文摘

的目标是。细胞转录治疗糖尿病的目标是生成代理β肽从一个适当的细胞系。然而,诱导替代细胞表现出更少的生理功能与正常相比生产胰岛素β肽。方法。在这里,我们报告一个过程诱导胰岛素生产细胞(ipc)从小鼠骨髓间充质干细胞(BM-mMSCs)。这些BM-mMSCs有可能分化成胰岛素生产细胞时的组合PDX-1(胰腺和十二指肠homeobox-1), NeuroD1(神经性differentiation-1)和MafA (V-maf肌肉筋膜纤维肉瘤癌基因同族体a)基因转染到他们,这些细胞中表达。结果。胰岛素合成和分泌在mMSCs诱导,这三个基因转染和表达。mMSCs诱导胰岛素的量已被转染的三个基因在一起明显高于那些mMSCs只有这三个基因的转染与一个或两个。转染细胞的移植到小鼠体外实验的逆转糖尿病导致胰岛素表达和葡萄糖的挑战。结论。这些结果表明细胞替换策略的主要影响一代的代理β肽用于治疗糖尿病。

1。介绍

1型糖尿病的特点是胰岛素绝对缺乏T-cell-mediated破坏引起的胰腺β肽。β细胞替代治疗1型糖尿病是一种很有前途的方法。胰岛细胞替换已被视为潜在的治疗糖尿病过去三十年。然而,这种治疗方法是限制短缺对小岛的胰腺捐赠者和免疫排斥反应。最近,获得胰岛素生产代理的方法β从非肽β肽通过诱导或基因工程研究,支持一个新的在1型糖尿病治疗(1- - - - - -4]。

转录因子控制生物过程如分化、增殖和凋亡。它们绑定到特定区域内的顺序启动子或增强剂和激活特殊基因的表达。据报道,许多转录因子参与了胰腺β肽的发展和功能维护(5]。据报道,PDX-1, NeuroD1 MafA直接绑定到胰岛素基因启动子和促进胰岛素mRNA转录和维护β在胰腺癌细胞功能β细胞分化。进一步的研究还表明,这三个基因的转录和蛋白质合成三个产品是至关重要的葡萄糖调节胰岛素生产(6]。但是否协同效应可能引起高胰岛素表达,促进非β肽进一步分化成β肽在体内或体外仍需要进一步研究。

最近,msc被选为靶细胞移植,因为他们能够分化成多种细胞类型(7,8),他们逃避宿主的免疫系统的检测能力(9),相对轻松地扩大这些细胞在细胞培养(9]。在我们的研究中,这三个转录因子的结合,发挥着至关重要的作用在葡萄糖诱导的胰岛素基因转录和胰腺β细胞功能,被交付到mMSCs运载体。感染后,细胞培养与表皮生长因子(EGF)在定义条件下促进分化转移和有一个活跃的内源性胰岛素的基因。

有一些研究结果证明在培养的msc诱导功能变更的可行性通过一个主胰调节基因的表达(10,11]。在前面的研究中,我们已经成功地生成从骨髓msc IPCs引入人类胰岛素基因(12]。转染后细胞注射到小鼠的肝脏与糖尿病,我们发现高血糖小鼠的糖尿病患者可以逆转有效(13]。然而,移植的细胞显示弱葡萄糖响应性和不成熟。还有相当差距诱导胰岛细胞和正常β肽。最近的工作在诱导多能干细胞(iPS细胞)和诱导神经元形成表明一个特定组合多个转录因子,而不是一个足以直接重组成人细胞(14,15]。许多转录因子的过程中扮演很重要的角色β细胞分化,在某种程度上其他基因是负责维护β细胞的功能。在目前的研究中,结合PDX-1, NeuroD1, MafA明显诱发胰岛素合成和分泌mMSCs,因此这是一个新颖的方法诱导胰岛素生产代理β肽有效地用于移植。

2。材料和方法

2.1。建筑嵌目标基因的重组腺病毒载体

老鼠的基因转录因子PDX-1, NeuroD1, MafA(基因ID: 18609、18012、378435)获得了总合成基因合成和基因测序验证是正确的。PDX-1的编码序列,NeuroD1 MafA被放大和结扎与内部核糖体进入网站sequence-green PCR荧光蛋白(IRES-GFP),然后克隆成穿梭载体pDONR221 BP clonase II酶混合(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。corrcet重组质粒被克隆到垫/巨细胞病毒/ V5-DEST运载体(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) LR clonase II酶混合(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。进行了电泳分析和DNA测序确定重组向量。

2.2。腺病毒生产

细胞计数后,包装细胞系293在对数生长阶段是孵化6-well培养板在37°C, 5%的公司₂转染的前一天。重组腺病毒的序列向量pAd-Mouse PDX-1-IRES-GFP, pAd-Mouse NeuroD1-IRES-GFP和pAd-Mouse MafA-IRES-GFP经基因测序和线性化Pac我然后转染腺病毒包装细胞系293使用Lipofectamine2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。转染后48小时,细胞分离和转移到培养皿中。新鲜营养培养基添加每两或三天。supernants正收集从293年一个细胞时,大多数的细胞表现出明显的细胞病变效应(CPE)。主腺病毒后收获supernants冻融的3倍。主要使用了腺病毒感染293 10厘米培养皿的细胞腺病毒集中。最后集中腺病毒被储存在−80°C。控制腺病毒表达绿色荧光蛋白(Ad-GFP)制备了上述方法。腺病毒是由免疫效价的方法,如下:hek - 293细胞被感染腺病毒在不同浓度的反应与兔子antiadenovirus多克隆抗体(1:1000)为额外的1小时,然后被孵化与辣根过氧化物酶标记抗体anti-rabbit 1小时。 After 3,3′-diaminobenzidine (DAB) staining, the titer of the adenovirus was calculated in terms of the number of brown particles formed in different dilutions.

2.3。细胞培养

从小鼠骨髓mMSCs丰富和扩大使用整个骨髓体外依从性方法根据我们实验室以前的协议发表(13),用细微的修改(16]。简单地说,两个月大的雄性C57BL / 6 j小鼠被牺牲,在75%乙醇浸泡3分钟。股骨和胫骨解剖远离连接肌肉和结缔组织,之后骨头被安置在磷酸缓冲盐(PBS)冰。的每个胫骨和股骨的两端剪,然后挤压了骨髓21-gauge针插入轴的骨头和冲洗液冲洗。冲洗液由PBS (PH值7.2),2%胎牛血清(的边后卫;美国GIBCO BRL,马里兰州)和1毫米乙二胺四乙酸(EDTA)。骨髓细胞收集离心分离作用和resuspended杜尔贝科了鹰的中/火腿的营养混合物F-12 (DMEM / F12;美国HyClone,洛根,UT)补充10%的边后卫,100单位/毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升,2毫米谷酰胺(σ化学公司,圣路易斯,密苏里州,美国)和10 ng / mL的人类基本成纤维细胞生长因子(bFGF;ProSpec-Tany TechnoGene以色列Rehovot)促进细胞增殖。细胞被镀在25厘米²培养瓶(美国纽约康宁企业,康宁)和孵化37°C和5%湿润有限公司₂。72 h后被移除,不依从细胞和贴壁细胞和PBS彻底清洗两次。融合细胞增长80%和胰蛋白酶处理0.25% - 0.02% EDTA(σ化学公司,圣路易斯,密苏里州,美国)5分钟在37°C比1:2在每个通道。流式细胞术进行mMSCs immunophenotype分析。mMSCs在通道3使胰蛋白酶化和PBS洗了三次,然后下面的标记抗体的细胞被孵化:CD14、CD29、CD34、CD45和CD105, CD44。标记细胞分析在FACSort石中剑(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。确认multipotency mMSCs, mMSCs通道3在成骨的孵化或脂肪形成的分化培养基21天,其次是与碱性磷酸酶或油红染色,分别,如前所述17]。

2.4。我决心和细胞的感染

细胞被收集到一个高度增殖mMSC文化通道3和镀到96年文化板块在同一密度。第二天细胞被感染新鲜收获Ad-GFP在不同感染复数(MOI)从5到5000年中含有2%的边后卫和孵化24 h。感染效率是由荧光显微镜三天后,和毒性是由细胞计数Kit-8 (CCK-8;Dojindo分子技术,Inc .,熊本、日本)。10 uL CCK-8解决方案添加到每一个根据制造商的指示设备,其次是孵化在37°C和5%湿润有限公司₂为2小时。感染细胞的吸光度测量标。确定了最优莫伊从感染效率和毒性。Ad-Mouse PDX-1-IRES-GFP, Ad-Mouse NeuroD1-IRES-GFP和Ad-Mouse MafA-IRES-GFP准备,然后mMSCs感染了病毒包含三个因素的最佳莫伊。每个腺病毒都有相同的贡献最优莫伊,单一基因传递和双重感染也执行。第二天细胞转分化中补充EGF。接下来的几天的反复感染。这些细胞被感染Ad-GFP作为控制。

2.5。逆转录聚合酶链反应

细胞总RNA分离使用MicroElute总RNA工具包(美国GAωBIO-TEK)根据制造商的指示。用分光光度计量化后,2μg的RNA用于互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA RevertAid TM合成装备(Fermentas DNA国际,伯灵顿,加拿大)。使用20聚合反应进行μ包含1 L反应体积μL的cDNA、寡核苷酸引物如下:PDX-1(330个基点),5′-TGAAATCCACCAAAGCTCACGC-3′(正向引物)和5′-CCGAGGTCACCGCACAATCT-3′(反向引物);NeuroD1(494个基点),5′-GAGGAACACGAGGCAGACAAG-3′(正向引物)和5′-AAGAAAGTCCGAGGGTTGAGC-3′(反向引物);MafA(402个基点),5′-CCATCATCACTCTGCCCACCAT-3′(正向引物)和5′-CCCGCCAACTTCTCGTATTTCT-3′(反向引物);insulin1(327个基点),5′-CTATAAAGCTGGTGGGCATCC-3′(正向引物)和5′-AACGCCAAGGTCTGAAGGTC-3′(反向引物);insulin2(368个基点),5′-AGCCTATCTTCCAGGTTATTGTTTC-3′(正向引物)和5′-GGTGGGTCTAGTTGCAGTAGTTCTC-3′(反向引物);β肌动蛋白(517个基点),5′-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3′(正向引物)和5′-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3′(反向引物)。放大条件包括初始变性在94°C 10分钟,其次是35周期为30秒94°C的变性,退火30秒的61°C和扩展在72°C,持续30秒,最后一个扩展步骤10分钟的72°C。

2.6。免疫荧光分析

培养后21天,感染细胞被播种在玻片上12-well文化板块和固定在4%多聚甲醛在PBS。Permeabilizing和阻止了10%胎牛血清,3%牛血清白蛋白,0.2% triton x - 100在PBS。然后主要抗体的细胞被孵化(兔多克隆抗体anti-mouse胰岛素1:50;圣克鲁斯生物技术、钙、美国)一夜之间在4°C。对于胰岛素染色,细胞进一步孵化2 h在黑暗中在室温下,用二次抗体(Cy3 anti-rabbit 1: 50;Proteintech集团、美国芝加哥,IL)。赫斯特染色后额外的15分钟,幻灯片是湿洗并在显微镜下检查。使用一个奥林巴斯相差荧光显微镜图像捕获(奥林巴斯公司(日本东京)。

2.7。胰岛素分泌试验

受感染的细胞或未感染细胞与Krebs-Ringer preincubated缓冲区(KRB) 1 h,其次是孵化为一个额外的1 h KRB包含10.0毫米葡萄糖。缓冲区是收集和冻结在−80°C到化验。胰岛素酶联免疫吸附试验(ELISA);Cusabio生物科技有限公司、武汉、湖北,中国)用于胰岛素水平的定量测定收集缓冲区根据制造商的协议。所有值测定与标准曲线用鼠标胰岛素。

2.8。建立糖尿病模型和细胞移植

建立糖尿病小鼠模型,成人C57BL / 6 j小鼠腹腔注射链脲霉素(STZ);σ化学公司,圣路易斯密苏里州,美国)的剂量160毫克/公斤。高血糖症是由政府的剂量STZ 7天内。血糖达到水平> 16.7更易与L和保持高血糖至少2周。细胞移植的同时做好了准备。转录因子PDX-1、NeuroD1 MafA被交付到mMSCs移植前3天。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉在50毫克/公斤,紧随其后的是腹部切口。1 - 2×10⁶感染细胞或未受感染的细胞悬浮在0.2毫升PBS移植到小鼠的肝实质与糖尿病。葡萄糖耐量试验,小鼠腹腔注射葡萄糖每公斤体重的2.0 g在一夜之间迅速。血糖监测在指定的时间点(0 - 120分钟)样本中获得的小鼠尾静脉用招牌式II便携式血糖监测仪(Lifescan Inc .)、苗必达、钙、美国)。移植后小鼠牺牲了两周。见证IPCs的生存和检测三重感染的胰岛素分泌细胞在肝脏组织,10%福尔马林的肝脏被移除和固定。48小时后他们切成连续部分通过免疫组织化学方法和分析。消极的控制也成立。mMSCs感染Ad-GFP或mMSCs没有任何感染控制被移植到肝脏。终端原位biotinylated-dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定使用原位细胞死亡也是执行检测装备,荧光(罗氏应用科学,曼海姆,德国)确定注射细胞凋亡。的肝脏被立即冻结组织部分。 Frozen tissue sections were rinsed with PBS and treated with 1% Triton X-100 in PBS for 2 min on ice. Slides were rinsed in PBS and incubated for 60 min at 37°C with 50 μL (TUNEL反应混合物。洗后用PBS、幻灯片和荧光显微镜进行了分析。

3所示。结果

3.1。腺病毒窝藏PDX-1, NeuroD1或MafA

合成重组腺病毒的序列,编码PDX-1, NeuroD1, MafA,和GFP基因测序证实与Pac限制性内切核酸酶消解时即Pac-I-digested运载体转染入293细胞系生产原油adenoviral股票和293年扩大了腺病毒感染细胞。各种各样的细胞可以感染腺病毒。

3.2。推导以及mMSCs体外的表征

独立的细胞从骨髓样本通过介质的变化,为传播和附着mMSCs培养。随后使之后,大部分的贴壁细胞表现出相当一致的外观。Immunophenotypes细胞通道3被流式细胞术分析化验。大多数的细胞表达高水平的CD29、CD44、和CD105。与此同时,标记CD14、CD34、CD45显示极低的表达式。mMSCs在成骨的孵化和脂肪形成的分化中识别multipotency字符显示成骨分化和脂肪形成的分化后21天(图1)。这些结果表明,培养细胞的未分化状态和区别haemopoietic干细胞。

3.3。优化mMSCs的莫伊

不同类型的细胞腺病毒的易感性是变量和细胞类型之间的显著不同。实现最优感染腺病毒,我们选择最优莫伊提高感染效率,还同时mMSCs最少的细胞毒性。结果表明,感染效率改进不断提高莫伊。当细胞被感染新鲜腺病毒在100年莫伊,感染效率超过80%。当细胞被新鲜的腺病毒感染的莫伊超过2400人,感染率几乎是100%。另一方面,细胞生存成为显著抑制与莫伊值增加到600。生存曲线表明,生活感染细胞的数量明显减少当莫伊值大于600(图2)。从上面,我们得出这样的结论:感染细胞的莫伊600是最优选择。包含三个因素的细胞被病毒感染的莫伊600。mMSCs感染了不同单一的重组腺病毒,分别在莫伊200。mMSCs感染了病毒含有两种因素在莫伊400。受感染的细胞在形态和成为一轮发出惊人明亮的绿色荧光在感染后3天。

3.4。结合PDX-1、NeuroD1 MafA诱发IPCs从mMSCs明显体外

确定内生胰岛素基因转录开始,外生转录因子和胰岛素基因的基因表达谱进行评估通过rt - pcr。如图3胰岛素基因和转录因子基因表达在mMSCs,感染了相应的转录因子。结合三个因素的影响更深远的与其他组相比。因此,insulin1和insulin2 mRNA表达mMSCs三重感染也远远大于其他组(图4)。相比之下,mMSCs感染Ad-GFP或null,处理相同的文化条件表示没有可检测水平的胰岛素基因或转录因子的基因。值得注意,PDX-1转录和NeuroD1可以相互激活,和外生MafA可能引发mMSCs内生PDX-1的表达。

感染后,确定胰岛素的生物合成和蛋白质含量测定胰岛素表达,免疫荧光分析的差异化mMSCs被记录。幻灯片上的所有细胞都孵化anti-mouse胰岛素,然后红色荧光显然是可视化在细胞核和细胞质后感染(图三倍5)。细胞核被染蓝了。赫斯特染料。红色的积极反应后也观察到单因素感染或感染的两个因素。相比之下,培养细胞感染Ad-GFP或空负了胰岛素。

进一步确定的功能分化mMSCs的胰岛素分泌,胰岛素释放的细胞的数量在体外显示浓度的葡萄糖测定使用鼠标胰岛素酶联免疫试剂盒。如图6,结果表明,胰岛素内容的差异化mMSCs感染组合的三个转录因子显著高于其他组()。此外,没有发现胰岛素释放缓冲区添加到细胞感染Ad-GFP或null。

3.5。函数体内诱导胰岛素生产细胞的识别

需要进一步确定诱导IPCs充分发挥正常的生理功能β胰岛细胞,mMSCs表达PDX-1、NeuroD1, MafA被移植到小鼠的肝脏STZ-induced糖尿病。mMSCs感染Ad-GFP或没有任何感染控制被移植到肝脏。首先,我们研究了胰岛素蛋白表达和细胞凋亡在肝脏的组织。胰岛素的内容中没有检测到治疗组小鼠的肝脏有mMSCs没有感染但确实明显发现治疗后与mMSCs表示PDX-1、NeuroD1, MafA(图7)。TUNEL immunofluorescent染色的-在注射细胞(图8),这表明,他们从未经历过双链DNA断裂与细胞凋亡有关。此外,胰岛素蛋白表达显著减少后1个月,2个月后无法察觉。此外,评估胰岛素控制血糖水平的贡献由道产生细胞,进行葡萄糖耐量试验后7 - 14天移植。如图9,结果表明mMSCs表达PDX-1、NeuroD1,葡萄糖和MafA能够应对的挑战,以及他们的反应几乎是接近正常β胰岛细胞移植后7天。值得注意的是,相同或更好的效果并不是引发了7天。这可能是由于不稳定和瞬态转基因表达的细胞,加上诱导细胞未能实现自我复制。在血糖水平没有差异之间的任何时间点老鼠STZ-induced糖尿病患者植入器是非移植性。的正常mMSCs和

4所示。讨论

近年来,细胞移植已成为一个研究热点有关手术治疗糖尿病的方法。为了获得代理β肽,transdifferentiated靶细胞,分化肉瘤或代理β肽在通常的表达一些关键转录因子参与胰腺和发展β细胞基因表达(18,19]。在这项研究中,我们报告一个程序交付PDX-1、NeuroD1, MafA mMSCs运载体及其分化成IPCs体外或体内。我们的结果表明,骨髓间充质干细胞诱导定向分化成ipc的只是三个关键转录因子的结合。过度的PDX-1 NeuroD1, MafA显著调节胰岛素基因的表达也在mMSCs诱导胰岛素合成和分泌。三重感染相比有更强的影响与任何单引号或双感染。

的β胰岛细胞的能力是独一无二的生产、过程,并分泌大量的胰岛素以严格管制的方式以应对不断不同浓度的葡萄糖(20.]。的开发过程和功能维护β肽几个转录因子组成的网络监管的需求。

先前的研究已经表明,稳定的表达PDX-1在成年人中胚层组织激活表达所有四个胰岛激素包括胰岛素和扭转体内高血糖,但更多的因素,刺激细胞进一步分化正常β需要的肽(10]。在我们的研究中,任何两个因素的单因素和组合能够诱导的胰岛素的表达,但mMSCs太弱的效应引起相对于这三个因素的特定组合。显然不足以驱动分化mMSCs很长一段路的方向β的肽或IPCs治疗糖尿病。一定不容小觑的事实是,所有三个转录因子是绑定到A3, E1和C1网站在340年英国石油公司上游启动子区域的胰岛素基因的转录起始点(21- - - - - -25]。相比之下或进一步的研究,我们开发了我们的体内实验诱导IPCs将驻留在本地环境,可能会提升他们的生存和成熟。肝脏和胰腺之间的同源特征已经显示在许多动物样本(26),移植实验和体外分化实验(27),除了那的主要器官是肝脏胰岛素功能,我们认为ipc的肝组织是一种理想的微环境生存和功能。进一步的工作将是探索如果额外因素和机制所必需的特定组合的行为因素。

在基因检测的实验,遗传转化PDX-1激活的表达内生NeuroD1由外生和内生PDX-1可以激活NeuroD1或MafA。实验结果表明,调整或每个转录因子之间的相互作用可能真的存在。然而,PDX-1 MafA和内生NeuroD1无法产生强大影响胰岛素基因的表达作为交付三个转录因子的结合。我们假设好合作不能实现由于低表达水平的诱导因素。

细胞内的GFP mMSCs随后启动基因表达在3天后交货,接近的因素。然而,一个星期后,荧光强度的下降部分线粒体DNA的降解。因此,诱导效率显著抑制没有重复感染。在肝实质细胞移植是为了进一步验证体内诱导ipc的功能。腹腔内注射和高碳水化合物喂养都是葡萄糖耐量试验的方法研究人员推荐的。相对,腹腔内注射小鼠和更准确的方式也简单的执行。IPGTT结果证明了这些植入细胞处理葡萄糖的能力负荷,和葡萄糖耐量接近正常小鼠。然而,应该指出的是,葡萄糖耐量被发现后,另一个7天。可能的情况下植入诱导IPCs未能扩散。mMSCs策略,使稳定表达的因素可能有助于评估治疗的长期效果。

骨髓间充质干细胞多向分化潜能著称,相对容易获得。他们能够被修改开发表观遗传变化,是由一系列控制几个不同的相关基因,然后分化成功能性β肽。

总之,我们的研究结果表明,遗传操作产生感染的组合PDX-1 NeuroD1,后面的表达式和MafA及其显著提升胰岛素生产mMSCs的函数。虽然做了大量工作,但代代理相关的有效的方法β肽治疗糖尿病还没有获得。尽管如此,我们将进一步确定mMSCs表示的分化组合体内的三因素及其稳定的长期表达维持严格的血糖水平。

承认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81070654)。