文摘
背景。Mannan-binding凝集素(MBL)是参与糖尿病肾病的发展。MBL是一个先天免疫系统的一部分,它可以激活补体系统。血清MBL水平预测后来在糖尿病患者肾功能损害。直接MBL参与糖尿病肾病的发展是一种动物中观察到的压力。然而,这种参与动物菌株之间的可能有所不同。我们因此检查遗传背景的影响MBL在糖尿病肾病中的作用。材料/方法。C57BL / 6 jbomtac和129 s6 / SvEvTac老鼠相比。在这两种菌株,实验1型糖尿病在野生型(WT)和诱导MBL-knockout (MBL-KO)由链脲霉素小鼠。非糖尿病患者WT和MBL-KO老鼠被用作控制。我们测试了如果MBL修改diabetes-induced肾功能变化的双向方差分析允许交互。结果。MBL加重肾脏diabetes-induced增长和肾小球C57BL / 6小鼠jbomtac扩大。MBL没有修改糖尿病影响肾小球基底膜厚度或系膜卷在任何压力。Diabetes-induced肾功能变化的生长因子的基因转录和矩阵组件被MBL未受影响。结论。毒株特异性MBL的影响在下游发现了糖尿病肾功能变化。这强调遗传背景的重要性在这个模型的糖尿病并发症。
1。介绍
糖尿病肾病终末期肾脏疾病的最常见原因是在许多西方国家1- - - - - -5]。糖尿病肾病的累积发病率约三分之一在不同糖尿病人群(6- - - - - -10]。发病率下降,尽管在过去的几十年,仍然需要更好的治疗和识别高危患者(11]。一个未知的遗传倾向,糖尿病血管并发症是合理的因为不是所有风险将开发糖尿病肾病患者,因为糖尿病肾病集群在家庭12,13]。
补体系统是一种炎症激活先天免疫系统的一部分,似乎是重要的血管损伤在糖尿病患者的心脏和肾脏(14]。Mannan-binding凝集素(MBL)是一个识别分子和补体激活的凝集素途径的第一步。个人间的差异MBL血清水平可能会占一些倾向为糖尿病血管并发症末。高MBL和肾脏功能障碍之间的关系都可以在1型糖尿病15- - - - - -17]。此外,MBL水平在1型糖尿病的早期预测未来肾功能障碍的风险(18]。在2型糖尿病,MBL与肾功能之间的联系记录。MBL水平倾向于预测2型糖尿病肾损害,结合c反应蛋白MBL的预后价值水平达到统计学意义(19]。我们以前研究MBL的影响在早期糖尿病肾病MBL-KO老鼠backcrossed六代的C57BL / 6 jbomtac背景(20.]。在目前的研究中我们调查的作用在动物backcrossed MBL 12代,确保更均匀的动物群体。MBL与模型之间的糖尿病的影响可能不同,例如,遗传背景之间。随着C57BL / 6 jbomtac应变相对抗糖尿病肾脏比129 s6 / SvEvTac应变变化,我们比较这些菌株在目前的研究21]。在此设置中,我们评估了基因对肾脏的影响变化实验诱导后的1型糖尿病。非糖尿病患者WT与非糖尿病患者MBL-KO动物被用作控制。
2。方法
2.1。动物
我们使用女性C57BL / 6 jbomtac和女性129 s6 / SvEvTac老鼠。WT和MBL-KO老鼠都包括在这两个菌株(MBL-KO老鼠缺乏小鼠MBL的形式,MBL-A,和MBL-C)。MBL-KO动物曾被描述的发展(22]。总之,MBL double-knockout老鼠上开发混合C57BL / 6×Sv129EvSv背景和后来backcrossed到C57BL / 6 jbomtac和129 s6 / SvEvTac背景。WT动物菌株都购自泰康利(,丹麦)。MBL-KO动物来自我们自己的繁殖(backcrossed 12代以上C57BL / 6 jbomtac或129 s6 / SvEvTac职责)。在研究开始,C57BL / 6 jbomtac动物10周大,129 s6 / SvEvTac动物11周大。糖尿病诱发了链脲霉素(STZ) (Sigma-Aldrich Corp .,圣路易斯,密苏里州,美国)如下所述。所有C57BL / 6 jbomtac动物牺牲后12周糖尿病诱导和所有129 s6 / SvEvTac动物牺牲糖尿病诱导后14周。糖尿病是由不同的速率持续时间不同对STZ C57BL / 6(6周jbomtac动物和4周129年s6 / SvEvTac动物)和重合时间的牺牲。动物被安置5到7动物每笼在一个房间里有12:12小时的人造光周期(光7.00 h - 19.00 h。),温度21±1°C,湿度55±5%。动物们可以免费获得标准粮(Altromin # 1324; Lage, Germany) and tap water throughout the experiment. Food consumption was determined at group basis at the end of the study. Blood glucose was measured in tail-capillary blood as described below. Body weight and blood glucose were measured weekly throughout the study. Animals with signs of illness (,请参见2。2)、酮尿(),体重减轻10%以上()被排除在外。研究符合丹麦规定护理和使用实验动物。
2.2。设计
四组是由两个菌株;糖尿病(yes / no)和MBL-KO (yes / no)。以这种方式C57BL / 6 jbomtac动物被随机分为四组:(1)控制WT (),(2)糖尿病WT (),(3)控制MBL-KO (),(4)糖尿病MBL-KO ()。同样地,129 s6 / SvEvTac小鼠被随机分为四组:(1)控制WT (),(2)糖尿病WT (),(3)控制MBL-KO (),(4)糖尿病MBL-KO ()。
两个C57BL / 6 jbomtac动物被排除在外:一个从控制MBL-KO组因为肾盂积水和一个从糖尿病MBL-KO组因为严重的多囊肾疾病。从一个129 s6 /血清SvEvTac MBL-KO鼠标准备期间失去了控制。
2.3。诱导的糖尿病
糖尿病是由五个腹腔诱导STZ-injections连续五天使用剂量的45毫克/公斤体重。如果不是糖尿病这些注射后,动物吸收intra-peritoneally剂量STZ 45毫克/公斤体重,直到糖尿病。动物被认为是糖尿病血糖高于18时更易与L。
2.4。测定血糖和尿分析
tail-capillary血液中血糖测量轮廓(拜耳糖尿病护理,国王,丹麦)。尿液被Combur检测葡萄糖和酮体5测试D(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。
2.5。为了考试而牺牲和样品
在研究结束时,尿液是单独在代谢笼收集和储存在−20°C到化验。在牺牲,动物是由腹腔麻醉剂量为0.5毫克/克体重氯胺酮和0.2毫克/克体重甲苯噻嗪(Ketaminol兽医Narcoxyl兽医,分别地。Intervet Skovlunde,丹麦)。Nonfasting血样在肝素化的毛细管retroorbital静脉丛,分离血清。血清样本存储在−20°C到分析。所有动物的肾脏,肝脏和心脏解剖和体重。波兰人和中间的合适的肾脏在液氮snap-frozen后来mRNA分析和储存在−80°C。左肾被固定在3%甲醛和1%戊二醛、削减1毫米厚片和2片被随机抽样。从这些两片,五个随机块area-sampled电子显微镜和嵌入在环氧树脂825,而其余的组织是嵌入在光学显微镜的石蜡。形态学方法如下所述。
2.6。测定尿白蛋白排泄(UAE)和肌酐清除率
白蛋白测定尿液收集的鼠标白蛋白ELISA量化工具包(TX Bethyl实验室,Inc .,蒙哥马利,美国)根据制造商的指示。肌酐的高效液相色谱测定如前所述[23]。
2.7。估算的肾小球体积
肾脏切片嵌入石蜡减少15μ米厚的部分在一个旋转切片机和周期性acid-Schiff染色。在这些章节中,盲估计的肾小球体积分数是由点计数(软件,奥林巴斯,哥本哈根,丹麦)。Glomerulus-to-kidney比率计算从这些估计基于50或更多的肾小球部分。
2.8。估算的肾小球基底膜厚度、系膜体积分数和总系膜
这些估计是由电子显微镜检查如前所述[20.]。总之,五个小块嵌入在环氧树脂825人削减超薄部分在RMC mt - 7000超微切片机(美国AZ Boeckeler仪器有限公司)。电子显微镜图像(CM10,菲利普斯、埃因霍温、荷兰)记录与柯达megaplus 1.6我数码相机应用多重象对齐系统到一个监视器。
2.9。定量rt - pcr
通过rt - pcr进行量化(如前所述)(20.]。总之,从肾皮质组织细胞总RNA提取6100核酸PrepStation(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。核糖体RNA的质量被琼脂糖凝胶估计。反转录的RNA, DNA进行Multiscribe逆转录酶工具包(应用生物系统公司)。一式三份的聚合酶链反应进行井中每个样本含有RNA, TaqMan通用引物PCR MasterMix及放大从应用生物系统公司购买。核糖体18岁被用来看家基因。肝RNA作为消极的控制。数据分析与ABI棱镜7000序列检测器的软件应用生物系统公司。目标基因的相对量化计算如用户公告2所述,1997年从优秀(美国优秀的鲸鱼座,诺沃克,CT) (24]。
2.10。统计分析
这项研究是设计成2 * 2因子试验,从而分析了双向方差分析允许交互。首先,我们测试如果糖尿病效果修改MBL(修改或影响交互)。如果发现糖尿病和MBL之间的交互,我们测试的假设两个非糖尿病患者组没有差异。只有我们可以接受没有相互作用的假设,我们可以测试的假设没有孤立的MBL和糖尿病的影响可以被发现。克鲁斯卡尔-沃利斯平等的人口等级测试,如果正常使用和等于方差不能通过转换这些数据因此不进行交互,孤立的MBL的效果,或糖尿病的效果。所有的rt - pcr测量被比较的自然对数转换比率,而不是差异。除非另有说明,所有的数据都表示为(95%置信区间),数量如上所述,除非其他数字。被认为是显著的。统计分析为Microsoft Windows 11.0占据。
3所示。结果
3.1。动物的特征
身体重量的动物展示在表1。最好的描述整体水平在整个研究中,糖尿病组比较评估血糖曲线下面积(天次葡萄糖浓度)。在这两种菌株,糖尿病动物血糖水平(表1)。血糖水平在表中列出的开始和结束1。
3.2。肾脏形态学
diabetes-induced肾脏肥大明显依赖于C57BL / 6 jbomtac动物(MBL糖尿病和MBL之间的相互作用,)。糖尿病诱导增加29%(15、45)大kidney-to-body WT动物的重量比(增加41%)相比,MBL-KO动物(增加9%)(图1(一))。Kidney-to-body重量比为11%(2;21)大nondiabetes WT动物与非糖尿病患者相比MBL-KO动物()。129年s6 / SvEvTac动物,没有发现相互作用,因此,我们继续测试一个孤立MBL-KO和WT动物和糖尿病之间的区别和控制动物(更多细节请参考方法部分)。因此,我们发现糖尿病动物kidney-to-body重量比超过了控制动物(59%(47个;72),)。MBL缺没有影响肾脏重量(图1 (b))。
(一)
(b)
MBL修改了diabetes-induced肾小球C57BL / 6 jbomtac扩大动物(图2(一个))。由于糖尿病、肾小球总额增加了40%(7;84)在WT动物相比MBL-KO动物()。没有差异的控制WT和控制MBL-KO组。129年s6 / SvEvTac动物没有互动,没有糖尿病的迹象出现变化,也没有任何后果的MBL基因敲除。基底膜厚度和mesangium-to-glomerulus体积分数没有组间差异在两个菌株(数据没有显示)。
(一)
(b)
3.3。阿联酋和肌酐清除率
diabetes-induced增加阿联酋没有修改MBL的压力。糖尿病C57BL / 6 jbomtac动物会增加3.0倍(1.8,5.0)与非糖尿病患者相比,阿联酋动物()(图3(一个))。糖尿病诱导增加8.9倍129年在阿联酋s6 / SvEvTac动物与非糖尿病患者相比,控制(4.6,17.4),。在这两个菌株没有MBL缺陷(图的效果3 (b))。
(一)
(b)
肌酐清除率没有C57BL / 6组间差异jbomtac动物(图4(一))。在129年s6 / SvEvTac动物,没有发现糖尿病和MBL之间effectmodication肌酐清除率和肌酐清除率没有改变在MBL-deficient动物或糖尿病(图4 (b))。
(一)
(b)
3.4。肾基因转录
基因转录参与糖尿病肾脏改变被rt - pcr(表测量2)。MBL并未与diabetes-induced交互变化检测基因转录。在这两种菌株,对僵化的生长因子的转录重要变化在糖尿病、调节转化生长因子β和结缔组织生长因子。矩阵的蛋白质的基因也转录水平上高于糖尿病(即。第四、纤连蛋白和胶原蛋白α1),而血管内皮生长因子a mRNA表达菌株表达下调。
结缔组织生长因子、纤连蛋白和血管内皮生长因子受体2转录表达下调MBL-KO动物与C57BL / 6 WT jbomtac动物。129年s6 / SvEvTac MBL-KO动物、转化生长因子的合成β第四,胶原蛋白α1,血管内皮生长因子受体2调节与WT动物相比。
4所示。讨论
在当前研究中因果MBL参与糖尿病肾病的发展关键特征变化。我们发现糖尿病肾脏和肾小球的增长明显修改MBL与先前的研究一致MBL-KO动物backcrossed只有六代(20.]。假设,MBL的作用是依赖小鼠的遗传背景。这表明一个重要基因易感性的差异决定MBL关于糖尿病肾病的发展。先前的研究糖尿病肾脏各种小鼠模型的变化特征,发现遗传背景的影响(25,26]。能够模仿人类糖尿病肾病不同模型之间的不同的特征(21]。因此,C57BL / 6 jbomtac STZ糖尿病动物,而且在某种程度上也在129年s6 / SvEvTac动物,模仿人类糖尿病肾脏结构的变化比功能交替在阿联酋25,26]。目前的报告中我们发现STZ糖尿病诱发肾脏改变菌株按照糖尿病肾病。模型局限性像糖尿病肾脏功能改变可能占无法找到MBL与diabetes-induced阿联酋升高,已在众多报道人类研究[15,17- - - - - -19,27,28]。在目前的研究中,还更高kidney-to-body重量比被发现在控制C57BL / 6 jbomtac MBL-KO动物相比,控制WT动物。不同的增长率相比,KO WT动物可能占其中的一部分。我们以前显示的趋势MBL修改diabetes-induced增加肾小球基底膜厚度和系膜卷(20.]。然而,这不能重复在目前的研究中,最有可能由于糖尿病持续时间更长、更与动物基因相似组backcrossed超过12代。Diabetes-induced肾功能变化的基因转录的关键介质被MBL在这个没有找到要修改的研究。确定的时间可能会影响这些测量的结果。我们发现一个降低血管内皮生长因子转录在鼠标菌株在糖尿病肾病的早期阶段。不同的报告已经发表在血管内皮生长因子水平。尽管大多数研究发现upregulation血管内皮生长因子,血管内皮生长因子的差别我们一贯发现对这些基因在STZ-diabetic小鼠糖尿病8到12周的时间(29日- - - - - -32]。不同样本网站和糖尿病持续时间可以解释这些观察。
关于对糖尿病肾病的易感性基因组成的重要性说明观测的双胞胎。Seaquist等人描述一个强大的协会之间的遗传组成和1型糖尿病终末期肾病的风险(13]。按照这个观察,发现MBL基因型与糖尿病肾病的风险,这可能解释部分的遗传倾向15,18]。Kaunisto仍然和他的同事没有找到相同的协会在芬兰的人口16]。
替代途径的推测MBL之间的交互和糖尿病肾脏改变是不可避免的。MBL绑定到人类细胞流式细胞术[所表明的那样33]。增加的证据补充攻击自身细胞在糖尿病环境报道,最近,MBL绑定糖化蛋白质和补充系统的启动已经证明(34]。补充监管功能障碍在糖尿病也被提出。Acosta等人,秦等人显示glycation-mediated抑制补体调节蛋白CD59作为生长因子在糖尿病的可能机制(35,36]。补体系统的不利影响从缺血再灌注损伤的研究,和抑制终端补体激活减少梗塞大小在实验设置(37]。最近,MBL在缺血再灌注损伤的一个关键的角色在不同的器官,包括心脏和肾脏,据报道(38,39]。在这些情况下,代neoepitopes在细胞缺血可能发起补体激活。在结论,本研究提出了数据说明的一个重要影响MBL在关键下游糖尿病肾病的标志。这种效应只有在两个研究中的一个品系小鼠观察表明遗传背景很重要。然而,考试在几个不同糖尿病持续时间应能够与对早期糖尿病肾病的影响在本研究观察到变化。通过测量肾脏基因表达,我们也发现这些变化的经典上游介质受MBL-KO影响。在多大程度上这是由于无法测量肾脏疾病发展的基因表达在正确的时间尚不清楚。另外,存在未被发现的通路连接补充和糖尿病肾病是可能的。新研究应该探索这个明显的MBL与糖尿病血管并发症之间的联系。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
j . a .Østergaard贡献的设计和开展研究,数据收集和分析、数据解释和论文写作,修改,并最终批准。m . Bjerre t·k·汉森s泰尔和a . Flyvbjerg设计和数据解读,论文修改并最终批准。j . r . Nyengaard SP, RamachandraRao k Sharma贡献与数据分析,论文修改,并最终批准。
确认
作者非常感谢捐赠MBL double-KO老鼠从卡组高桥,美国波士顿。拉希露丝的帮助解释电子显微镜图像的肾小球和技术援助凯伦Mathiassen和克里斯汀•Nyborg是感谢。卡琳Ørbæk Kristensen感谢论文的语言版本。这项工作是在丹麦医学研究委员会的支持下,伊娃和亨利Frænkel纪念基金会,丹麦糖尿病协会,临床医学研究所,健康,丹麦奥尔胡斯大学。支持随机几何中心和先进Bioimaging Villum基础。