与久坐KK小鼠相比(表1)。

表1
生化参数在每个鼠标在年龄12至20周。

生化参数后8周实验协议也表所示1。久坐不动的KK -体重和糖化血红蛋白的水平 老鼠仍处在高水平比久坐不动的KK小鼠。然而,这些水平没有差异在久坐和行使KK - 老鼠。Ccr在KK -的水平 老鼠与KK小鼠相比略有增加。然而,没有统计上显著的变化Ccr久坐KK -的水平 老鼠和久坐不动的KK小鼠。此外,没有观察到显著变化之间的水平的Ccr久坐和锻炼KK - 老鼠(表1)。尿白蛋白水平在行使KK - 老鼠往往低于久坐KK - 老鼠,虽然差异无统计学意义。然而,尿白蛋白的速度改变从12到20周(图1)和尿NAG KK -水平 小鼠低强度运动达到统计上的显著水平。行使KK - 老鼠尿8-OHdG和更高的血清SOD的含量明显低于比久坐不动的KK - 老鼠。这些水平接近那些KK小鼠,尽管这些低收入和中等强度锻炼没有差异KK - 老鼠。


图1
变化率的尿白蛋白在KK - 12至20周 老鼠。变化率的尿白蛋白在20周的年龄除以12周的年龄。低强度锻炼KK - 老鼠尿白蛋白的变化率与久坐不动的老鼠。 。
3.2。免疫组织化学的HIF-1α,CD68 MCP-1和CD204肾脏

HIF-1α肾小管和肾间质蛋白主要是局部在相邻的髓质。与预期相反,HIF-1的表达α在中等强度锻炼KK - 老鼠的价格相比明显高于久坐KK - 老鼠,虽然久坐和低强度锻炼KK -没有差异 老鼠(图2)。此外,HIF-1α不是久坐KK小鼠观察的表达式。


图2
HIF-1α在KK -染色强度和染色 老鼠在20周的年龄,没有锻炼。HIF-1α染色强度在中等强度锻炼KK - 老鼠明显增强的价格相比久坐KK - 老鼠,但这些水平久坐和低强度锻炼KK -没有差异 老鼠。 。代表HIF-1α染色肾皮质的久坐不动的乐(b, g),久坐不动的KK - (c、h),低强度锻炼KK - (d、i)和中等强度锻炼KK - 老鼠。(e, j)染色法(f),描绘了缺乏主要的抗体。图像(a e)在40倍放大和图像(f j)被放大400倍。 。

MCP-1积极在近端小管细胞被本地化。每1000年MCP-1阳性细胞的数量μ米2在行使KK - 老鼠相比显著降低久坐KK - 老鼠,差点的久坐不动的KK小鼠(图3)。


图3
MCP-1阳性细胞数量和染色在每个鼠标在20周的年龄。MCP-1阳性细胞的数量在久坐KK - 老鼠明显更大的价格相比行使KK - 老鼠和久坐不动的KK小鼠。代表MCP-1染色肾皮质的久坐不动的乐(b),久坐不动的KK - (c),低强度锻炼KK - (d)和中等强度锻炼KK - 老鼠。(e)染色法(a)描绘了缺乏主要的抗体。图像被放大100倍。 。

阻力指标区域也许可以M2巨噬细胞在肾的数量没有改变久坐和锻炼KK - 老鼠,但估计M1的巨噬细胞,计算的数量减去CD204 CD68阳性细胞的强烈运动KK - 老鼠,久坐不动的KK -相比明显下降 老鼠。虽然CD204和CD68阳性细胞的数量是类似于肾小球,CD204和CD68阳性细胞的数量在肾小球远低于阻力指标方面也许可以在肾。这一结果表明,大多数的巨噬细胞被认为是M2巨噬细胞在肾小球,M2巨噬细胞的数量显示,减少低强度锻炼KK - 老鼠比久坐不动的KK - 老鼠(图4)。


图4
CD204和CD68阳性细胞数量和染色在每个鼠标在20周的年龄。条形图显示CD68和CD204阻力指标面积也许可以阳性细胞在肾小球和久坐不动的乐(b),久坐不动的KK - (c),低强度锻炼KK - (d)和中等强度锻炼KK - 老鼠。(e) CD68阳性细胞的数量在肾小球的久坐不动的KK - 老鼠大大增强与久坐KK小鼠相比,但久坐和行使KK -没有差异 老鼠。CD68阳性细胞的数量在肾小球的久坐不动的KK - 老鼠也显著大于也比久坐不动的KK小鼠和低强度锻炼KK - 老鼠,但不是中等强度锻炼KK - 老鼠。CD68阳性细胞数量的阻力指标面积也许可以在久坐KK - 老鼠也显著大于比久坐不动的KK小鼠同时行使KK - 老鼠,但它没有差异低收入和中等强度锻炼KK - 老鼠。阻力指标区域也许可以CD204阳性细胞的数量的久坐不动的KK - 老鼠也显著大于与久坐KK小鼠相比,但久坐和行使KK -没有差异 老鼠。 。
3.3。肾脏肾MCP-1 mRNA的表达

如图5MCP-1 mRNA水平,久坐不动的KK - l 老鼠是明显高于行使KK - 老鼠和久坐不动的KK小鼠。


图5
肾脏肾MCP-1 mRNA的表达在20周的年龄。MCP-1 mRNA水平的久坐不动的KK - l 老鼠明显高于行使KK - 老鼠和久坐不动的KK小鼠。 。
3.4。WT-1阳性细胞的数量

如图6肾小球WT-1阳性细胞的数量,足细胞,每1000人μ米2久坐不动的KK -肾小球的区域 老鼠明显低于久坐KK小鼠。另一方面,足细胞的数量在低收入和中等强度锻炼KK - 老鼠明显比久坐不动的KK - 老鼠。


图6
WT-1阳性细胞数量和染色在每个鼠标在20周的年龄。在行使KK - WT-1阳性细胞 老鼠明显保持比久坐不动的KK - 老鼠和接近KK小鼠。 。代表WT-1染色肾皮质的久坐不动的乐(a),久坐不动的KK - (b),低强度锻炼KK - (c)和中等强度锻炼KK - 老鼠。(d)图像被放大400倍。

4所示。讨论

在目前的研究中,如果锻炼的老鼠的体重没有增加相比,久坐不动的老鼠,老鼠被允许随意吃,我们定义中等强度等运动。我们还表明,运动训练改善尿NAG水平以及尿白蛋白的变化率从12到20周,体重和血糖的独立地位的肾脏KK - 老鼠,尽管中等强度锻炼增加HIF-1的表达式α在肾脏。在这项研究中,没有观察到显著变化在Ccr久坐KK -的水平 和行使KK - 老鼠。因此,表明尿白蛋白的减少并不是由于肾血流量和肾小球滤过率降低,但更容易运动的影响。我们运行的程序(10米/分钟一小时,每周5天总共8周)非常相似但稍微不那么激烈与计划相比黄et al。(15米/分钟45分钟,每周5天,共8周)(26]。有趣的是,他们还证明了运动训练在KK -不影响体重 老鼠虽然运动的起始时间不同于在我们的协议(12-20周分裂到8 - 16个周)和。

有几种运动在DN的renoprotective效应的机制。一般来说,运动训练改善肾功能,改善代谢因素,如血浆脂质、血糖、血压和体重。它也是提高肾组织学在不改变代谢因素符合我们目前的研究。不懂礼貌的人等。27)表明,运动训练减少晚期糖化终端产品(年龄)血清及肾组织的肥胖Zucker老鼠,T2D和相关肾病的动物模型,在不改变炎症生物标记或代谢因素。相比之下,我们的研究清楚地表明,行使老鼠减毒肾表达MCP-1和巨噬细胞的浸润肾脏。一般而言,巨噬细胞激活被定义为两个偏振,M1和M2,在脂肪组织中28),尽管这些巨噬细胞在DN的含义还没有完全理解。M1巨噬细胞产生促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子α和il - 6,而另一方面,M2巨噬细胞产生抗炎细胞因子(29日]。巨噬细胞的数量阻力指标增加也许可以在肾小球和DN的进展。阻力指标地区也许可以M1巨噬细胞的模式类似于MCP-1阳性细胞,这表明锻炼可能会减弱MCP-1表达式通过防止M1巨噬细胞浸润,主要阻力指标地区。也许可以的在肾小球,与我们的预期相反,大多数的巨噬细胞似乎M2巨噬细胞,这些巨噬细胞增加发展为DN,尽管锅肾小球中巨噬细胞的数量是非常小的阻力指标地区。也许可以的价格相比仍然是未知的,不管是M2巨噬细胞在肾脏的功能是不同的,或者如果M2巨噬细胞在脂肪组织增加,以弥补M1的增加巨噬细胞在肾脏。需要进一步的研究来解释这一点。

认为适当的锻炼会增加抗氧化酶,虽然过度锻炼会导致炎症,氧化应激与活性氧增加,并减少肾血流量和肾小球滤过率。Moien-Afshari et al。30.)表明,SOD同种型的表达取决于运动强度在糖尿病db / db小鼠的主动脉。在目前的研究中,两种强度的锻炼提高血清SOD水平,即使我们没有确认每个同种型级别。此外,这两个练习减少尿8-OHdG水平,氧化应激标记。然而,与我们的预期相反,低强度运动是更有效的比中等强度锻炼肾功能。我们需要进一步调查,以确定适当的运动强度。虽然有缺陷,但这项研究表明,运动训练可能减弱podocytopenia和蛋白尿,部分是通过抗炎和抗氧化作用,因为它并不影响代谢的因素。

我们研究的主要局限性如下。我们没有测量血压,有益的锻炼可能部分源于降压效果。此外,我们不能估算适当的运动强度在人类从这些结果。

总之,低强度运动早期糖尿病肾病的进展而不影响肾缺血。然而,要注意肾缺血即使蛋白尿改善。减少尿白蛋白的速度变化,尿NAG,足突细胞数量和维护,与并行改进氧化损伤和慢性炎症,可能是有益的运动有关的糖尿病肾病。

缩写的列表

年龄: 高级糖化终端产品
ACR: Albumin-creatinine比率
BW: 体重
Ccr: 肌酐清除率
DN: 糖尿病肾病
糖化血红蛋白: 糖化血红蛋白
低氧诱导因子: 缺氧诱导因子
MCP: 单核细胞趋化蛋白
唠叨: n -乙酰-β-glucosaminidase
ROS: 活性氧
SOD: 超氧化物歧化酶
T2D: 2型糖尿病
8-OHdG: 8-hydroxydeoxyguanosine。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

研究的设计是由y石川,t . Gohda m . Tanimoto和y Tomino。y石川,k . Omote m . Furukawa先生和美国山口进行了研究。数据收集的y石川,k . Omote m .古河道,山口。分析和解释日期由y石川,m . Murakoshi s Hagiwara, k . Funabiki。手稿是由y石川,t . Gohda和y Tomino。

确认

作者感谢m .高木涉博士和t . Shibata小姐的熟练的技术支持。这工作是由日本社会科学,促进科学研究补助金C (KAKENHI 21500694),和Sportology中心(一个国家高科技研究中心的建立补助金的私立大学的教育,文化,体育,科学和技术的日本)。